全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 245
H+参与茉莉酸调控蚕豆气孔运动的信号转导
刘新 1,2，李云 1，孟繁霞 1，张蜀秋 1,*
1中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京 100094；2莱阳农学院生命科学学院，山东青岛
266109
提要：以 BCECF-AM为 pH的荧光探针，结合激光共聚焦扫描显微技术，研究 H+可能参与茉莉酸(JA)调控气孔运动信
号转导途径的结果表明，0.1~100 µmol·L-1浓度的(-)JA可诱导蚕豆气孔关闭，在引起气孔孔径改变之前，(-)JA能引起蚕
豆保卫细胞胞质的碱化 ；而(±)JA可诱导气孔适当开放，它未引起蚕豆保卫细胞胞质中pH的明显改变。药理学实验证明，
质膜上质子泵的抑制剂矾酸钠能减弱(-)JA诱导气孔关闭的作用；而质膜上质子泵的激活剂壳梭孢菌素(fusicoccin)基本上
未改变(±)JA的作用趋势。(-)JA和(±)JA刺激保卫细胞胞质Ca2+变化则表现出不同趋势。说明不同异构体形式的 JA在调
节气孔运动中的作用和信号转导途径有所不同。
关键词：茉莉酸；气孔运动；H+；Ca2+；信号转导；蚕豆
H+ Involving Signal Transduction in Regulation of Vicia faba L. Stomatal Move-
ment by Jasmonic Acid
LIU Xin1,2, LI Yun1, MENG Fan-Xia1, ZHANG Shu-Qiu1,*
1State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing
100094, China; 2Department of Life Sciences, Laiyang Agricultural College, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: Using fluorescent probe BCECF-AM and Fluo-3 monitored the changes of pHi and [Ca2+]cyt in guard
cells of Vicia faba under confocal microscopy. Whether H+ was involved in signal transduction in JA regulating
stomatal movement was tested. The results showed that (–)JA induced stomatal closure at concentrations of
0.1~100 µmol·L-1 was mediated intracellular alkalization in guard cells. In contrast, (±)JA induced stomatal open
without pHi changes. Pharmacological experiment proved that Na3VO4 reduced the effectiveness of (–)JA-
induced stomatal closure, while fusicoccin had no effect on (±)JA-induced stomatal opening. Compared changes
of [Ca2+]cyt induced by (–)JA and (±)JA: (–)JA increased [Ca2+]cyt rapidly, while (±)JA induced [Ca2+]cyt increas-
ing and decreasing slowly. These results demonstrated that (–)JA and (±)JA had different roles and signal
pathways in regulation of stomatal movement.
Key words: jasmonic acid (JA); stomatal movement; H+; Ca2+; signal transduction; Vicia faba
收稿 2006-11-11 修定 　2007-03-15
资助 国家自然科学基金(3 0 3 7 0 1 4 1 )和山东省教育厅基金
( J 0 4C1 3 )。
* 通讯作者(E-mail：sqzha ng@cau.edu.cn；Tel：010-
6 2 7 3 3 6 0 2 )。
气孔保卫细胞对各种内外因子非常敏感，能
快速调控气孔的运动，以适应环境变化，所以，
保卫细胞成为研究植物细胞信号转导的模式系统。
气孔保卫细胞内信号转导的第二信使如 Ca2+、细
胞内 pH (pHi)、肌醇磷脂系统、cAMP和 cADPR
(cyclic ADP-ribose)等参与逆境和植物激素等的信
号转导都已得到证明(刘新等 2001)。在气孔保卫
细胞内H+可作为胞内第二信使参与ABA和生长素
对气孔的调节。在正常状态下，pHi维持相对恒
定以保证生理功能正常进行，细胞受到刺激后，
pHi可能会发生变化进而对许多代谢过程产生影
响。例如，ABA可导致保卫细胞胞质碱化，保
卫细胞 pHi的改变可影响K+通道的开闭(Blatt和
Armstrong 1993)。生长素可使兰花细胞 pHi降低
(Irving等 1992)。
茉莉酸(jasmonic acid，JA)作为可移动的伤信
号分子，在植物的防御反应中有至关重要的作用
(Schilmiller和Howe 2005)。在伤胁迫下，气孔运
动异常，JA及其甲酯(methyl jasmonate，Me-JA)
能影响气孔的开闭运动。JA可诱导兰花等植物气
孔关闭，阻止气孔张开(Gehring等 1997) ；Lee等
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(1994)和Suh等(1998)报道，JA的前体物不饱和脂
肪酸和花生四烯酸可诱导鸭趾草气孔孔径增大，
阻止黑暗诱导的气孔关闭。在植物体内已发现多
种异构形式的茉莉酸类化合物(JAs)，不同结构
JAs的生物活性有所不同，即生理活性有其结构
基础(宋平等 2002)。细胞对植物激素的响应要经
过一系列信号转导，我们观察到气孔保卫细胞对
(-)JA和(±)JA有不同的应答，是否是不同的信号
组分参与植物体中二者的信号传递？另外，已知
Ca2+信使参与(-)JA调控气孔运动的信号转导(刘新
等 2005)，但在(±)JA和(-)JA的信号转导过程中是
否有H+信使参与？为了进一步探讨JA调控气孔运
动的机制，了解 JA信号转导的可能途径及其特
性，特别是H+是否作为这一过程中的第二信使，
我们以蚕豆幼苗为材料，以酯化的 2’,7’-二(2-羧
甲基)-5 (6)-羧基荧光素(BCECF-AM)为pH荧光探
针，结合激光共聚焦扫描显微技术，初步观察了
外源 JA与蚕豆保卫细胞胞质中 pH值的关系。并
初步比较了(-)JA和(±)JA引起保卫细胞胞质中Ca2+
变化的趋势，旨在为进一步探索 JA的作用机制提
供实验基础。
材料与方法
蚕豆(Vicia faba L.)种子经HgCl2灭菌后，浸
种 12 h，于 25 ℃催芽 2~3 d后再放在 12 h·d-1光
照、光照度为 200 µmol·m-2·s-1、昼夜温差为 24 ℃/
18 ℃、相对湿度为 50%的条件下，培养 3~4周
后作试验用。
测定气孔开度时，取 3~4周龄蚕豆幼苗最上
端完全展开的叶片，放入盛有蒸馏水的培养皿
中，光下或暗中处理 2 h使气孔开放或关闭。小
心撕取其下表皮，并用毛笔刷小心除去表皮条上
面粘附的叶肉细胞。用显微测微尺测量气孔的初
始孔径，测量时随机选取 5个视野，每个视野内
随机选取 10 个气孔。然后，用分别含不同浓度
(- ) J A 和( ± ) J A、1 0 µmo l ·L - 1 的壳梭孢菌素
(fusicoccin，FC)或 50 µmol·L-1矾酸钠的表皮条缓
冲液(10 mmol·L-1 MES/KOH含50 mmol·L-1 K+和100
µmol·L-1 Ca2+，pH 6.1)在光或暗中处理表皮条 3
h。记录终态孔径，每个处理重复 5 次以上。
荧光探针孵育时， 将表皮条放于缓冲液中，
加入10~20 µmol·L-1 BCECF-AM (溶于二甲基亚枫)
或10~20 µmol·L-1 钙离子荧光探针Fluo-3-AM (溶
于二甲基亚砜)和 0.1% Pluronic F-127中，于 25
℃下避光孵育 2 h左右，取出后用表皮条缓冲液
冲洗多次，除去吸附的染料(Irving 1992；孟繁
霞等 2001)。然后将冲洗好的表皮条置于载玻片
上，盖好盖片，用波长 488 nm的蓝光激发，经
激光共聚焦扫描显微镜(MRC-1024，Bio-Rad公
司)扫描。随着时间变化的荧光图像和数据在时间
进程面板下呈现，在 Laser Sharp Processing下进
行图像处理，数据处理用 Excel软件进行，用每
3 min采集到的Ca2+ 荧光强度数据(F)与开始处理的
初始pH或Ca2+ 荧光强度(F0)的比值(F/F0)作出时间
进程曲线图(Irving等 1992；孟繁霞等 2001)。
实验结果
1 (-)JA和(±)JA对蚕豆气孔运动的影响
在光下，(- ) JA 能明显诱导蚕豆气孔关闭；
在 0.1~100 µmol·L-1 JA范围内，其诱导效应随着
JA的浓度增加而加强，气孔孔径减小到原来的三
分之一(图 1)。在暗条件下，(±)JA可诱导蚕豆叶
片原来关闭的气孔张开，阻止暗诱导的气孔关闭(图
2) ；在 0.1~100 µmol·L-1 (±)JA范围内，其诱导
气孔张开的效应随浓度增高而加强。其中，10和
100 µmol·L-1 (±)JA明显诱导气孔张开，它们分别
使气孔孔径增大 1和 1.5倍。看来，(-)JA和(±)JA
调控气孔运动的作用完全不同，其信号转导机制
可能也有所不同。
图 1 光下不同浓度(-)JA对蚕豆气孔运动的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of (-)JA on
V. faba stomatal movement under light
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2 H+信号参与JA调控蚕豆气孔运动的药理学证据
图 3和图 4显示：(1)在气孔关闭之前，100
µmol·L-1 (-)JA能够引起保卫细胞胞质中pH的快速
升高而后下降，而加入缓冲液作为对照的保卫细
胞胞质中 pH保持稳定(图 3)。由此看来，在(-)JA
诱导气孔关闭的作用中，可能会有H+参与信号转
导。但是，100 µmol·L-1 (±)JA未能引起保卫细
胞胞质中 pH的明显改变(图 4)。
图 2 暗中不同浓度(±)JA对蚕豆气孔运动的效应
Fig.2 Effects of different concentrations of (±)JA on
V. faba stomatal movement in dark
图 3 (-) JA影响下的蚕豆保卫细胞中pHi的动态变化
Fig.3 Dynamic change in pHi of V. faba
guard cells effected by (-)JA
图 4 (±)JA 影响下的蚕豆保卫细胞中 pHi的动态变化
Fig.4 Dynamic change in pHi of V. faba
guard cell effected by (±)JA
图 5 矾酸钠对(-)JA诱导蚕豆气孔关闭的影响
Fig.5 Effect of Na3VO4 on V. faba stomatal
closure induced by (-)JA
图 6 FC对(±)JA诱导蚕豆气孔张开的影响
Fig.6 Effect of FC on V. faba stomatal
opening induced by (±)JA
(2)作为质膜上质子泵抑制剂的矾酸钠，在50
µmol·L-1的浓度下能削弱低浓度(1和 10 µmol·L-1)
(- )JA诱导气孔关闭的作用(图 5)。进一步说明，
在(-)JA诱导气孔关闭的作用中有H+信号的参与。
作为质膜上质子泵激活剂的 FC，在光下能诱导气
孔孔径增大，(±)JA也可诱导气孔张开，但 FC基
本上没有改变(±)JA的作用趋势(图 6)。由此推测，
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(±)JA调控的气孔运动与质子泵的关系不甚密切。
3 (–)JA和(±)JA的Ca2+信号特异性
为进一步了解气孔保卫细胞对(-)JA和(±)JA
反应不同的原因，结合我们已经观察过的(-)JA引
起的保卫细胞胞质 Ca 2+的变化，比较二者诱导
[Ca2+]cyt变化的结果(图 7)显示：(-)JA引起保卫细
胞[Ca2+]cyt的快速上升和下降；而(±)JA引起的保
卫细胞[Ca2+]cyt表现出升高时间较晚，但维持高水平
的时间长，再后缓慢下降。虽然(-)JA和(±)JA都
引起[Ca2+]cyt的变化，但二者各有明显的特异性。
图 7 (-)JA和(±)JA 刺激下的蚕豆保卫
细胞 [Ca2+]cyt动态变化的比较
Fig.7 Comparison of dynamic changes in [Ca2+]cyt of V. faba
guard cell stimulated by (-)JA and (±)JA
讨　　论
JA是普遍存在于植物体内的一种内源的生长
调节物质，与抵抗病原侵染也有关系，是植物对
外界伤害(机械伤害、食草动物、昆虫、病原菌
浸染)做出反应而诱导抗性基因表达的信号分子(刘
新和张蜀秋 2000)。Kenton等(1999)业已证明，
Ca2+和蛋白磷酸化参与 JA的信号转导过程。JA可
促进兰花叶片气孔关闭，在 JA诱导气孔关闭之前
发生胞质碱化现象(Gehring等 1997)。而且 JAs的
碱化作用的程度和幅度与兰花(Irving等 1992)和蚕
豆(Blatt和Armstrong 1993)对ABA的应答非常相
似。因此推测，JA引起的胞内 pH升高可能是气
孔保卫细胞信号转导的一个组分。
在植物体内，存在多种形式的茉莉酸类物
质，其生理活性与结构差异有关。本文结果表
明，(-)JA和(±)JA对气孔运动的生理效应不同(图
1和 2)，其信号转导机制也存在差异。在(-)JA诱
导蚕豆气孔关闭的过程中有H+信号的参与(图3和
5) ：外源(-)JA能够引起蚕豆保卫细胞胞质的碱
化，并且胞质碱化发生在气孔孔径改变之前，这
与Lee等(1994)报道的JA的前体物亚麻酸可调控K+
通道，激活质膜H+-ATPase，进而影响气孔运动
的结果类似。而(±)JA促进气孔张开的过程中似乎
没有H+信号参与(图 4和 6)。由此看来，不同异
构体形式 JA的作用不同，可能与它们的信号转
导途径不同有关。即使都是诱导气孔关闭的生长
调节物质如茉莉酸甲酯和脱落酸，却经由不同的
信号转导途径来识别不同的刺激 ( S u h i t a 等
2 00 3)。
保卫细胞内存在多种信号转导成员，其中的
[Ca2+]cyt和 pHi这 2种信使既有相对的独立性，又
存在着复杂的相互交叉(cross talk) (刘新等 2001)。
本文结果表明，在(-)JA诱导蚕豆气孔关闭中，既
有 Ca2+信号又有质子信号参与，对于这 2者之间
的关系值得探讨。至于(-)JA和(±)JA引起[Ca2+]cyt
动态变化的特异性(图 7)，则正体现出气孔保卫细
胞可通过胞质中 Ca2+变化的时间、幅度等异质性
而导致不同的下游信号转导途径来精确识别不同的
刺激，进而表现出不同的应答(McAinsh等 1997)。
因此更应深入探讨JAs调控气孔运动信号转导途径
的细节。
参考文献
刘新, 孟繁霞, 张蜀秋, 娄成后(2001). 气孔保卫细胞信号转导中
的第二信使. 植物生理学通讯, 37 (6): 556~561
刘新, 石武良, 张蜀秋, 娄成后(2005). Ca2+参与茉莉酸诱导蚕豆
气孔关闭的信号转导. 实验生物学报, 38 (4): 297~302
刘新, 张蜀秋(2000). 茉莉酸类物质在伤信号转导中的作用机制.
植物生理学通讯, 36 (1): 76~81
孟繁霞, 苗龙, 冷强, 张蜀秋(2001). 测定蚕豆保卫细胞胞质中游
离 Ca 2+的荧光染料孵育法. 植物生理学通讯, 37 (5): 429~
432
宋平, 夏凯, 曹显祖(2002). 茉莉酸类化合物结构与活性之间的
关系及参与茉莉酸生物合成的酶. 植物生理学通讯, 38 (1):
72~77
Blatt MR, Armstrong F (1993). K+ channels of stomatal guard
cells: abscisic-acid-evoked control of the outward rectifier
mediated by cytoplasmic pH. Planta, 191 (3): 330~341
Gehring CA, Irving HR, McConchie R, Parish RW (1997).
Jasmonates induce intracellular alkalinizaton and closure of
Paphiopedilum guard cells. Ann Bot, 80: 485~489
植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 249
Irving HR, Gehring CA, Parish RW (1992). Changes in cytosolic
pH and calcium of guard cells precede stomatal movements.
Proc Natl Acad Sci USA, 89: 1790~1794
Kenton P, Mur L, Draper J (1999). A requirement for calcium and
protein phosphatase in the jasmonate-induced increase in
tobacco leaf phosphatase specific activity. J Exp Bot, 50
(337): 1331~1341
Lee Y, Lee HJ, Crain RC, Lee A, Korn SJ (1994). Polyunsaturated
fatty acids modulates stomtal aperture and two distinct K+
channel currents in guard cells. Cell Signal, 6: 181~186
McAinsh MR, Brownlee C, Hetherington AM (1997). Calcium ions
as second messengers in guard cell signal transduction. Physiol
Plant, 100: 16~29
Schilmiller AL, Howe GA (2005). Systemic signaling in the wound
response. Curr Opin Plant Biol, 8: 369~377
Suh SJ, Park JG, Lee Y (1998). Possible involvement of phos-
pholipase A2 in light signal trasduction of guard cells of
Commelina communis. Physiol Plant, 104 (3): 306~310
Suhita D, Kolla VA, Vavasseur A, Raghavendra AS (2003). Differ-
ent signaling pathways involved during the suppression of
stomatal opening by methyl jasmonate or abscisic acid. Plant
Sci, 164: 481~488