全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1137
刺五加腋芽培养中抗褐化初探
孙周平 *, 褚丽敏
沈阳农业大学园艺学院辽宁省设施园艺重点实验室, 沈阳 110161
提要: 研究刺五加腋芽分化生长过程中褐化现象的结果表明, 以75%的酒精消毒40 s, 0.1%的升汞灭菌8 min能较好地抑制
褐化现象; 1 000 mg·L-1 维生素 C的抑制作用较为明显; WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA培养基的褐化现象最轻; 15
mg·L-1蔗糖、5 d 暗处理和15 d转瓶一次都能在一定程度上抑制褐化。
关键词: 刺五加; 腋芽; 组织培养; 褐化
The Preliminary Study on Browning Control in Tissue Culture of
Eleutherococcus senticosus Maxim. Axillary Buds
SUN Zhou-Ping*, CHU Li-Min
Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province, College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang
110161, China
Abstract: Using axillary bud explants, we studied the browning control in tissue culture of Eleutherococcus
senticosus. The results showed that the browning could be obviously inhibited by the treatments with 75%
alcohol 40 s and 0.1% HgCl2 8 min. The supplying of 1 000 mg·L-1 vitamin C could prevent the browning.
WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA in medium had little effects on the inhibition of browning. The treat-
ments with 15 mg·L-1 sugar, 5 d dark culture and 15 d transferring culture bottle could inhibit browning to some
extent.
Key words: Eleutherococcus senticosus; axillary bud; tissue culture; browning
收稿 2008-07-14 修定 2008-11-03
资助 辽宁省 “十一五 ”重大项目(2006215001)和辽宁省教育
厅创新团队项目(2 0 0 7T 1 5 9 )。
* E-mail: sunzp@syau.edu.cn; Tel: 024-88487231
刺五加的商品名为五加参, 是我国医药珍品,
根、茎、叶均可人药。主要分布在我国黑龙江、
吉林、辽宁、河北和山西等地, 在前苏联、朝鲜
和日本也有分布。由于长期过量采掘, 严重地破坏
了刺五加资源(祝宁等 1998)。刺五加已列为濒危
物种, 植物组织培养对于解决刺五加种苗的大量扩
繁, 促进刺五加资源稳定和有效利用具有重要意
义。因此, 近年来, 刺五加组织培养的研究得到了
重视。目前, 以刺五加的叶片、茎尖和根为外植
体进行的组织培养已有成功的报道(张喜春等1996;
张健夫 2004; 贝丽霞等 2005; 梁建萍 2005)。刺五
加作为木本植物, 其组织培养中褐化现象较为严重,
常导致组培苗褐化死亡。但目前还未见对此问题
的系统研究与报道。为此, 本文以刺五加腋芽为外
植体, 对其分化生长过程中的褐化现象进行研究, 以
探讨控制褐化问题的有效途径, 建立高效的芽再生
体系。
材料与方法
选取野生刺五加(Eleutherococcus senticosus
Maxim.)当年形成的越冬枝条, 室内培养至刚刚萌
发。
将萌发的枝条切取含腋芽的 3~4 cm茎段, 在
含 0.02%洗洁精的自来水中摇动浸泡10 min, 自来
水冲洗3~4 h, 然后转移到超净工作台上, 用镊子剥
去包裹在外植体外部的芽鳞片, 取其生长点用75%
的酒精和 0.1%的升汞进行消毒。其消毒时间采用
随机设计(表1)。无菌水冲洗5~6次后接种到WPM
培养基中。经过表面灭菌处理的腋芽, 用不同浓度
的维生素C浸泡30 min后, 转入WPM、MS、White
3种基本培养基中, 并加入不同浓度的 6-BA (0.5、
1.0、1.5 mg·L-1)和 NAA (0.05、0.1、0.15 mg·L-1)
进行无菌苗培养。采用 L9 (34)正交设计(表 2), 每
个处理 20瓶, 每瓶 1个外植体。
采用DPS软件进行数据处理。污染率(%)=污
染的外植体数 /接种的外植体总数 ×100%; 褐化率
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(%)=褐化的外植体数 /接种的外植体总数×100%;
萌发率(%)=萌发叶片的外植体数 /(接种的外植体
总数- 污染的外植体数)×100%。
结果与讨论
1 消毒时间对腋芽褐化的影响
由表 1可以看出, 消毒时间太短, 则褐化较轻,
污染较重; 消毒时间过长, 则污染率降低, 但褐化率
却明显升高。说明延长消毒时间可能对外植体产
生毒害作用, 以致加深褐化程度。其适宜的消毒组
合为: 75%的酒精浸泡40 s, 0.1%的升汞消毒8 min,
污染率和褐化率都相对较低。
理, 说明 1 000 mg·L-1维生素 C是防止腋芽褐化的
适宜浓度。
3 不同基本培养基和不同浓度生长调节物质对腋
芽褐化的影响
表 3为不同基本培养基和不同浓度生长调节
物质对刺五加芽诱导的 L9 (34)正交试验结果。从
表中可以看出, MS培养基褐化较重, WPM培养基
褐化较轻, 其中以WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
NAA 组合的培养基效果最好, 褐变得到一定控制,
茎尖生长也较好。原因可能在于无机盐浓度过高,
致使酚类物质大量产生, 引起细胞褐变, 因此, 降低
盐浓度则可以减少酚类外溢, 从而减轻褐变(梅兴国
等 2001)。这种现象在黑松、苹果、桑树等的微
繁中也有类似的报道(王明华等1995; 高国训1999;
高蓉和赵博光 2001; 邱璐等 2000)。
4 蔗糖对腋芽褐化的影响
从表4可见, 蔗糖浓度过高或者过低都会加大
褐变, 而浓度为 15 mg·L-1时, 效果最好, 褐化率较
低(8% )。
5 暗培养时间对腋芽褐化的影响
由图 1可以看出, 随着暗培养时间的延长, 褐
化率随之降低, 而萌发率先升高后降低。其中最适
表 1 不同消毒剂和消毒时间的组合对腋芽褐化的影响
Table 1 Effects of different disinfectant and sterilizing
time on axillary buds browning
消毒方法 外植体数 /个 污染率 /% 褐化率 /%
酒精消毒 30 s, 升汞消毒 7 min 2 5 5 2 1 6
酒精消毒 30 s, 升汞消毒 8 min 2 5 3 2 2 0
酒精消毒 30 s, 升汞消毒 9 min 2 5 1 6 3 2
酒精消毒 40 s, 升汞消毒 7 min 2 5 1 2 2 0
酒精消毒 40 s, 升汞消毒 8 min 2 5 8 2 0
酒精消毒 40 s, 升汞消毒 9 min 2 5 8 4 8
酒精消毒 50 s, 升汞消毒 7 min 2 5 8 3 2
酒精消毒 50 s, 升汞消毒 8 min 2 5 4 5 2
酒精消毒 50 s, 升汞消毒 9 min 2 5 4 6 0
2 维生素C对腋芽褐化的影响
由表 2可以看出, 随着维生素 C浓度增加, 腋
芽褐化率呈现先降低, 后升高的特点, 其中维生素
C浓度为 1 000 mg·L-1 时的抗褐化效果最好, 褐化
率仅为 10%, 明显低于 0和 500 mg·L-1维生素 C处
表 3 刺五加芽诱导的 L9 (34)正交试验结果
Table 3 The results of L9 (34) orthogonal experiment of adventitious shoot induction in E. senticosus
处理 萌发率 /% 褐化率 /% 褐化程度及长势
WPM+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA 83.3 1 0 组培苗叶片周围出现局部的褐色点状现象, 植株颜色正常
WPM+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 90.0 1 0 个别组培苗基部有少量丝絮状物产生, 苗较粗壮, 叶大而浓绿
WPM+1.5 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA 70.0 2 0 出现浑浊絮状物, 苗矮小, 叶卷曲, 生长缓慢
MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 62.5 2 5 有丝状物产生, 茎尖、茎部变暗, 苗细弱, 叶色淡绿
MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA 60.0 4 0 茎基部有脓状物溢出, 逐渐溃烂, 生长迟缓, 随褐变加重而死亡
MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA 40.0 6 0 出现棕褐色絮状物, 培养基一半已变色, 植株开始变黑
White+0.5 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA 84.2 5 有较轻的浑浊表现, 叶片颜色较浅
White+1.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA 76.5 1 0 个别茎段出现褐色点状现象, 苗细弱, 叶色淡绿
White+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 70.0 1 5 出现浅灰色絮状物, 茎尖变色, 苗矮小, 叶卷曲
表 2 不同浓度维生素C对腋芽褐化的影响
Table 2 Effects of different concentrations of vitamin C
on the axillary buds browning
维生素 C浓度 /mg·L-1 接种数 /个 褐化率 /%
0 2 0 3 0
500 2 0 2 0
1 000 2 0 1 0
1 500 2 0 1 5
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宜的暗培养时间为 5 d, 萌发率可达 93.3%, 褐化率
降至 6.7%。但长时间的暗培养会阻碍不定芽的产
生。
6 转种周期对腋芽褐化的影响
从表 5可知, 转接周期为 15 d的褐化率要明
显低于 25和 35 d的。其原因可能与腋芽伤口周
围积累酚类物质的多少有关(晏本菊和李焕秀1998;
刘兰英 2002)。可见, 合适的转种周期也是一种减
轻褐变的方法。
表 4 不同浓度的蔗糖对腋芽褐化的影响
Table 4 Effects of different concentrations of sugar
on the axillary buds browning
蔗糖浓度 /mg·L-1 接种数 /个 褐化率 /%
1 0 2 0 1 5
1 5 2 0 1 0
2 0 2 0 2 0
2 5 2 0 3 0
参考文献
贝丽霞, 陈祥梅, 赵海红(2005). 药用植物刺五加组织培养关键技
术的研究. 中国农学通报, 21 (6): 91~93
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北京农业大学出版社
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学报, 14 (4): 73~75
张喜春, 刘宏伟, 张弘, 张无弼(1996). 影响刺五加茎尖培养的因
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祝宁, 卓丽环, 臧润国(1998). 刺五加(Eleutherococcus senticosus)
会成为濒危种吗? 生物多样性, 6 (4): 253~259
表 5 不同转种周期对腋芽褐化的影响
Table 5 Effects of different transferring culture periods
on the axillary buds browning
转种周 外植体 褐化率 / 再生芽长势
期 /d 数 /个 %
1 5 2 5 4 长势好, 芽色泽正常, 培养基无浑浊物产生
2 5 2 5 2 4 芽色泽暗淡, 培养基有丝状或浑浊物产生
3 5 2 5 4 0 生长缓慢, 芽色泽暗灰, 培养基较为浑浊
图 1 不同时间的暗培养对腋芽褐化的影响
Fig.1 Effects of different dark periods on
the axillary buds browning