全 文 ：第 23 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　1 月
Vol.23　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2003
分离纯化后的烟草叶片液泡的显微观察
鲁云霞1　王延枝2
(1.安徽医科大学生化教研室 , 合肥　230032)
(2.武汉大学生命科学学院 , 武汉　430072)
摘　要　将分离纯化后的烟草叶片液泡分别置于光镜和电镜下观察得到原生质体 、原生质体释放
液泡的过程 、纯化后液泡的相应照片 ,结果说明我们选用的方法能得到完整的原生质体和液泡 ,且
中央液泡是成熟植物细胞中体积最大的细胞器。
关键词　烟草;原生质体;液泡;光镜及电镜照片
MICROSCOPICOBSERVATION OF VACUOLES ISOLATED
AND PURIFIED FROM TOBACCO LEAVES
LU Yun-Xia1　WANG Yan-Zhi2
(1.Biochemistry Department , Anhui Medical University , Hefei 230032)
(2.College of Life Science , Wuhan University , Wuhan 430072)
Abstract　Observing vacuoles isolated and purified from tabacco leaves under opt ic and elect ronic mi-
croscopes , we obtained photog raphs of protoplasts , process of vacuoles released f rom protoplasts and
vacuoles after purification.The results show that the method w e used could obtain complete proto-
plasts and vacuoles , and the central vacuole is the largest org anelle in one mature plant cell.
Key words　tobacco;pro toplasts;vacuoles;photog raphs under optic and elect ronic microscopes
　　液泡是成熟植物细胞中的大型细胞器 ,具有重
要的生理功能 ,这主要表现在:(1)液泡是各种养料
和代谢产物的贮藏室[ 1] ,其成分随着组织发育或
分化的阶段 、植物种类或生态环境及不同代谢产物
而异;(2)液泡中含有多种水解酶 ,具有自我降解作
用 ,有类似于动物细胞溶酶体的功能;(3)液泡在维
持细胞内环境的稳定中起主要作用 ,因为液泡内液
可提供较大的缓冲能力;(4)液泡和液泡内膜还参
与一些特殊的代谢过程[ 2] 。
鉴于国内尚未见有关的研究报道 ,我们从烟草
叶片的叶肉中经酶解得到原生质体 ,再分离纯化得
到一定量的完整液泡 ,在光学显微镜和电子显微镜
下观察并拍照 。通过分离纯化得到完整的原生质
体和液泡 ,为进一步研究液泡及其膜蛋白的生理生
化特性提供了依据 ,也为提高细胞液的浓度 ,增强
植物抗旱 、抗寒 、抗盐碱能力打下牢固的基础[ 5] 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
实验材料红花烟草(Nicot iane tabacum L.G-
80)种子由武汉大学植物生殖生物学研究室提供 ,
浸种去皮 ,播于筛过的细土上 ,待长至四片叶时移
栽 ,自然光下生长 ,取 1 ～ 3个月的新鲜叶片作供试
材料 。
第一作者简介:鲁云霞(1969-),女 ,硕士 ,生物化学专业。主要从事生物化学教学和科研工作。
收稿日期:2002-07-16
1.2　试剂
Hepes(N-2-羟乙基派嗪-N-2-乙磺酸)
为西德进口分装 , Ficoll-400为 Pharmacia 公司进
口分装 , DTT 为 Sigma 分司产品 , 果胶酶(pecti-
nase)为 Sewa 公司产品 ,其余均为国产分析纯试剂
1.3　研究方法
1.3.1原生质体的分离纯化方法
取新鲜烟草叶片 ,浸于 70%乙醇中表面灭菌
30秒 ,蒸馏水冲洗干净 ,用尖头镊撕去下表皮 ,覆
盖在含 0.5%纤 维 素酶 , 0.3%果 胶 酶的
0.6 mol·L-1 甘 露醇 , 3.5 mmol · L-1 CaCl2 ,
0.75 mmol·L -1 KH2PO4 , 25 mmol ·L-1 Mes -
NaOH(pH5.8)溶液表面 , 28 ～ 30℃酶解 6小时 ,每
隔 1小时轻轻摇荡酶解液以利原生质体的释放 ,酶
解完毕后用 200目镍网过滤除去消化的组织 、细胞
团和细胞壁残留物 ,滤液在 500 r·min-1下离心 3
～ 5 min弃去上清 ,沉淀用 0.55 mol·L-1甘露醇 ,
25 mmol·L-1 Tris-HCl(pH6.5)溶液重复上述步
骤洗 2 次 ,最后悬浮在 0.55 mol·L-1甘露醇 , 25
mmol·L-1 Tris-HCl(pH6.5)溶液中 ,铺在 21%
(w/v)蔗糖溶液上 , 500 r·min-1离心 10分钟 ,取梯
度界面上的绿色溶液即为纯化的原生质体[ 3] 。
1.3.2　完整液泡的分离纯化方法
向上述原生质体制剂中加入 1.75 倍体积的
25 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5)溶液 ,充分混匀 ,
35℃温育 3分钟 ,压迫使其通过 100 mm×0.2 mm
的长注射器针头 ,四层纱布过滤 , 2000 r·min-1离
心 10 分钟 ,沉淀用含 0.5 mol·L-1山梨醇 , 0.25
mmol·L-1 EDTA -Tris , 1.0 mmol·L-1 DTT
(pH7.2)的悬浮液轻轻悬浮 ,小心铺在下层为 8%
(w /v)Ficoll ,上层为 2%(w/v)Ficoll(均溶于悬浮
缓冲液中)的梯度溶液上 , 800 r·min-1离心 30分
钟 ,取 2%～ 8%Ficoll界面上的溶液即为纯化的液
泡制剂[ 3] 。
1.3.3　电镜样品制备方法
电镜负染制片采用通用的悬滴法 ,即纯原生质
体或液泡制剂稀释至适当浓度(10-5mL-1)后 ,滴
在有 Fo rmar的载网上 ,用滤纸吸去多余溶液 ,滴加
2%磷钨酸(pH6.5)负染 10秒 ,吸去多余染液 ,晾
干后置电镜(H-8100型)下观察 ,根据需要选用适
当的放大倍数。
扫描电镜制片采用通用的办法 ,即将纯原生质
体或液泡制剂用 0.25 mol·L-1蔗糖 ,2.5%戊二醛
固定 2 小时 , 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.2)清
洗 3次 , 2%锇酸固定 3 小时 , 0.1 mol·L-1磷酸缓
冲液清洗三次 ,用逐级增加浓度的乙醇脱水 ,每级
20 ～ 30 min ,进行临界点干燥和喷金 ,在日立 S -
450型扫描电镜下观察 ,采用适当 的放大倍数[ 4] 。
1.3.4　光学显微镜样品制备方法
取一滴含有原生质体或液泡的制备液滴于载
玻片上 ,光镜下观察 。
2　结果分析
2.1　原生质体和液泡的光镜观察
在光学显微镜下观察纯化的原生质体 ,可以发
现叶绿体均匀分布在质膜内侧(图版 I:1),此即为
“非极化”的原生质体 ,当用 0.02%中性红染色时 ,
可观察到原生质体中央很大部分为液泡所占据。
将原生质体用低渗溶液处理 ,然后在光学显微
镜下观察原生质体释放液泡的过程 ,可以发现“非
极化”的原生质体开始发生“极化”现象 ,即叶绿体
向一侧迁移 ,留下相对应质膜的另一侧无叶绿体存
在 ,然后液泡从这段质膜的缺口中缓慢释出 ,在释
放过程中会暂时被拉长变形 ,一但完全脱出后又恢
复为球状(图版 I:2 ,3)
在光镜下可观察到纯化后的完整液泡(图版
I:4)。由于液泡为空泡状结构 ,在光镜下反差很
小 ,肉眼无法看清 ,因此常用 0.02%中性红染色 。
光镜下观察统计的结果表明液泡制剂中混入的原
生质体不超过 2%(每 200 个液泡中只含 3 ～ 4 个
原生质体)。
又对原生质体和液泡进行了得率实验 ,即以
1g 新鲜叶片为起点 ,从分离得到较纯的原生质体
再纯化得到液泡 ,其得率用每毫升所含原生质体或
液泡数表示 ,结果见表 1。
表 1　原生质体和液泡的平均得率
Table 1　Average number of Pro toplasts and Vacuoles
内容名称
Contents
原生质体
Protoplast s
液泡
Vacuoles
得率(mL -1)
Quantity
5.6×106 4.48×105
2.2　原生质体和液泡的电镜观察
在电镜下观察了原生质体和液泡的形状特征
(图版 I:5 ～ 8),发现原生质体为球形 ,其表面有许
多凹陷 ,显示有局部的细微结构 ,而液泡为空泡状
结构 ,负染染料能渗进去 ,显示其内部无细微膜状
结构 。
371 期　　　　　　　　　　　　　　鲁云霞等:分离纯化后的烟草叶片液泡的显微观察
从上述观察结果可得出如下结论:(1)我们选
用的实验方法能分离出完整的原生质体和液泡 ,且
液泡的纯度可达 98%;(2)根据电镜观察结果发现
液泡是原生质体中体积最大的细胞器;(3)在电镜
下观察发现原生质体表面具细微结构 ,而液泡膜表
面光滑 ,其内部无膜状结构。
3　讨论
从烟草叶肉细胞中我们首次成功地分离出完
整的液泡 ,这为从其它植物细胞中分离完整液泡开
创了可行的技术途径 ,为深入研究液泡的生理功能
奠定了基础 ,不足之处是液泡提取方法较繁琐 ,且
其得率不够高。今后 ,我们努力的方向应是进一步
完善并简化液泡的分离纯化方法。
参　考　文　献
1.Matile P , Wiemken A.Encyclopedia of Plant Physiology.
Berlin:Springer-Verlag , 1976 , 3:255 ～ 287
2.Boller T , Wiemken A.T the central vacuoles in mature plant
cell.Ann Rev Phy siol , 1986 , 37:137 ～ 164
3.Fung L E , Ma Huan-cheng , Wang Sha-sheng.X-ray
microanaly sis of ion distribution in salt tolerance and salt in-
tolerant poplar geno types.J Beijing Forestry Univ(English
Ed), 1996 , 5(2):23 ～ 30
4.鲁云霞 ,李如亮 , 王延枝.烟草叶片液泡内氨基酸成分研
究.氨基酸和生物资源 , 1997 , 19(4):10 ～ 13
5.洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京:科
学出版社 , 1980
图　版　说　明
图版 I　原生质体和液泡的光镜及电镜照片
1.原生质体的光学显微镜照片;2.原生质体发生极化现
象;3.液泡正在释放 ;4.纯化的完整液泡照片;5.原生质
体的扫描照片;6.原生质体的负染照片;7.液泡的负染照
片 ;8.液泡中掺入染料的负染照片(1.×400;2 , 3.×
300;4.×200;5.×1200;6 , 7.×1300;8.×1330)
Explanation of plates
Plate I 　Photographs of Pro toplasts and Vacuoles under Optic
and Electronic M icroscopes
1.Optical photog raph of protoplasts;2.Protoplasts occur po-
larizing phenomena;3.Protoplasts are releasing vacuoles;4.
Optical photograph of intact vacuoles after purification;5.
Scanning photograph of protoplast;6.Negative staining pho-
tog raph of protoplast;7.Negative staining photograph o f vac-
uole;8.Negative staining pho tog raph of dye penetrating into
vacuole(1.×400;2 , 3.×300;4.×200;5.×1200;6 , 7.×
1300;8.×1330)
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