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利用酶标仪快速批量测定
橡胶草中菊糖的含量
朱金霞，张源沛* ，郑国保，孔德杰，李 苗
(宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，宁夏银川 750002)
收稿日期:2016－04－01
作者简介:朱金霞(1977－) ，女，硕士，副研究员，主要从事植物资源与生物化学方面研究，E－mail:jinxiazhu001@ 163.com。
* 通讯作者:张源沛(1968－) ，男，博士，研究员，主要从事植物资源与生物化学方面研究，E－mail:zhangypei@ 163.com。
基金项目:国家科技部国际合作项目 (2014DFＲ31020) ;宁夏回族自治区科技支撑对外合作项目。
摘 要:以橡胶草根为研究对象，采用 3，5－二硝基水杨酸法(DNS 法) ，利用酶标仪为检测仪器，建立了橡胶草中菊糖
的快速测定方法。结果表明，酶标仪检测橡胶草根中总糖和还原糖含量的最佳实验条件:波长为 550 nm、DNS 显色剂
用量为 0.8 mL、沸水浴显色时间为 8 min。同时，获得此条件下回归方程为 A = 0.6872C－0.0215(Ｒ2 = 0.9982) ，线性范
围为 0～2.2 mg /mL，加样回收率为 96.67% ～102.33%。该方法灵敏、稳定、重现性好，可在短时间内完成多个样品同时
测定，该方法所得结果略高于分光光度计法。
关键词:酶标仪，3，5－二硝基水杨酸(DNS)法，橡胶草，菊糖
Ｒapid batch determination of the inulin
in Taraxacum kok－saghyz Ｒodin by enzyme mark instrument
ZHU Jin－xia，ZHANG Yuan－pei* ，ZHENG Guo－bao，KONG De－jie，LI Miao
(Agricultural Biotechnology Center of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China)
Abstract:In order to establish the rapid batch determination method，which could be used in the determination of
the inulin in Taraxacum kok－saghyz Ｒodin root by enzyme mark instrument，3，5－dinitrosalicylic Acid Colorimetry
(DNS)was used as the mainly methods. The results showed that the optimum conditions as follows，the wave
length was 550 nm，the volume of color solution was 0.8 mL，the coloration time was 8 min.Under this condition，the
calibration curve of this method had a liner range from 0 to 2.2 mg /mL with a regression equation of A = 0.6872C－
0.0215(Ｒ2 = 0.9982) ，and the spotting recovery rate was from 96.67% to 102.33% .The method was sensitive，stable
and reproducibility to operate，and it was suitable to be used for rapidly and quantitatively analysis of inulin in
Taraxacum kok－saghyz Ｒodin.The results of the inulin in Taraxacum kok－saghyz Ｒodin，which had been detected
by enzyme is more higher than by spectrophotometry.
Key words:enzyme mark instrument;3，5－dinitrosalicylic Acid Colorimetry(DNS) ;Taraxacum kok－saghyz Ｒodin;
inulin
中图分类号:TS241 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2016)19－0294－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 19． 048
橡胶草(Taraxacum kok－saghyz Ｒodin，TKS)为菊
科(Compositae)蒲公英属多年生宿根草本植物，外形
与蒲公英非常相似，又被称为俄罗斯蒲公英，但其根
部含有天然橡胶［1］，俗称橡胶草［2］。橡胶草除含胶乳
外，还含有纤维素、菊糖等成分［3］，因此，从橡胶草不
但可获得战略资源橡胶，还可生产清洁能源乙醇和
保健品菊糖。近年来，作为一种重要的巴西橡胶树
替代作物、可再生能源植物及保健品开发植物，引起
了各国专家的广泛关注和研究［3］。
菊糖多存在于菊科、龙胆科、桔梗科等植物中，
主要是由 D－呋喃果糖经 1，2－糖苷键聚合而成的一
种果聚糖，呈直链结构，其还原性末端连有一分子葡
萄糖，每个菊糖分子约含 30～50 个果糖残基，植物中
所含菊糖均为多种不同聚合度果聚糖的混合物［4］。
菊糖具有水溶性膳食纤维和生物活性前体的生理功
能，因而广泛应用于低热量、低糖、低脂食品中，具有
多种保健功能和优良的食用价值，作为新型食品添
加剂而受到国内外的高度重视［5－6］。资料报道［7］，橡
胶草根中菊糖占干重的 40%左右，但其具体测定方
法未见报道。
DNS比色法是测定还原糖的经典方法，得到了
国内外研究者的普遍认可［8］，实验中一般采用分光光
295
度计进行测定［9－10］，由于受到比色槽数量的限制，一
次最多能测定 4 个样品，操作较繁琐，测定多个样品
时，费时费力。酶标仪与分光光度计的测试原理相同，
但具有样品槽多(96个)的特点，可在 2 min 内进行多
波段多个样品的测定。本研究利用酶标仪为测试仪
器，以果糖为标准品，以 DNS溶液为显色剂，通过测定
总糖水解液及还原糖提取液中的还原糖含量，进而获
得菊糖含量。本实验所建立的方法灵敏、稳定、重现性
好，可在 2 min内完成 96个样品的快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
橡胶草 2013 年从俄罗斯引进，在宁夏银川市
贺兰县橡胶草种质驯化基地种植，以一年生橡胶草
的根为实验材料。
结晶酚，亚硫酸氢钠，酒石酸钾钠，氢氧化钠，3，
5－二硝基水杨酸，果糖，盐酸 国药集团化学试剂有
限公司，分析纯。
伯乐 Bio－ rad xMark 酶标仪 时代联想生物科
技有限公司;Avanti J－26s × P 台式离心机 贝克曼
库尔特商贸(中国)有限公司;HH－6 电热恒温水浴
锅 无锡沃信仪器有限公司;DHG9013AS 电热鼓风
干燥箱 宁波艾德生仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂的配制方法及浓度 DNS显色溶液的配制
方法见参考文献［11］;果糖标准溶液浓度为 1.0 mg /mL，
配制方法见参考文献［12］。
1.2.2 还原糖含量的测定 采用 3，5－二硝基水杨酸
比色法(DNS法)测定还原糖供试溶液及总糖降解后
溶液中还原糖的含量。
1.2.3 橡胶草预处理 预处理流程如下:新鲜橡胶草
根→洗净→烘干(60 ℃，48 h)→粉碎(过 60 目)。
1.2.4 测试溶液的制备 还原糖供试溶液制备流程
如下:称取预处理后样品粉末 1.0 g→加 25 mL蒸馏水→热浸
(沸水浴)30 min→过滤→滤液定容于1000 mL→DNS溶液显色
5 min→酶标仪测定糖含量。总糖供试溶液制备流程如
下:称取预处理后样品粉末 1.0 g→加入 25 mL的 2.0%盐酸溶
液→热浸(沸水浴)30 min→调 pH于 7.0→脱色→过滤→滤液
定容于 1000 mL→DNS溶液显色 5 min→酶标仪测定糖含量。
1.2.5 取样 对酶标板 96 个微孔进行编号，并移取
250 μL待测试溶液于酶标板的微孔中，每个微孔可
移取一个测试样品，最多一次可添加 96 个样品溶
液，进行同时测试。
1.3 测定条件的确定
1.3.1 检测波长的确定 果糖标准溶液、还原糖和
总糖供试溶液 1.0 mL，经 DNS 溶液显色 5 min 后，分
别在 200～1000 nm波长范围内测其吸光度值。
1.3.2 DNS显色时间的确定 果糖标准溶液 1.0 mL，
加入 DNS 显色溶液，分别反应 2、4、6、8、10、12、
14 min后，以 DNS 显色剂调零，在一定波长处测定吸
光度值。
1.3.3 DNS 用量的确定 果糖标准溶液 1.0 mL，分
别加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 的 DNS 溶液
显色后，以 DNS显色剂调零，在一定波长处测定吸光
度值。
1.4 样品测定方法
1.4.1 标准曲线的绘制 分别准确吸取 0、0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0、1.2 mL的果糖标准溶液，加蒸馏水至 2.0
mL，摇匀，经显色反应后。在一定波长处测定吸光度
值，以糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标
准曲线。
1.4.2 样品的显色及测定 准确吸取上述供试溶液
1.0 mL 于 25 mL 的具塞试管中，加入 DNS 显色剂
1.0 mL，摇匀，沸水浴中热浸显色 5 min，迅速用自来
水冷却至室温，再加入 9.0 mL蒸馏水，在一定波长处
测定吸光度值。根据对照品溶液的回归方程计算糖
含量。
菊糖含量(g)=总糖含量(g)－还原糖含量(g) ;
菊糖提取率(%)=菊糖含量(g)/试样重量(g)
× 100。
1.5 方法学考察
1.5.1 稳定性实验 取还原糖供试溶液、总糖供试
溶液各 1.0 mL，经显色反应后，分别放置 0、0.5、1.0、
1.5、2.0、12.0 h后进行测定。
1.5.2 回收率实验 精密吸取 0.5 mL总糖供试溶液
于 6 支试管中，各精密加入 0.3 mL 和 0.6 mL 的果糖
对照品溶液，并分别用蒸馏水稀释至 2 mL，摇匀，经
显色反应后，在一定波长处测定吸光度值。
1.6 数据统计及分析
利用 excel 2003 作图，利用 SPSS 19.0 进行方差
分析。
2 结果与分析
2.1 样品溶液在不同检测波长下吸光度值的变化
规律
将标准溶液、还原糖溶液、总糖溶液和空白对照
溶液分别与 DNS 试剂进行显色反应后，在文献报
道［11－14］的常规波长(480～600 nm)范围内进行多波段
扫描，不同溶液的吸光度值经空白对照溶液调零后，
结果如图 1 所示。
图 1 不同检测波长下各溶液吸光度值的变化规律
Fig.1 The absorbance of different solvent
under different detection wavelength
从图 1 中可看出，在整个检测波长范围内，标准
溶液调零后的吸光度值随着检测波长的增大呈显著
下降趋势，数值介于 0.256～1.258 之间。还原糖和总
糖溶液调零后的吸光度值变化不大，数值分别介于
0.028～0.147 和 0.490～0.610 之间。波长低于 520 nm
296
表 1 不同检测波长下标准曲线的回归方程、相关系数及菊糖的提取率
Table 1 Ｒegression equations，correlation coefficient and the content of the inulin under different wavelength
检测波长(nm) 回归方程 相关系数 菊糖提取率均值(%)
480 A = 1.3989C－0.1390 Ｒ2 = 0.9576 44.56EF
490 A = 1.3442C－0.0890 Ｒ2 = 0.9827 43.65I
500 A = 1.2336C－0.0543 Ｒ2 = 0.9924 44.10H
510 A = 1.1057C－0.0386 Ｒ2 = 0.9955 44.29G
520 A = 0.9840C－0.0290 Ｒ2 = 0.9969 44.33G
530 A = 0.8594C－0.0227 Ｒ2 = 0.9975 44.92CD
540 A = 0.7376C－0.0183 Ｒ2 = 0.9978 44.65E
550 A = 0.6872C－0.0215 Ｒ2 = 0.9982 44.87D
560 A = 0.5357C－0.0122 Ｒ2 = 0.9981 44.87D
570 A = 0.4506C－0.0110 Ｒ2 = 0.9978 45.61A
580 A = 0.3812C－0.0088 Ｒ2 = 0.9981 44.52F
590 A = 0.3137C－0.0080 Ｒ2 = 0.9978 44.98C
600 A = 0.2596C－0.0064 Ｒ2 = 0.9980 45.28B
注:菊糖提取率均值数据后大写字母相同表示在 p ＜ 0.01 水平无极显著差异。
和高于 590 nm 时，空白对照溶液有较强的紫外吸
收，这是由于显色剂本身具有颜色而获得的吸光值，
这将会影响显色液吸光值的可靠性，因此分析波长
应选择在 530 ～580 nm之间，可避开显色剂本身对分
析结果的干扰［12］。
2.2 检测波长的确定
对显色后的标准溶液进行多波段(100～1000 nm)扫
描，然后选择干扰小，吸收较强的波长(480～600 nm)
范围内进行每 10 nm 单位扫描一次，记录吸光度值。
以果糖标准溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐
标，绘制不同波长下的标准曲线，并进行回归分析，
计算不同波长条件下菊糖提取率，结果如表 1 所示。
从表 1 中数据可看出，当果糖标准溶液浓度在
0～2.2 mg /mL范围内，检测波长为 480～600 nm时，标
准曲线的线性关系均良好，计算得到其相应菊糖含
量介于 43.65% ～45.61%之间。经方差分析，不同检
测波长条件下的菊糖含量，部分测试结果之间呈极
显著差异，p ＜ 0.01。因此在检测时选择不同的检测
波长，对最终菊糖含量的测定结果影响较大。但在
本实验中，考虑到检测波长为 550 nm 时，其线性相
关系数最高，确定本实验的检测波长为 550 nm。
2.3 显色时间的确定
3，5－二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热一定时
间，可被还原成红棕色氨基化合物，共热时间的长短
不同可影响生成的红棕色氨基化合物的量，进而影
响吸光度值，结果如图 2 中所示。
在检测波长为 550 nm时，显色时间为 2～14 min
内，不同样品溶液其吸光度值变化趋势不同。显色
反应时间较短(2～6 min)时，随着反应时间的增加，
其吸光度值迅速增大。当反应时间长于 8 min 时，其
吸光度值保持一个较平稳的水平。这是由于较短的
显色反应时间，化学反应不完全，生成棕红色的 3－氨
基－5－硝基水杨酸有限，使得紫外吸收较弱。随着反
应时间的延长，显色时间超过 8 min 时，化学反应发
生较彻底，生成物的量基本保持不变，所以吸光度值
图 2 不同显色时间对吸光度值的影响
Fig.2 The effect of the reaction time
on the figure of the absorbance
变化不大。
2.4 DNS试剂用量的确定
DNS 试剂用量与待测液中还原糖反应的是否完
全，对检测结果影响显著，结果如图 3 所示。
图 3 不同 DNS用量对吸光度值的影响
Fig.3 The effect of absorption on different DNS dosage
当 DNS试剂用量小于 0.8 mL 时，溶液吸光度随
DNS量的增加而迅速增大，当 DNS 试剂用量大于
0.8 mL时，吸光度值则基本保持不变。因此，在考虑
到节省能源及保护环境的情况下，DNS 试剂的最佳
用量为 0.8 mL。
2.5 稳定性实验
不同种类溶液进行稳定性考察，对全面掌握溶液
297
的稳定性，具有重要的参考意义，结果如图 4所示。
从图 4 中可看出，三种测试溶液在显色后，放置
2 h内，测定结果稳定，数值几乎没有变化。但随着时
间的延长，当放置时间达到 12 h 时，其吸光度值迅速
降低，因此进行大批量样品的还原糖含量测定时，可将
放置 2 h内显色液样品集中测定以提高工作效率。
图 4 测试溶液显色后放置时间对测定结果的影响
Fig.4 The effect of absorbance
on storage time after color reaction
2.6 加样回收率实验
由表 2 可看出，果糖平均回收率为 99.61%，ＲSD
值为 2.08%。因此，在此条件下进行测定时，结果是
可靠的。
表 2 加样回收率实验结果
Table 2 The results of recovery test
总糖
样品量
(mg)
加入量
(mg)
测定值
(mg)
回收率
(%)
平均
回收率
(%)
ＲSD
(%)
0.239 0.300 0.529 96.67
0.239 0.300 0.541 100.67
0.239 0.300 0.533 98.00
0.239 0.600 0.834 99.17
0.239 0.600 0.844 100.38
0.239 0.600 0.853 102.33
99.61 2.08
2.7 酶标仪与分光光度计对橡胶草根中菊糖含量测
试结果的比较
分别利用酶标仪和紫外分光光度计，测试同一
批次的橡胶草根，菊糖百分含量如表 3 所示。
表 3 酶标仪和分光光度计测定
橡胶草根中菊糖的测试结果比较
Table 3 The results of insuls in the root of
Taraxacum kok－saghyz Ｒodin
编号
菊糖含量(%)
酶标仪比色法 分光光度计比色法
1 48.57 46.86
2 48.39 46.11
3 47.45 47.99
4 49.13 47.55
5 48.01 46.24
6 49.32 47.15
平均值 48.48 46.98
从表 3 中数据可看出，不同测试仪器对同一样
品的测试结果不同，酶标仪的测试结果略高于分光
光度计。
3 结论与讨论
菊糖广泛分布于菊科、龙胆科、桔梗科等属的植
物中，橡胶草也为菊科植物，虽然有研究报道，橡胶
草中含有菊糖，但到目前为止，没有进行橡胶草中菊
糖含量测定的报道。通过此项研究，建立了橡胶草
根中菊糖含量的快速和批量的测定方法，确定了其
根中菊糖含量约为 46.98%。
在诸多还原糖测定方法中，DNS 比色法因其方
便、快捷的特点而被广泛采用［9］，但实验中一般采用
紫外－分光光度计为测定仪器，由于其样品槽的有
限，在批量和多波长测定时，所用时间较长，操作步
骤繁琐，极大地影响了其工作效率。本研究所用的
酶标仪，其测定原理与分光光度计相同，在合适的波
长(200～1000 nm)范围内，均能达到良好的测定效
果。本实验中所绘制的标准曲线 Ｒ2 最高可达
0.9982，所得结果可以达到实验要求。
DNS 法测定还原糖含量时波长的选择对测定结
果的可靠性至关重要。文献中报道 480［14］、500［15］、
520［16］、530［17］、540［13，18］、550 nm［19］等波长均可作为测
定波长。但是由于被测试溶液的特殊性及干扰因素
的差异性，导致所选波长的不确定性。本研究扫描
了 480～600 nm波长下不同样品的吸光度值，发现总
糖溶液和还原糖溶液在 490～550 nm 波长范围内吸
光度值的变化趋势较一致，对菊糖测定结果有一定
影响。但考虑到标准曲线的相关系数 Ｒ2，最终确定
检测波长为 550 nm。
总糖溶液的提取采用的是盐酸溶液与固体样品
一起加热，提取过程中，可能存在样品中一些可溶性
纤维素和淀粉的水解，导致测定的总糖量较高，进而
影响最终菊糖含量及提取率的数据。但这种提取方
法对实验结果的影响程度，尚待进一步的验证。
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(下转第 301 页)
301
度对结果影响不明显，建立的 LDA和 PLS－DA模型
对 7 种霉菌的留一交互验证结果的整体判别正确
率分别为 87.1%和 87.3%，且尖孢镰刀菌属、青霉
菌属和曲霉菌属间的判别正确率高达 100%。结果
表明，ATＲ－FTIＲ技术可用于谷物中霉菌不同属间
的快速鉴别，尤其对不同菌属的霉菌具有良好的判
别效果。
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