全 文 ：第 21 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　7 月
Vol.21　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2001
影响根癌农杆菌介导水稻转化的因素分析
尹鸿瑛　安韩冰　安利佳
(大连理工大学生物工程系 ,大连　116012)
摘　要　根癌农杆菌与来自水稻成熟种子盾片的愈伤组织共培养 ,将 GUS基因导入水稻愈伤组
织 ,并获得了转基因植株。通过比较影响根癌农杆菌转化频率的各种因素 ,表明激素配比为 2 , 4
-D 1mg/L 、TDZ 0.5mg/L 、NAA 1mg/L 时 ,可以大大促进籼稻愈伤组织的分化能力;酚类化合物
的加入使农杆菌的转化频率提高 8.9%～ 23.5%;共培养时农杆菌的稀释方式及适当调整潮霉素
(hygB)的使用浓度影响到农杆菌的转化频率 。
关键词　水稻愈伤组织;植株再生;根癌农杆菌;转化频率
ANALYSIS OF FACTORS AFFECTING THE EFFICIENCYOF
AGROBACTERIUM -MEDIATED RICE TRANSFORMATION
YIN Hong -ying 　AN Han-bing　AN Li-jia
(Bioenqineering Depar tment , Dalian University of Techno logy , Dalian , 116012)
Abstract　The rice calli w ere infected and transfo rmed by A.tumefaciens strain LBA4404 harboring
Ti plasmid pTOK233.After continuous hygB selection , stable hyg romycin-resistant , GUS -posi-
tive calli and plants were recovered.Some putative transgenic R0 plants w ere conducted wi th molecu-
lar assay s , the results indicated that foreign genes had been stably integ rated in the genome of t rans-
genic rice.The results suggested that the ingredients of holmen of 2 , 4-D 1mg/L 、TDZ 0.5mg/ L 、
NAA 1mg/L were efficient for Agrobacterium -mediated t ransformation of rice , besides , the addi-
tion of AS increased the eff iciency of transformation by 8.9%～ 23.5%.At the same time , we found
that bo th the dilution of ag robacteria and the adjusting of the concentration of hygB af fected the ef fi-
ciency of t ransformation.
Key words　rice calli;t ransgenic rice;A.tumefaciens;f requency of t ransformation
　　自 1988年以来 ,水稻遗传转化技术已取得了显
著进展 ,相继建立了目的基因直接转化法(如电击
法 、PEG法和基因枪法等)和间接转化法(如农杆菌
介导法)。直接转化法虽然有许多优点 ,但因其操作
复杂 ,外源基因插入的多拷贝性 、不完整性及基因失
活频率较高等缺点 ,目前人们逐渐倾向于用农杆菌
介导法转化水稻 。随着农杆菌转化机理的深入阐
明[ 1]和转化方法的不断改进 ,农杆菌介导法转化水
稻成功的例子在国内外已有报道[ 2] 。
水稻的根农杆菌转化研究已经引起人们的普遍
关注 ,但尚未成为一种常规的水稻转化方法。我们
通过报告基因的导入 ,优化各种参数 ,从而建立起一
良好的转化体系 ,为今后利用该体系导入有益的外
源基因奠定基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料 、供试菌株及质粒和培养基
第一作者简介:尹鸿瑛(1976-),女 ,博士研究生 ,主要从事植物生理 、分子生物学 ,组织培养研究。
收稿日期:2001-4-16
本实验所用水稻材料(Oryza sativa L.)ZH -8
(粳稻)由中科院遗传所田文忠研究员提供;明恢 63
(籼稻)、IR72(籼稻)和台北 309(粳稻)由中国水稻
所颜秋生研究员提供;铁 8467(粳稻)、铁 8773(粳
稻)和铁 8992(粳稻)由辽宁省铁岭农科院提供 。
农杆菌菌株为 LBA4404 ,供试质粒为 pTOK233
由东北师范大学遗传所王兴智教授提供 ,含有 GUS
报告基因 ,启动子为 35S 启动子 ,及筛选标记基因
hpt和 npt Ⅱ 。在 GUS 基因编码区内有一内含子 ,
因此 GUS基因只能在植物中表达而不能在细菌中
表达(图 1)。
本实验中使用的培养基(表 1)所示。
图 1 质粒 pTOK233 图谱
Fig.1　Gene map of pTOK 233
　　表 1 应试植物培养基一览表
Table 1 Compostition of medium
Medium Composition
NMBi
NMB , Glutamine 250mg/ L , casamino acids 300mg/ L , 2 , 4-D 2mg/ L , sucrose 30g/ L , gelrite2.
2g/ L
NMBr
NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , TDZ 0.5mg/ L , sucrose 30g/
L , gelrite 2.4g/ L
MMBg-1 MMB , Glutamine 250mg/ L , casamino 300mg/ L , sucrose 20g/ L , agar 6.5g/ L
NMB-As1 NMB , acetosy ringone 100μmol/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , sucrose 20g/ L , gelrite 2.2mg/ L
NMB-As2 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline500mg/ L , casamino acids 300mg/ L , 2 , 4 -D 2mg/ L , su-crose30g/ L , Gelrite 2.5g/ L acetosy ringone 100μmol/ L
NMB-h.c NMB , Glutamine 250mg/ L , proline500mg/ L , casamino acids 300mg/ L , 2 , 4 -D 2mg/ L , su-
crose30g/ L , Gelrite 2.2g/ L hygB 50mg/ L , cefotaxime 250mg/ L
NMB-h NMB , Glutamine 250mg/ L , proline500mg/ L , casamino acids 300mg/ L , 2 , 4 -D 2mg/ L , su-
crose30g/ L , Gelrite 2.2g/ L hygB 50mg/ L
　　NMB:N6 大量元素 , MS 微量元素 , B5 有机成分;MMB:MS 大量元素 ,MS 微量元素 , B5有机成分 。
1.2　各种基因型愈伤组织诱导频率的比较
将水稻成熟胚转移至 NMBi上进行愈伤组织的
诱导。培养 3 ～ 5 天后 ,胚盾片端开始膨大 ,并生出
小芽。大约 5 ～ 7天后从盾片上可诱导出水稻愈伤
组织 ,10 ～ 15 天后将长出的芽去除 ,只留下诱导出
的愈伤组织 ,统计各种基因型愈伤组织诱导频率。
1.3　培养基对籼稻愈伤组织分化能力的影响
水稻愈伤组织在激素仅为 2 , 4-D 的培养基上
长期继代培养 ,分化能力明显降低 。如果在粳稻中
可以简单地降低 2 ,4-D 浓度配合使用 NAA 及少
量的 KT ,可以改进愈伤组织的质量 ,提高分化能
力。对于较难培养和分化的籼稻而言达到此目的 ,
需要采取较为复杂的措施 。我们就此选取了 7种继
代培养基配比(表 2),比较了它们对籼稻明恢 63愈
伤组织分化能力的影响。
1.4　籼 、粳稻对 hygB的敏感性实验
粳稻 ZH8 , T8773和籼稻明恢 63对 hygB 的敏
感度存在明显差别 ,我们选取一组 hygB 浓度梯度 ,
比较愈伤组织生长状态的反应
1.5　农杆菌介导的水稻转化
用灭 菌 的 牙 签挑 取 根 农 杆 菌 LBA4404
(pTOK233)单菌落 ,分别在 AB和 AB-As(其中含
有 100μM AS)培养基中 28℃,180rpm 振荡培养 ,培
养基中都含有卡那霉素(Kanamycin)50mg/L 和潮
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霉素 B(hygB)50mg/L ,培养大概 2 ～ 3天 ,测菌液
OD值 ,当 OD 值约为 0.5时 , 将菌液离心后 ,弃上
清 ,用同体积 NMB或 NMB-As1(含有 100μM AS)
重悬 ,将水稻成熟胚诱导愈伤组织(直径 2 ～ 3mm)
在上述菌液中浸没 3min后 ,吸去多余的菌液 ,将其
置于 NMB 或 NMB-As2培养基上的滤纸上 , 26℃
暗培养 3天。
然后 ,将愈伤组织转至抗性筛选培养基 ,(NMB
-h.c ,含头孢及潮霉素 B), 26℃暗培养 , 再转至
NMB-h(不含头孢)培养基中继续选择培养 ,经 2-
3次继代培养 ,进行抗性愈伤组织的分化。
抗性愈伤组织转至含 hygB 50mg/L 的 NMBr
上 ,待分化出的抗性小芽长至 2 ～ 3cm 时 ,将其转至
含 hygB 20mg/L 的 MMBg 再生苗继代培养基上 。
待长成完整的植株后 ,将其从固体培养基转至营养
液中开放式培养 ,待生成新根后 ,将苗转入花盆中培
养。
　　表 2 七种继代培养基一览表
Table 2 Composition of seven subculture media
Medium Composition
NMBs-1 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline500mg/ L , casamino acids 300mg/ L , 2 , 4 -D 2mg/ L , su-
crose30g/ L , Gelrite 2.2g/ L
NMBs-2 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1MG/
L , Kt 0.5mg/ LSucrose 30g/ L , gelrite 2.2g/ L
NMBS-3 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1mg/
L , 6-BA0.5mg/ L , sucrose 30g/ L , gelrite2.2g/ L
NMBs-4 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1mg/L , TDZ0.5mg/ L , sucrose 30mg/ L , gelrite 2.2g/ L
NMBs-5 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1MG/L , Kt 0.5mg/ LSucrose 15g/ L ,mannitol 15g/ L , gelrite 2.2g/ L
NMBs-6 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1mg/L , 6-BA0.5mg/ L , sucrose 15g/ L , mannitol 15g/ L , gelrite2.2g/ L
NMBs-7 NMB , Glutamine 250mg/ L , proline 500mg/ L , casamino 300mg/ L , 2 , 4-D 1mg/ L , NAA 1mg/L , TDZ0.5mg/ L , sucrose 15mg/ L , mannitol 15g/ L , gelrite 2.2g/ L
1.6　组织化学法检测报道基因GUS 的表达
将待测水稻材料浸没在含有 1%Triton X-100
的NaPO4(50mM pH 7.0)的缓冲液中 , 37℃, 1 小
时。弃上述缓冲液 ,加入新鲜的含有 20%甲醇的
1.0mM X-Gluc NaPO4缓冲液 , 37℃,过夜。叶组
织需经 70%乙醇清洗 2 次 ,每次 1小时后 ,再做检
测。
1.7　转基因水稻植株的分子鉴定
1.7.1　PCR检测
从再生成完整的 hygr 抗性植株中随机选取转
化克隆 ,提取叶片 DNA 进行 PCR检测 , 水稻 DNA
抽提采用 CTAB法[ 3] ,聚合酶链式反应(PCR)检测
GUS的转移
GUS基因(410bp片段)扩增引物:
5 primer(P1):ACGTCCTGTAGAAACCCCAA
3 primer(P2):AGTTCAGTTCGTTGTTCACACA
94℃预变性 1min ,(98℃10sec , 55℃30sec , 72℃
30sec)×35 ,待循环结束后 ,71℃继续延伸 10min ,取
出样品于 1.5%的 Agarose 电泳检测。照相记录电
泳结果
1.7.2　PCR-Southern 检测
将 PCR扩增产物进行 PCR-Southern检测 ,探
针为同位素标记的 GUS基因编码区。
1.7.3　Southern blot检测
将hygr 抗性植株叶片总 DNA 经 Hind Ⅲ酶切
后作 Southern杂交。用 GUS基因片段作探针在抗
性植株中检测杂交信号。
2　结果与分析
2.1　各种基因型愈伤组织诱导频率
将水稻成熟胚转移至 NMBi上进行愈伤组织的
诱导。培养 3 ～ 5 天后 ,胚盾片端开始膨大 ,并生出
小芽。大约 5 ～ 7天后从盾片上可诱导出水稻愈伤
组织 ,10 ～ 15 天后将长出的芽去除 ,只留下诱导出
的愈伤组织 ,统计各种基因型愈伤组织诱导频率(表
3)。
4393 期　　　　　　　　　　　　　　尹鸿瑛等:影响根癌农杆菌介导水稻转化的因素分析
　　表 3 水稻愈伤组织诱导频率一览表
Table 3 The inducement frequency of different rice variety
基因型
Gene type
胚数
No.of embryo
出愈胚数
No.of calli
诱导频率/ %
Inducementfrequency
ZH8 178 170 95.5
T8467 193 132 68.4
T8773 201 187 93.0
T8992 185 160 86.5台北 309 91 42 46.2明恢 63 92 77 83.7
IR72 94 46 48.9
　　表 3结果表明 ,ZH8 、T8773为粳稻品种中愈伤
组织诱导频率较高的基因型 ,且愈伤组织生长状态
良好;而 T8467 和台北 309 愈伤组织诱导频率较
差;T8992虽然愈伤组织诱导频率较高 ,但最初诱导
出的愈伤组织不定根生长现象严重 ,较难抑制 。籼
稻明恢 63的诱导频率明显高于 IR72 ,且愈伤组织
状态较好 ,接近粳稻 ,多呈鲜黄颗粒状 ,而 IR72 诱
导出的愈伤组织结构松软 ,多呈水渍状。因此我们
选择了愈伤组织诱导频率较高且生长状态良好的基
因型 ZH8 、T8773和明恢 63进行根癌农杆菌转化实
验。
2.2　培养基对籼稻愈伤组织分化能力的影响
我们选取了 7 种继代培养基配方(表 2),比较
了它们对籼稻明恢 63愈伤组织分化能力的影响(表
4)。
　　表 4 不同继代培养基对明恢 63愈伤组织分化能力的影响
Table 4 The influence of media on Minghui-63 redifferentiation frequency
培养基
Medium
愈伤组织块数
No.of calli/A
分化的愈伤组织块数
redifferentiation/B
愈伤组织的分化频率
/ %F requency(B/A)
NMBs-1 50 7 14.0
NMBs-2 53 12 22.6
NMBs-3 47 13 27.7
NMBs-4 52 23 44.2
NMBs-5 50 13 26.0
NMBs-6 48 16 33.3
NMBs-7 54 26 48.1
　　在表 4中可以看出 ,激素配比为 2 , 4-D 1mg/
L 、TDZ 0.5mg/L 、NAA 1mg/L 时 ,可以大大促进籼
稻愈伤组织的分化能力 ,而用甘露醇配合使用蔗糖
来调节培养基的渗透压 ,可以改善愈伤组织状态 ,且
可提高其分化能力 。Lai and Liu(1988)和 R.K.Jain
等(1996)[ 4] 分别在粳稻和籼稻愈伤组织培养中运
用甘露醇来调节培养基的渗透压 ,使得愈伤组织更
紧密 、更胚性化 ,在提高愈伤组织分化上取得了良好
效果。另外 ,培养时间延长会使愈伤组织在细胞分
裂进程中染色体变异的可能性增大 ,形态发生潜力
减弱甚至丧失 。[ 5]
2.3　籼 、粳稻对 hygB的敏感性实验
粳稻 ZH8 , T8773和籼稻明恢 63对 hygB 的敏
感度存在明显差别 ,我们选取一组 hygB 浓度梯度 ,
获得愈伤组织生长状态的差别反应如(表 5)及(图
版-1 ,图版-2)所示 。从表 5 , 图版-1和图版-2
中都可看出 ,经过四个星期的筛选 ,多数明恢 63 的
愈伤组织对 hygB 非常敏感 ,其敏感程度要比粳稻
愈伤组织强许多 。在 hygB 10mg/L 时 ,生长几乎完
全被抑制 。
　　表 5 不同基因型水稻对 hygB的敏感性反应一览表
Table 5 HygB sensitivity of different rice species
基因型
Genetype
hygB
0mg/ L
hygB
10mg/ L
hygB
20mg/ L
hygB
30mg/ L
hygB
40mg/ L
hygB
50mg/ L
HygB
60mg/ L
hygB
70mg/ L
ZH8 + + + - -- -- --- ---
T8773 + + + - -- -- --- ---
明恢 63 + --- --- --- --- --- --- ---
　　+:生长正常;-:生长受一定抑制;--:生长受抑制;---:生长完全受抑制。
440 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
　　由此 ,我们在筛选粳稻ZH8和 T8773转化子时
选择 hygB浓度为 50mg/L ,明恢 63则为 10mg/L 。
2.4　抗性克隆的获得
愈伤组织与根癌农杆菌共培养 3天后的愈伤组
织直接转入含 hygB和头孢霉素的培养基 NMB.h.c
上进行一次筛选(图版-3),在 NMB.h 培养基上选
择培养 2 ～ 3次 ,每次 3 ～ 4周 ,然后对抗性克隆进行
统计 。
植物和菌株相互作用的基础是细菌具有趋化
性 ,即菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋化
反应。研究表明 ,根癌农杆菌对一些酚类化合物具
有趋化性。根癌农杆菌 Ti质粒的 Vir 区基因对 T
-DNA的转移起介导作用 ,而这些酚类化合物正是
Vir 区基因活化的诱导物 。双子叶植物受伤细胞提
取液中富含这些酚类化合物 ,而单子叶植物中却极
少发现 ,这也正是根癌农杆菌转化双子叶植物优于
单子叶植物的原因所在。这些酚类化合物包括乙酰
丁香酮(简称 AS)、儿茶酚 、没食子酸 、焦性没食子
酸 、(-羟基苯甲酸和香草醛等 。Chan 等(1993)[ 6]
用 PSC(potato suspension culture)与根癌农杆菌共
培养转化水稻 ,提高了转化频率 ,PSC富含酚类化合
物AS和 SA(Sinapinic acid)。在所有研究的酚类化
合物中 ,已证明 AS 为诱导效果最佳的酚类化合物 。
因此 ,我们在实验中添加适量的 AS ,从表 6中可以
看出其促进了根癌农杆菌的转化 ,达到了预期的效
果。
　　表 6 乙酰丁香酮对抗性克隆获得的影响
Table 6 Effect of As on achieving resistant calli
水稻品种
Gene type
As(μM) 共培养愈伤组织数
Total No.of calli(A)
抗性愈伤组织数
No.of resistant calli(B)
获得频率/ %
Frequency(B/ A)
ZH8 0 128 11 8.6
ZH8 100 134 43 32.1
T8773 0 118 7 5.9
T8773 100 125 39 31.2
明恢 63 0 62 2 3.2
明恢 63 100 58 11 19.0
2.5　Hyg B对植株的再生影响
潮霉素抗性基因 HPT 是从大肠杆菌克隆和改
造而成 , 在水稻遗传转化中应用很广的筛选标
记[ 7 ,8] 。从抗性愈伤组织中挑选鲜黄 、致密 、胚性良
好的愈伤组织转至含有 50mg/L hygB(ZH8 ,T8773)
或10mg/L(明恢63)的 NMBr-1或NMBr-2培养
基上进行 1 ～ 2周的暗培养 ,然后转为光(16hrs)和
暗(8hrs)的交替培养。大约两周后 ,ZH8的抗性愈
伤组织分化出芽点(图版-4),并可进一步分化出抗
性小芽;T8773和明恢 63抗性愈伤组织的生长状态
与相同形态的非转化愈伤组织一样 ,在 hygB 存在
的条件下愈伤组织的颜色从鲜黄色逐渐变成苍白
色 ,丧失分化能力 ,有的褐化最终死去;但是如果将
选择压去除 , T8773和明恢 63抗性愈伤组织都可正
常分化出绿芽。这说明抗性愈伤组织在分化过程中
受到 hygB的严重阻遏作用 ,且对不同基因型造成
的影响程度不同 ,故基因型间转化效率的差别极
大[ 9] 。
将ZH8 、T8773 、明恢 63经抗性筛选得到的绿
芽转入苗再生培养基中(ZH8和 T8773的 hygB 选
择压为 20mg/L ,明恢 63为 5 mg/L),经 2 ～ 3周后
的培养 ,ZH8 的绿芽均可分化出完整的抗性植株 ,
而 T8773和明恢 63的绿芽只有部分绿芽可以再生
成正常植株(图版-5),其余绿芽不但不能进一步生
长成完整的植株 ,反而逐渐变黄 ,变褐 ,最终死去。
根据上述结果可以看出 ,在对不同基因型水稻
进行转化时 ,通过适当调整抗生素 hygB 的使用浓
度和方法 ,才能获得理想的转化效果。
2.6　GUS 组织化学检测
用X-Gluc溶液对潮霉素抗性愈伤组织进行组
织化学染色分析的结果表明 ,绝大部分潮霉素抗性
愈伤组织可染成兰色(图版-6),这说明 GUS 基因
在转化的愈伤组织可得到正常表达 。实验结果还表
明 ,在抗性愈伤组织中存在着不能被染色的部分 ,这
说明愈伤组织转化与非转化细胞是嵌合生长的。
2.7　转基因水稻植株的分子鉴定
2.7.1　PCR检测
从再生成完整的 hygr 抗性植株中随机选取转
化克隆 ,提取叶片 DNA 进行 PCR检测 , 在所检植
株中均检测到 410bp 的 GUS 目标带 ,证明 hyg r 抗
4413 期　　　　　　　　　　　　　　尹鸿瑛等:影响根癌农杆菌介导水稻转化的因素分析
性植株含有完整的 GUS 基因片段 ,而非转化处理的
对照组无目标带显示(图 2)。
图 2　水稻 hygr 植株的 PCR检测
Fig.2 PCR result of regenerated hygr plantlet
A:100bpDNA ladder marker
B:作为阳性对照的 LBA4404/pTOK233 质粒
C:作为阴性对照的非转化水稻植株
D-H:经根癌农杆菌感染的水稻 hyg r植株
2.7.2　PCR-Southern 检测
将 PCR扩增产物进行 PCR-Southern检测 ,探
针为同位素标记的 GUS基因编码区。最后全部扩
增产物电泳条带均显示出杂交信号(图 3),进一步
证明了 PCR扩增出的目标带是GUS基因片段。从
而认为 ,GUS基因已被转入到水稻的细胞中。
图 3　水稻 hyg r植株的 PCR Southern blot检测
Fig.3　PCR Southern blo t result of regenerated hygr plant
A:作为阳性对照的 LBA4404/ pTOK233 质粒
B:作为阴性对照的非转化水稻植株
C-I:经根癌农杆菌感染的水稻 hygr 植株
2.7.3　Southern blot检测
将 hygr 抗性植株叶片总 DNA 经 Hind Ⅲ酶切
后作 Southern杂交。用 GUS 基因片段作探针在抗
性植株中检测到杂交信号 ,而对照(未经转化植株)
无杂交信号(图 4)。进一步证明了外源基因已整合
进水稻基因组中。
3　讨论
我们发现农杆菌感染植物后 ,只有从那些有很
强的再生能力和整合转化能力的感受态细胞才能得
到转化植株 ,而只有那些具有明显的创伤反应的植
物才能诱导伤口邻近的细胞形成大量的这类感受态
细胞 ,因此选择合适的转化受体材料是实现转化成
功的首要考虑因素。 Li 等(1992)[ 10] 、Hiei 等
(1994)[ 2]和 Rashid (1996)[ 11] 等认为 ,用水稻分生
组织或盾片来源的愈伤组织作为转化受体是转化成
功的关键因素 。我们用成熟胚来源的愈伤组织也得
到了一定的转化频率 。
激素配比为 2 , 4-D 1mg/L 、TDZ 0.5mg/ L 、
NAA 1mg/L 时 ,可以大大促进籼稻愈伤组织的分
化能力 ,而用甘露醇配合使用蔗糖来调节培养基的
渗透压 ,可以改善愈伤组织状态[ 12] ,且可提高其分
化能力。 Lai and Liu(1988)和 R.K.Jain 等
(1996)[ 4]分别在粳稻和籼稻愈伤组织培养中运用
甘露醇来调节培养基的渗透压 ,使得愈伤组织更紧
密 、更胚性化 ,在提高愈伤组织分化上取得了良好效
果。抗性愈伤组织在分化过程中受到 hygB的严重
阻遏作用 ,且对不同基因型造成的影响程度不同 ,基
因型间转化效率的差别极大[ 9] 。
农杆菌有效地附着于植物细胞上是保证其将 T
-DNA送入寄主植物细胞的前提 ,目前已经知道根
癌农杆菌染色体上至少有 6个基因与其附着功能有
关(Hawe , K.C., 1989;Thomashow , M .F .,
1987)[ 13 , 14]它们或通过影响鞭毛形成及行动 ,或通
过影响葡聚糖的合成以及细菌细胞壁脂多糖(LPS)
的成分来最终影响农杆菌对植物的附着。Lippin-
co tt等 (1980)[ 15]认为 , LPS 是细菌识别植物细胞
壁附着位点的成分 ,因此说不同农杆菌菌株染色体
背景差异对其附着功能产生一定影响 ,因此选择合
适菌株对成功转化水稻也是一项需进一步研究的工
作。另外 ,在共培养体系中添加对农杆菌表现强烈
趋化性的精氨酸类物质 ,能刺激细菌鞭毛的转动并
提高其菌体泳动能力 ,有利于细菌去寻找和发现宿
主细胞表面的附着位点。但是究竟选择何种最佳生
理状态和发育进程的受体材料 ,尚待进一步的探索
研究 。
图　版　说　明
1.ZH8 愈伤组织经 hygB 梯度筛选 , 4 周后的生长情况。
442 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
图 4　水稻 hygr 植株的 Southern blo t检测
Fig.4　Southern blot result of regenera ted hyg r plantlet
A:作为阳性对照的 LBA4404/ pTOK233 质粒
B:未经 HindI II 酶解的水稻非转化植株作为阴性对照
C:经 HindI II 酶解的水稻非转化植株作为阴性对照
D:未经 HindII I 酶解的水稻 hyg r植株
E:经 HindI II 酶解的水稻 hygr 植株
2.明恢 63 愈伤组织经 hygB 梯度筛选 , 4周后的生长情况 。
3.右:经根农杆菌感染 , 经 50mg/ L hygB 筛选 3 周后愈伤组
织生长情况。左:未经根农杆菌感染 ,经 50mg/ L hygB 筛
选 3周后愈伤组织生长情况。
4.右:经根农杆菌感染 , 经 50mg/ L hygB 筛选 ,愈伤组织分
化培养生长情况。左:未经根农杆菌感染 , 经 50mg/ L
hygB 筛选愈伤组织分化培养生长情况。
5.经根农杆菌感染 ,经 50mg/ L hygB 筛选愈伤组织再生得
到的 hygr 植株。
6.经根农杆菌感染的水稻愈伤组织 GUS 染色检测。
Explanation of Plate
1.ZH-8 calli screened by 50mg/ L hygB for 4 w eeks
2.Minghui-63 calli screened by 50mg/ L hygB for 4 w eeks
3.Right:screening by 50mg/ L hygB fo r 3 weeks after cocul-
tured with A.tumefaciens strain Left:control
4.Right:redifferentiaation after screening by 50mg/ L hygB
Left:control
5.Regeneration of 50mg/ L hygB screened calli
6.GUS staining of A.tumefaciens cocultured calli
参　考　文　献
1.Chilton M D , Drummond M H , Merlo D J , et al.Stable incor-
po ration of plasmid DNA into higher plant cells:the molecular
basis of crown gall tumorigenesis.Cell , 1977(11):263 ～ 271
2.Yukoh hiei , Shozo ohta , Toshihiko Komaria and Takashi
Kumashiro efficient transformation of rice meditated by a-
g robacterium and sequence analy sis of the boundaries o f the T
-DNA the plant journal 1994 6(2)271～ 282
3.Murray M G , Thompson W F.Rapid isolation of high molec-
ular weight plant DNA.Nucleic Acids Res , 1980(8):4321～
4325
4.R.K.Jain ,(1996)plant celll rep.15:449 ～ 454
5.李文安.植物细胞分化及试管植物.见:余叔文编.植物生
理与分子生物学.北京:科学出版社 , 1992.37 ～ 52
6.Chan ,M .J., et al.,(1993), plant Mol.Biol.22:491 ～ 506
7.Blochinger K , Diggelmann H.Hyg romycin B phospho-
transferase as a selectable marker for DNA transfer experi-
ments w ith higher eucaryotic cells.Mol Cell Biol , 1984 (4):
2929
8.Waldron C ,Murphy E B , Roberts J L , et al.Resistance to hy-
g romycin B:a new marker for plant transformation studies.
Plant Mol Biol , 1985 (5):103
9.Rashid L , Yokoi S , Toriy ama K , et al.T ransgenic plant pro-
duction mediated by Ag robacterium in indica rice.Plant Cell
Rep , 1996 , 15:727～ 730
10.Li , X.Q.et al.,(1992)Plant Mol.Biol., 20:1037 ～ 1048
11.Rashid , et al.,(1996)plant cell rep., 15:727 ～ 730
12.朱登云 , 田慧琴 , 李深旺玫.杜促叶和叶柄愈伤组织的
诱导和植株再生.植物研究 , 2001 , 21 ,(2):206～ 209
13.Haw e, et al.,(1989), Plant physiol., 91:113～ 118
14.Thomashow M .F., et al.,(1987)Bacteriol , 169:3209 ～
3216
15.Lippinco tt T.A.et al., (1980)In ” bactrerial Adherence ,
Receptors and recognition” vol16:375～ 398
4433 期　　　　　　　　　　　　　　尹鸿瑛等:影响根癌农杆菌介导水稻转化的因素分析