全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 711
水杨酸诱导的烟草抗性相关序列的分离
董霞 1,3,*,**，李文正 2,*，付坚 4，兰建强 3，李正风 2，刘世贵 1
1四川大学生命科学学院，成都 610064；2云南省烟草科学研究所，云南玉溪 653100；3云南农业大学食品科学技术
学院，昆明 650201；4云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650223
提要：通过已分离鉴定的水杨酸诱导烟草‘云烟 85’中与抗性相关的差异表达基因，采用差示筛选和反式 Northern检
测以及序列分析得到94个烟草差异表达的EST序列。经测序及同源性比较，其中87个有同源序列，7个为新序列；有51
个与抗性相关，占总序列的54.3%，其中有系统获得抗性蛋白基因和病程相关蛋白基因等。
关键词：水杨酸；烟草；差示筛选；序列分析；抗性相关基因
Isolation of Resistance-related Genes Induced by Salicylic Acid from Nicoti-
ana tabacum L.
DONG Xia1,3,*,**, LI Wen-Zheng2,*, FU Jian4, LAN Jian-Qiang3, LI Zheng-Feng2, LIU Shi-Gui1
1College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 2Yunnan Tobacco Science Research Institute, Yuxi, Yunnan
653100, China; 3Faculty of Food Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 4Biotechnology and Genetic
Germplasm Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China
Abstract: To clarify mechanisms of salicylic acid (SA) induction in tobacco, differential expression resistance-
related genes were isolated from suppression subtractive hybridization (SSH) library induced by SA in tobacco
‘Yunyan 85’. 94 clones were selected by differential screening and virtual northern analysis. The blastn homol-
ogy search analysis revealed that 87 clones had homologue genes, and 7 clones were new. And there were 51
clones related with resistance, accounting for 54.3% of total expression genes. Most of them involved in the
process of systemic acquired resistance protein and pathogenesis-related protein.
Key words: salicylic acid; Nicotiana tabacum; differential screening; sequence analysis; resistance-related
gene
收稿 2007-04-29 修定 　2007-07-06
资助 国家自然科学基金(3 05 60 06 2)、云南省烟草公司科技
开发计划项目(03 A01 和 0 51 5)。
致谢 云南农业大学植物病理重点实验室何月秋先生和云南省
农业科学院生物技术与种质资源研究所程在全先生曾提
出修改意见。
* 共同第一作者。
** E-mai l：dxia0 70 9@1 26.com；Tel：08 71 -22 77 17
水杨酸(salicylic acid，SA)能诱导植物产生抗
生物和非生物胁迫的能力，其诱导表达的基因已
得到克隆。SA能使从刺茄(Solanum surattense)中
分离到的病程相关蛋白10基因(Liu等2006)和辣椒
(Capsicum annuum)中受烟草花叶病毒诱导的抗性
基因(Lee等2001)上调表达。编码水杨酸结合蛋白
2 (salicylic acid-binding protein 2，SABP2)的基因
以及拟南芥受病原侵害时因受SA积累而上调表达
所得几个基因，如NDR1 (non-race-specific disease
resistance 1)、EDS1 (enhanced disease susceptibi-
lity 1)和 PAD4 (phytoalexin deficient4)等也得到克
隆(Kumar和Klessig 2003；Zhou等 1998；Falk等
1999；Jirage等 1999；Feys等 2001)。分离水杨
酸诱导差异表达基因是研究水杨酸诱导植物抗性分
子机制的有效方法之一。此外，抑制消减杂交
(suppression subtractive hybridization，SSH)是 1996
年Diatchenko等结合消减杂交和抑制 PCR而发展
起来的分离克隆差异表达基因的方法，能一次性
地在短时间内得到多个差异表达的EST (序列表达
标签，sequence expressing tagging)序列，现已
广泛应用于植物不同发育阶段、植物突变体、不
同环境因素(包括非生物因素和生物因素)造成的植
物基因差异表达序列的分离克隆(董霞等 2006)。
本文在以往工作(董霞等 2005)的基础上，从前文
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月712
材料中挑选部分序列进行实验和测序，并分离鉴
定出与抗性相关的差异表达基因。
材料与方法
消减 cDNA片段的克隆纯化时，巢式 PCR引
物 1：5 TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3，
巢式PCR引物2R：5 AGCGTGGTCGCGGCCGA-
GGT 3，引物各 1 µL (10 µmol·L-1)，20 µL反应
体系(董霞等 2005)。对已构建的水杨酸诱导烟草
品种‘云烟 85’(Nicotiana tabacum L. ‘Yun85’)抑
制消减杂交文库经蓝白斑筛选的白斑菌液分别进行
PCR扩增(董霞等 2005)。取 5 µL PCR产物以 1.2%
琼脂糖凝胶进行电泳，以估计插入片段的大小。
并从中挑选不小于 200 bp的 1 µL PCR产物 纯化
后，按阵列点样于 Immobilon-Ny+转印膜上，用
0.6 mol·L-1 NaOH溶液浸泡 5 min进行变性，再置
于0.5 mol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)溶液中浸泡5 min进
行中和，蒸馏水冲洗后于紫外交联仪中交联，干
燥后待用。
制备探针时，分别将 2次 PCR产物未消减清
水对照 cDNA、未消减 SA诱导 cDNA、反向消
减 cDNA和正向消减 cDNA，经 QIAquick PCR
Purification Kit (德国QIAGEN公司)纯化后，用
RsaI酶切消化，除去 cDNA两端的接头，酶切产
物经 PCR产物纯化试剂盒纯化回收。按地高辛标
记和探测试剂盒I (Dig-High Prime PNA Labeling and
Detection Starter Kit I)制备探针和检测标记效率。
差示筛选时，将阵列膜分别与 4种不同的探
针杂交。按地高辛标记和探测试剂盒 I进行烤膜、
预杂交、杂交、显色、洗膜。
cDNA测序及同源性比较时，挑选不小于200
kb的经差示筛选的正向文库中96个克隆，送上海
博亚生物技术有限公司用3700测序仪测定插入序
列的 D N A 序列。测得的序列用自行开发的
SEQtool软件(李文正等 2007)去除载体序列，再去
除 PloyA的序列，用GenBank中的 BLASTN软件
进行同源性比较。
结果与讨论
1 SA诱导烟草 cDNA消减文库的鉴定
矩阵中的样品来源于正向消减杂交文库中的
cDNA，分别与 4种探针杂交，其中测试组为 SA
诱导，驱动组为清水对照(图 1)。(1 )用地高辛标
记的烟草 SA诱导和喷施清水(对照)的消减和未消
减的 cDNA做探针，与随机挑选的差减杂交所获
得的单克隆 PCR产物杂交的结果显示，以未消减
的对照探针与文库的克隆杂交时，只有 3个点非
常明显，其余杂交信号很弱或几乎没有杂交信号
图 1 SA诱导烟草 cDNA消减文库的差示筛选(部分)
Fig.1 Differential screening of clones from the subtractive library of N. tabacum induced by SA
a：未消减对照探针(驱动组)；b：未消减 S A 诱导探针(测试组)；c：反向消减探针(驱动组)；d：正向消减探针(测试组)。
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表 1 SA诱导的烟草抗性相关基因
Table 1 Resistance-related genes of N. tabacum induced by SA
克隆编号 DNA长 出现频 同源基因 同源基因登录号 同源基因 同源性
度 /bp 率 /次 的来源
YUNB248 353 3 Sar8.2c基因 gi|170336 烟草 345/346 (99%)
gb|M97360
YUNB114 266 2 Sar8.2g基因 gi|6689807 烟草 227/227 (100%)
gb|U64810
YUNB100* 161 4 Sar8.2k基因 gi|6689815 烟草 159/161 (98%)
gb|U64814
YUNB109 161 3 Sar8.2i基因 gi|6689809 烟草 160/161 (99%)
gb|U64811
YUNB73 192 2 Sar8.2k基因 gi|6689815 烟草 148/157 (94%)
gb|U64814
YUNB102 353 6 Sar8.2d基因 gi|170338 烟草 341/345 (98%)
gb|M97361
YUNB383 513 1 Sar8.2d基因 gi|170338 烟草 414/418 (99%)
gb|M97361
YUNB60 390 3 Sar8.2j基因 gi|6689811 烟草 233/233 (100%)
gb|U64812
YUNB258 395 2 Sar8.2e基因 gi|170340 烟草 378/379 (99%)
gb|M97362
YUNB796 212 1 Sar8.2e基因 gi|170340 烟草 211/212 (99%)
gb|M97362
YUNB520 501 2 病程相关蛋白 PR-1a gi|19930 烟草 382/382 (100%)
emb|X12485
YUNB169 324 1 病程相关蛋白 PR-1a gi|19930 烟草 222/223 (99%)
emb|X12485
YUNB378 503 1 病程相关蛋白 PR-1b gi|19947 烟草 495/503 (98%)
emb|X12486
YUNB149 405 1 病程相关蛋白 PR-1b gi|19947 烟草 395/405 (97%)
emb|X12486|
YUNB157 288 4 类富含甘氨酸蛋白基因 gi|40455715 烟草 277/297 (93%)
gb|AY491538
YUNB389 304 1 依赖于钙和钙离子蛋白激酶基因 gi|47105516gb 拟南芥 258/294 (87%)
BT014101
YUNB432 348 1 二磷酸核苷激酶基因 gi|7643787 辣椒 286/316 (90%)
gb|AF108881
YUNB379 496 2 核酮糖 -1 ,5-二磷酸羧化酶小亚基 gi|170319 烟草(Nicotiana 441/453 (97%)
gb|J01308 sylvestris)
YUNB426 351 2 过氧化氢酶 2 基因 gi|536784 白花丹叶烟草 301/308 (97%)
emb|Z36976
YUNB64 307 1 G蛋白 β 亚基基因 gi|1749824 白花丹叶烟草 218/283 (77%)
emb|Z72388
YUNB71 546 1 磷脂酶 C2基因 gi|6969576 烟草 394/418 (94%)
gb|AF223573
YUNB422 435 2 紫外线 -B 抑制蛋白基因 gi|45351860|gb| 陆(高)地棉 151/182 (82%)
AY551823
YUNB334 346 1 推测细胞色素 C氧化酶蛋白基因 gi|57635372emb 发光杆菌(Photo- 182/183 (99%)　
|AJ749800 bacterium
damsclac ssp.)
YUNB430 478 1 金属硫蛋白基因 gi|1469927 烟草(Nicotiana 227/245 (92%)
gb|U46543 glutinosa)
YUNB571 396 1 鸟氨酸脱羧酶基因 gi|20068310emb 烟草 136/167 (81%)
|AJ316582
YUNB190 345 1 1-氨基环丙烷 -1-羧酸合成酶基因 gi|41059851gb| 烟草(Nicotiana 330/345 (95%)　
AY426755 attenuata)
YUNB592 378 1 牻牛儿基牻牛儿基还原酶基因 gi|3821253 烟草 331/349 (94%)
emb|AJ007789
*为董霞等(2 0 0 5 )已发表数据。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月714
(图 1-a)。以消减对照群体驱动组作为探针与文库
的克隆杂交(图 1-c)，其中有的信号虽然比未消减
对照的(图 1-a)强，但差异不明显。与未消减 SA
诱导探针杂交时，大部分都能看到杂交信号，表
明差异表达基因得到有效富集，但杂交信号强弱
差异大，表明还未达到 cDNA的均一化(图 1-b)。
与消减 2次 PCR群体探针杂交时，除了一个点杂
交信号依然很弱外，其余都比较强，而且信号强
弱差异不大(图 1-d)。
(2)来自正向杂交文库的克隆与不同的探针杂
交的结果表明，与未受SA诱导对照群体探针杂交
(图 1-a)和与以对照 cDNA 为测试组、SA 诱导
cDNA为驱动组进行抑制消减杂交得到的反向消减
杂交探针(图 1-c)的杂交信号普遍较弱。与未消减
SA诱导cDNA探针杂交(图1-b)的信号比与未受SA
诱导为探针的杂交(图 1-a、c)信号强，且不同点
的杂交信号强度差异较大，有的很强，有的较
弱。与正向消减探针杂交(图 1-d)的信号是 4个杂
交中信号最强的，且杂交信号的强度基本一致。
这些结果表明，消减杂交不仅使差异表达基因得
到富集，而且不同表达丰度的基因也可均一化，
此文库达到预期目的。
2 EST序列的同源性比对
挑选不小于 200 kb的经差示筛选在正向文库
中上调表达的单克隆菌液测序。96个样品得到 94
条序列，其中 87个有同源基因，但有 4个是与
其它文库的 cDNA克隆同源，且功能未定；7个
没有同源基因。而在 94个克隆中，有 32个编码
系统抗性和病程相关蛋白的基因，占可读序列的
34.0%；其余为参与物质代谢、转移、合成和信
号传递等的基因序列，有的还与抗性相关。
3 抗性相关基因
从表 1可见，文库中分离到的 EST序列涉及
到烟草系统获得抗性蛋白，包括Sar8.2c、Sar8.2g、
Sar8.2k、Sar8.2d、Sar8.2j等 27个，还有病程
相关蛋白 PR-1a、PR-1b等 5个。其余为与抗病
或抗性相关蛋白的基因序列，如烟草的富含甘氨
酸蛋白、拟南芥钙调蛋白的激酶蛋白和多种烟草
过氧化氢酶，总共 51 个序列，占可分析序列的
54.3%。
总之，抑制消减杂交技术具有简单有效、假
阳性率低等优点。本文从构建的受SA诱导的烟草
SSH文库中得到大量差异表达的EST序列。从 94
个序列分析中，得到系统获得抗性基因家族 8
(Sar8)的序列、病程相关蛋白 PR-1a和 PR-1b基因
以及编码与抗性相关蛋白如钙调蛋白激酶、蛋白
磷酸酶、G蛋白、磷脂酶 C、抗病反应过程中的
系统信号分子(王金生 1999)，还有抗紫外线伤害
的 UVB蛋白基因、过氧化氢酶、富含甘氨酸蛋
白基因等。与骆蒙等(2002)的小麦抗白粉病表达
谱相比，两个文库都得到 SAR和 PR基因，不同
的是本文库中的 SAR基因更为丰富多样。但本文
库中没有分离到识别病原和抑制病原菌生长的序
列，说明 SA能诱导植物的 SAR反应，但 SA诱
导和病原微生物诱导植物的基因表达不同。所以
我们推测，植物在未受到病原侵染时，直接参与
抗病反应的基因不会表达或提高，是否如此还需
进一步研究，或许扩大文库的测序量有可能验证
这一观点。
参考文献
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