全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 181
桃品种‘八月香’花粉的超低温保存
宋尚伟*，闫锋，蔡艳婷，苗红霞
河南农业大学林学园艺学院，郑州450002
Cryopreservation of Pollen of ‘Bayuexiang’ Peach (Prunus persica L.)
SONG Shang-Wei*, YAN Feng, CAI Yan-Ting, MIAO Hong-Xia
College of Forestry and Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
提要：桃品种‘八月香’的花粉经 4 ℃硅胶干燥 8 h 或(20±1) ℃下玻璃化液 PVS4 (35% 甘油 +20% 乙二醇 +0.6 mol·L-1 蔗
糖)处理 60 min 后直接投入液氮保存，解冻后的萌发率都可以达到 70% 以上，萌发率与保存时间长短无关。
关键词：花粉；干燥法；玻璃化法；超低温保存；桃
收稿 2006-10-23 修定 　2006-12-31
资助 河南省高校青年骨干教师资助计划(20020620)和河南省
沙薄地综合治理科技专项(20040526)。
*E-mail：songshw@sina.com；Tel：0371-63554959
超低温保存技术是目前长期稳定保存植物种
质资源中较为理想的方法，它是指在超低温(通常
指液氮温度，-196 ℃)条件下，细胞的全部代谢
活动近于完全停止，因而可以保持种质的遗传稳
定性，达到长期保存的目的。自 1973 年 Nag 和
Street首次在液氮中成功保存胡萝卜悬浮细胞以
来，植物种质资源超低温保存已取得了突破性进
展，许多植物材料如原生质体、愈伤组织、体
细胞胚、胚、茎尖分生组织、芽、花粉等植物
组织和器官采用超低温保存都取得成功(吴雪梅和
汤浩茹 2005)。植物花粉具有体量小、携带方便
的特点，花粉用超低温保存技术可以不破坏种质
资源，是种质资源保存的必要补充(王越和刘燕
2006)。随着花粉单倍体育种、花粉遗传转化等
工作的开展，对花粉保存的研究愈加受到重视。
目前，已有柿和枇杷等10余种果树花粉采用超低
温保存技术取得成功(艾鹏飞和罗正荣2004；王家
福等2004)，但对桃花粉玻璃化法超低温保存的研
究尚未见报道。本实验对桃品种‘八月香’的
花粉进行了超低温保存研究，以期能为桃花粉的
种质保存，进而为花粉培养、遗传转化和杂交育
种研究提供参考。
材料与方法
材料来源于本校桃品种试验园，于晴天上午
采集生长健壮的桃(Prunus persica L.)品种‘八月
香’的成熟花粉，带回室内。用镊子摘除花药，
平摊于硫酸纸上，室温下自然晾干20 h，收集散
出的花粉，双层塑料薄膜包裹，置于4 ℃冰箱中
贮藏备用。花粉保存方法有以下 2 种。
(1)干燥法保存。于 4 ℃条件下，将花粉等
量放入 2 mL 冷冻管内，敞开管口，垂直放于干
燥器内，以硅胶(4 L干燥器中加入1 kg硅胶)干
燥不同时间(0、2、4、6、8、12、16 h)后，
取出冷冻管，将不同处理时间的花粉分为两部
分：一部分盖上冷冻管盖后投入液氮(-196℃)中
保存，用不同温度和不同时间(4 ℃ 2 h、20 ℃
30 min、40 ℃ 70 s)解冻后，分别检测花粉萌发
率：另一部分不经液氮保存，作为对照。
(2)玻璃化法保存。于室温(20 ℃)条件下，将
花粉等量装入2 mL冷冻管中，以改良的玻璃化液
PVS4 (35% 甘油 +20% 乙二醇 +0.6 mol·L-1 蔗糖)
(Sakai 2000)处理不同时间(0、10、20、40、60、
80、100 min)后，一部分迅速投入液氮(-196℃)
中保存，解冻(方法同上)后，以1.0 mol·L-1蔗糖
液洗涤 2 次，每次 8 min，分别检测花粉的萌发
率；以另一部分不经液氮保存的花粉为对照。
检测花粉萌发率时，干燥保存过的花粉，于
室温和 100% 相对湿度下复水 30 min，经玻璃化
法保存过的花粉则取出后用蒸馏水洗去表面糖液，
均匀散播于萌发培养基(15% 蔗糖 +1% 琼脂)上，
于25 ℃条件下恒温培养10 h 后，显微镜观察统
计花粉萌发百分数(花粉管长度大于花粉粒直径者
为萌发花粉)。
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月182
实验结果
1 干燥时间对超低温保存后花粉萌发率的影响
从表1 可以看出，用干燥法干燥的花粉，随
着干燥处理时间的延长，未经液氮保存的花粉萌
发率逐渐降低，而经液氮保存的花粉生活力则先
升高后降低，其中干燥 8 h 时的萌芽率最高，为
85%，这与前人在柿中的结果一致(艾鹏飞和罗正
荣 2004)。由此也可以看出，不同植物的花粉超
低温保存的适宜含水量是有差异的，所以找出适
宜含水量所需要的脱水时间是干燥法保存时的重要
环节。因此认为桃品种‘八月香’花粉的适宜
干燥脱水时间应是8 h 左右。
月香’花粉超低温保存后所需的解冻方法也不
同。低温(4 ℃) 2 h、室温(20 ℃) 30 min和高温
(40 ℃) 70 s化冻后，干燥法干燥的超低温保存后
的花粉萌发率都可以达到 80% 以上，而玻璃化法
处理的超低温保存后的花粉则对解冻温度和时间比
较敏感，其中以40 ℃解冻70 s的萌发效果最好，
20 ℃次之，4 ℃的效果最差。化冻方式是超低温
保存研究中的关键步骤，不同植物材料超低温保
存后最佳化冻方式不同(徐艳等2006)。因此对桃
品种‘八月香’花粉来说，要获得高的萌发率，
玻璃化法保存后以40 ℃解冻70 s的解冻方式最适
宜，而干燥法保存后上述 3 种化冻方式都比较合
适。
表1 干燥时间对桃品种‘八月香’花粉萌发率的影响

干燥时间/h
花粉萌发率/%
未经液氮保存 液氮保存
0 90.3a 65.5d
2 90.2a 67.6d
4 89.1ab 74.7c
6 88.4bc 82.3ab
8 87.2cd 85.5a
12 84.6d 80.7b
16 79.6e 74.1c
　　采用 Duncan 检测方法(P=0.05)，字母相同者表示差异不显
著，字母不同者表示差异显著。
图1 解冻方式对桃品种‘八月香’花粉
超低温保存后萌发率的影响
2 PVS4 处理时间对超低温保存后花粉萌发率的影
响
表2 显示经玻璃化法处理的桃花粉，随着处
理时间的延长，未经液氮保存的花粉萌发率逐渐
降低，而经液氮保存的花粉生活力则先降低后升
高，随之又降低，其中处理 60 min 的萌芽率达
到 7 0 % 以上。其原因可能是保护剂处理时间过
短，材料脱水不够，降温过程中不能迅速达到玻
璃化状态，因而花粉萌发率下降所致，但处理时
间过长，花粉则可能由于受到玻璃化液的毒害，
萌发率反而有所降低，因而对桃品种‘八月香’
的花粉来说，适宜的玻璃化液处理时间应以室温
下处理60 min 为宜。
3 解冻方式对超低温保存后花粉活力的影响
如图 1 所示，保存方法不同，桃品种‘八
4 贮藏时间对超低温保存后花粉活力的影响
从表 3 可以看出，桃品种‘八月香’花粉
在液氮(-196℃)超低温条件下保存不同时间的萌发
率没有显著变化，说明此种保存方法对保存植物
花粉是比较适宜的。
表2 PVS4 处理时间对桃品种‘八月香’花粉萌发率的影响

处理时间/min
花粉萌发率/%
未经液氮保存 液氮保存
0 90.3a 65.1b
10 84.5b 55.2c
20 81.2c 56.1c
40 79.7cd 67.5b
60 76.5d 72.7a
80 67.4e 54.4c
100 56.4f 32.2d
　　采用 Duncan检测方法(P=0.05)，字母相同者表示差异不显
著，字母不同者表示差异显著。
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 183
讨　　论
保护剂的作用机制是其可增大膜对水分的通
透性，促进细胞外冰冻造成的脱水效果，降低细
胞内水冰点温度，保护蛋白质和酶类，因此选好
冰冻保护剂是保证细胞进行超低温保存的关键，
保护剂的选择和浓度以及几种保存剂的配合方式对
细胞存活有很大影响(梁永恒等 1 9 9 9；苗琦等
2005)。本实验中 PVS4 处理可减少传统保存方法
中采用二甲基亚砜(DMSO)对花粉的伤害，同样
有较好的保存效果，这种保护剂能否用于保存更
多植物的花粉仍待进一步研究。从我们的实验结
表3 贮藏时间对桃品种‘八月香’花粉萌发率的影响

保存时间/d
花粉萌发率/%
干燥法保存 玻璃化法保存
1 85.5a 72.7a
10 84.2a 71.9a
30 82.6a 71.4a
60 83.1a 71.3a
　　采用 Duncan 检测方法(P=0.05)，字母相同者表示差异不显
著，字母不同者表示差异显著。
果来看，玻璃化法保存花粉因有保护剂的存在，
对花粉有一定伤害作用，保存后有部分花粉死
亡，花粉萌发率降低。而干燥脱水法保存花粉的
操作简便易行，且保存效果更好，似乎更有实际
应用价值。
参考文献
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