全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 19 卷　第 2 期 1999 年　4 月
Vol.19　No.2 April , 　1999
RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进
夏　铭　栾非时　李景鹏
(东北农业大学 , 哈尔滨　150030)
摘　要　针叶树种红松(Pinus koraiensis)和阔叶树种蒙古栎(Quercus mongolica)
为材料 ,研究了随机扩增多态 DNA(RAPD)的影响因素 , 优化了各种实验条件。
RAPD对模板浓度的适应范围比较广 ,从 10 ～ 80ng/反应均可得到一致的结果;
dNTP 的适宜浓度为 150 ～ 300mmol/L ;TaqDNA 聚合酶的用量以 1 ～ 2U 为佳。对
于十个碱基的随机引物 ,合适的复性温度为 35 ～ 37℃;1min的延伸时间足以满足
2kb以下的 DNA片段的合成;热循环的次数以 40次为宜。按照优化的 RAPD条件
进行的重复实验 ,重现性良好 。
关键词　随机扩增多态 DNA;影响因素;实验条件;优化
STUDYON INFLUENCING FACTORSOF RAPD AND
OPTIMIZATION OF RAPD EXPERIMENT CONDITIONS
Xia Ming 　Luan Fei-shi　Li Jing-peng
(Northeast Ag ricultural University , Harbin 150030)
Abstract　The influencing factors of RAPD were studied and the experimental param-
eters were optimized using Korean Pine(Pinus koraiensis)and Mongolian Oak(Quer-
cus mongol ica).The optimal experiment conditions are as follow :20 ul sy stem con-
taining 10 ～ 80ng template , 150 ～ 300mmol/L dN TP , 15ng arbitary primer , 1 ～ 2 u-
nits Taq DNA polymerase.With a M.J.Thermal Cycler , optimal amplification pro-
g ram is 40 cycles of 1 min at 94℃, 1 min at 35 ～ 37℃, 1 min at 72℃, using block
control style.A high reproducibility w as obtained w ith the optimized experiment con-
di tions.
Key words　Random Amplified Polymorphic DNA;Inf luencing factors;Optimization
收稿日期:1998-4-10
前　　言
RAPD(Random Amplif ied Polymo rphic DNA)技术是 1990年由Williams等人首先报
道的一种分子标记技术〔1〕 ,由于它具有简便 、快速 、经济 、易于检测等优点 ,同时它不象
RFLP技术需要进行同位素杂交和 Southern印迹 ,因此在短短的几年中 , RAPD技术被广泛
应用于遗传图的构建〔2 ,3〕 、分子标记的寻找 、遗传多样性的检测〔4～ 9〕 、种间关系的确定〔10～ 14〕
等领域中。RAPD技术在应用中的一个主要问题是重现性差 ,实验结果容易受到多种因素
的影响 ,这就要求实验条件和反应程序必须严格控制。本文以两种木本植物为材料 ,对
RAPD的影响因素进行了研究 ,并对实验条件和反应程序进行了优化 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
红松(Pinus koraiensis)当年生针叶和蒙古栎(Quercus mongolica)幼叶采自黑龙江省虎
林市迎春镇五泡林场 。
1.2　总 DNA 的提取
采用 CTAB方法 。称取 0.3g 叶片 ,液氮研磨 ,装入 1.5ml离心管 ,加入 800ul提取液
(2%CTAB 、100mmol/LTris-HCl、1.4mol/LNaCl 、20mmol/ LEDTA 、0.5%β -ME 、2%PVP
-40 、50mmol/ LVc),65℃水浴 45min ,用饱和酚和氯仿/异戊醇(24:1)各抽提两次 , -20℃
下以二倍体积乙醇沉淀 DNA , 10000rpm 、15min 收集 DNA 沉淀 ,吹干 , 用 100ulTE 溶解
DNA ,加入 1单位 RNase ,37℃保温 45min ,用氯仿/异戊醇(24:1)抽提 1 ～ 2次 ,测定 260nm
和 280 nm 的光吸收值以确定 DNA浓度和纯度 ,电泳检查 DNA有无降解 , -20℃保存 。
1.3　DNA 扩增
RAPD反应程序参考Williams等的方法 ,复性温度为 35 ～ 37℃,红松扩增引物为 OPD
-03 ,蒙古栎扩增引物为 OPA-09 ,所用引物购自北京原平皓生物技术有限公司哈尔滨办
事处 , Taq DNA 聚合酶和 dN TP 购自北京天象人生物工程有限公司哈尔滨分公司 ,扩增反
应在美国 M .J.公司生产的 PTC-200型热循环仪中进行 。
1.4　扩增产物的检测
用 1.2%琼脂糖电泳检测 PCR产物 , EB染色 ,紫外灯下观察 ,照相记录。
所有实验重复三次。
2　结果和讨论
2.1　模板浓度的影响
从已发表的研究结果来看 ,RAPD实验的模板浓度一般为每反应 20ng ～ 80ng〔1 , 5 , 9〕 ,本
实验在引物浓度为 15ng/反应 、TaqDNA 聚合酶1单位/反应的条件下 ,比较了从 5 ng -640
ng/反应的模板浓度对扩增的影响 。结果表明(图 1),模板用量分别为 5 、10 、20 、40 、80 、160 、
240 、320 、480 、640 ng 的条件下 ,红松和蒙古栎的带型和扩增强度基本相同 ,只有红松在 320
ng 条件下多扩出一条 500bp的带 。从以上结果可见 , 在本实验中模板浓度的变化对 RAPD
带型和扩增量的影响不显著 ,但是使用过高浓度的模板(200 ng 以上)可能产生新带 。
RAPD PCR同常规的特异 PCR相比有所不同 ,后者在加大模板浓度时 ,只会获得更大
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的扩增量 ,而不会扩增更多的位点 。RAPD PCR的灵敏度很高 ,容易受条件变化的影响 ,所
以必须强调结果的可重复性 ,保证在选定的模板浓度范围内不发生少出带或多出带的现象。
裴颜龙等(1995)在进行牡丹的 RAPD分析时发现 ,当引物浓度为 10ng/反应时 ,模板浓度为
15或 30ng/反应时的扩增带完全一样 ,而在 60ng/反应时 ,引物 3多扩出一条 1250bp的带 ,
引物 5少扩出一条 179bp的带 。可见模板浓度的改变可能导致扩增带型的变化 ,而这种变
化在不同的物种中有所不同 ,因此有必要通过试验来确定合适的模板浓度 。在本实验中 ,模
板浓度的适应范围较宽 ,但也不宜过高 ,以 10 ～ 80ng/反应为佳。
2.2　dNTP 浓度的影响
Williams等(1990)的 RAPD实验中每种 dNTP 浓度为 100umol/L , 在以后的研究中常
使用 100 ～ 200umol/L 的 dNTP〔3 ～ 5 , 14〕 。在 PCR热循环过程中 ,50次循环以后大约 50%应
为 dNTP ,反应中每种 dNTP 的终浓度为 20 ～ 200umol/L ,此时产物量 、特异性 、忠实性较
好〔15〕。早期用 Klenow 片段进行 PCR扩增时 ,dNTP 的浓度为 1.5mmol/L , Taq DNA 聚合
酶的应用使 dNTP 的使用浓度明显降低 ,从而减少了非靶位点的错误引导和 dNTP 的错误
差掺入。适宜的 dNTP 浓度可根据扩增片段的长度和碱基组成 ,通过实验确定 。
本实验分别试验了 50 、100 、150 、200 、300 、400 、600 、800umol/L 的 dNTP 对随机扩增的
影响。结果表明(图 2),150 、200 、300umol/L 的 dN TP 下 ,扩出的 DNA 带型和强度都很平
行;而 100umol/ L条件下虽带型基本相同 ,但扩增强度稍差;400 umol/L 时强度较好 ,但是
有些带未扩出来;50 、600 umol/ L时扩出的带少且强度弱;800 umol/L 条件下在两个物种中
均未得到任何扩增。
从结果来看 ,50 、100umol/ L的 dNTP 浓度偏低 ,所以影响了扩增强度;而过高的 dNTP
浓度也不利于 DNA的扩增 ,这可能是由于过高浓度的 dNTP 抑制了 TaqDNA聚合酶的活
性〔15〕所致。在我们的实验条件下 ,150 ～ 300 umol/L 的 dN TP浓度较为适宜。
2.3　TaqDNA聚合酶浓度的影响
TaqDNA聚合酶在 PCR中的用量受到反应体积 、酶的活性 、酶的耐热性等因素的制
约 ,在条件合适时 ,每 100ul体系中一般使用 1 ～ 2.5U 的 TaqDNA聚合酶〔3 , 4 , 9 , 10〕 。我们分
别试验了在每 20ul的反应体系中使用 0.5 、1 、2 、3 、4U TaqDNA 聚合酶对 RAPD的影响。
由图 3可见 , TaqDNA聚合酶用量为 0.5U 时 ,DNA扩增强度较弱 ,有的带扩不出来;用量为
1 、2U时 ,扩出的 DNA带型和强度都较好;用量加大到 3 、4U时 ,红松中开始出现新带 ,同时
两个物种的扩增带均出现弥散现象。因此 ,我们认为 , 1 ～ 2U 的 TaqDNA 聚合酶用量是合
适的 。
在试验中发现 , TaqDNA聚合酶用量过多(4 unit以上)时会引起非特异性扩增 ,从而在
胶上出现比较重的背景 ,影响结果的检测 ,因此 TaqDNA聚合酶的用量不宜过大。
此外 ,需要指出的是 ,由于不同产地 、不同生产批次的 TaqDNA 聚合酶在活性上经常有
所不同 ,因此有必要对每一批新买到的 TaqDNA 聚合酶进行最佳使用浓度的试验 ,从而避
免由于酶活性的变化造成人为的假象。
2.4　反应程序的影响
本研究以Williams等的反应程序为参考 , 针对复性温度 、延伸时间 、循环次数等条件进
行了试验 ,所试程序见下表:
1972 期　　　　　　　　　　夏　铭等:RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进
表 1 试验的反应程序
Table 1 Testing programs
反应程序
Programs
复性温度(℃)
Annealing temperature
延伸时间
Elongat ion time
循环次数
Numbers of cycle
A35 35 2min 45
A37 37 2min 45
E30 36 30sec 45
E60 36 60sec 45
C35 36 2min 35
C40 36 2min 40
C50 36 2min 50
Williams 36 2min 45
所有程序在加入 Taq 酶之前进行预变性 ,条件为 97℃、7min;每个循环变性条件为
94℃、1min ,复性时间为 1min ,延伸温度为 72℃;结束循环后在 72℃条件下反应 7min以使
反应完全 。
2.5　复性温度的影响
复性温度对 PCR的特异性十分关键 ,过高会使引物和模板结合不上 ,过低会导致引物
与模板的非特异结合 ,使扩增的特异性下降。引物复性所需的温度取决于引物的碱基组成 、
长度和浓度 ,合适的复性温度应低于引物在 PCR条件下真实 Tm 值的 5℃。对于 RAPD通
常所用的十个碱基的引物 ,复性温度一般低于 40℃,Williams指出 ,40℃以上的复性温度会
抑制 RAPD反应〔1〕。本实验分别采用 35 、36 、37℃三种复性温度进行扩增 ,结果(图 4)在蒙
古栎中 ,三种复性温度下得到了完全相同的扩增 ,在红松中 DNA 带型也基本一致 ,表明 35
～ 37℃的复性温度较为合适 ,在此范围内调整温度对 RAPD无明显影响 。
2.6　延伸时间的影响
TaqDNA聚合酶的最适作用温度为 72℃。在此温度下 ,核苷酸的掺入率为 35 ～ 100个
核苷酸/ s ,延伸速度还与缓冲体系 、pH 值 、盐浓度和 DNA模板有较大关系〔15〕。延伸时间主
要是根据欲扩增片段的长度来确定的 ,一般来讲 ,72℃延伸 1min对于 2kb的片段是足够的 ,
过长时间的延伸可能导致非特异的扩增 。此外 ,还应考虑所使用的离心管管壁的厚度 ,目前
多使用 PCR专用的薄壁离心管 ,这使得达到特定温度的延迟时间大大缩短 。在本研究中 ,
我们试验了 30sec 、60sec 、2min 的延伸时间 ,结果(图 4)表明 ,三种延伸时间在两个物种中获
得了平行的扩增。RAPD的 DNA带大致在 200bp-2kb的范围内 ,理论上讲1min左右的延
伸时间较为合理 ,我们的结果也验证了这一点 。由于本实验中扩增的 DNA在 2kb左右或
更小 ,因此 30s的延伸时间也得到了相同的结果 ,在大批的 RAPD实验中 ,采用 1min的延伸
时间是比较稳妥的 ,既保证充分的延伸 ,又避免了由于延伸时间过长引起的非特异扩增。
2.7　循环次数的影响
PCR的循环次数决定着扩增产量 。最适循环次数主要取决于靶序列的初始浓度 ,循环
次数太少 ,PCR产物量极低;循环次数过多 ,一旦达到反应平台 ,以后的循环不会使产物明
显增加 ,反而可能引起非特异的扩增 。我们在模板量为 40ng 的条件下 ,试验了 35 、40 、45 、
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50个循环的扩增效果 ,结果(图 4)40 、45 、50个循环条件下的带谱和强度并无显著区别 ,只
是红松的 45个循环在 1.5kb处扩增量稍有增加;35个循环的扩增量略显不足 。可见 ,在本
实验条件下 ,40个循环已经可以达到要求了。
应该指出的是 , Mg2+的浓度也是一个十分重要的因素 ,它对 TaqDNA 聚合酶的活性 、
引物的退火 、模板与 PCR产物的解链温度 、产物的特异性等都有影响 ,尤其是 Taq酶发挥聚
合活性所必需的 。本实验所用的 Taq酶缓冲液中已加有 2mmol/ L 的 Mg2+ ,而且在实验中
效果比较稳定 ,因此未对 Mg2+浓度进行试验 。
根据实验结果 ,我们得出了优化的 RAPD条件:20ul反应体系 ,40ng 模板 , 15ng 引物 ,
200umol/L 每种 dNTP , 1UTaqDNA聚合酶 ,加酶之前先在 97℃下预变性 7min , 40 次热循
环 ,循环条件为 94℃、1min ,36℃、1min , 72℃、1min ,最后在 72℃下延伸 7min 。应用此条件
进行多次重复 ,结果重现性良好。
在 RAPD实验进行中 ,改变研究的物种或更换所用的药品 、仪器时 ,有必要对实验条件
重新进行摸索。任何条件的变化都可能引起扩增带型的变化 ,为保证实验的精确性和可重
复性 ,对于特定物种的同一批 RAPD实验 ,应在优化实验参数的前提下 ,尽可能地保持条件
的恒定。
参　　考　　文　　献
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1992 期　　　　　　　　　　夏　铭等:RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进
图　　版　　说　　明
图版Ⅰ 　1.模板浓度试验:泳道 11为分子量标准(λNDA , hindⅢ和 EcoRI 双酶切 , 21227 , 5149 , 4973 , 4268 , 3530 , 2027 ,
1904 , 1581 , 1375 , 947 , 831), 1-10泳道为 OPA-03 扩蒙古栎的电泳图谱 ,模板浓度依次为 5 、10 、20 、40 、80 、160 、240 、
320 、480 、640ng/反应;12-21泳道为OPD-03扩红松的电泳图谱 ,模板浓度梯度同蒙古栎;2.dNT P 浓度试验:泳道 9
为分子量标准(同图 1), 1-8泳道为OPA-03扩蒙古栎的电泳图谱 , dNTP 浓度依次为 50 、100 、150 、200 、300 、400 、600 、
800umol/ L;10-17泳道为 OPD-03扩红松的电泳图谱 , dNTP 浓度梯度同蒙古栎;3.Taq DNA 聚合酶用量试验:泳道 6
为分子量标准(同图 1), 1-5泳道为OPA-03扩蒙古栎的电泳图谱 ,酶用量依次为 0.5 、1 、2 、3 、4 unit s/反应;7-11泳道
为 OPD-03扩红松的电泳图谱 ,酶量梯度同蒙古栎;4.反应程序试验:泳道 9为分子量标准(同图 1), 1-8泳道为 OPA
-03扩蒙古栎的电泳图谱 ,程序依次为 A35 、A37 、E30 、E60 、C35 、C40 、C50 、Williams;10-17 泳道为 OPD-03 扩红松的
电泳图谱 ,程序次序同蒙古栎。
Explanation of plate
Plate Ⅰ 　1.Testing of template concent rat ion:Line 11 w as molecular w eight standards(λNDA digested w ith hindⅢ and
EcoRI , 21227 , 5149 , 4973 , 4268 , 3530 , 2027 , 1904 , 1581 , 1375 , 947 , 831), Line 1-10 w ere electrophoretic bands of Mongo-
lian Oak amplifiedw ith primer OPA-03;Line 12-21 w ere elect rophoret ic bands of Korean Pine am plif ied w ith primer OPD-
03;Template concent ration w ere 5 、10 、20 、40 、80 、160 、240 、320 、480 、640ng/Re;2.Test ing of dNTP concent rat ion:Line 9
w as molecular w eight standards;Line1-8 w ere elect rophoretic bands of Mongolian Oak amplif ied w ith primer OPA-03;Line
10-17 w ere electrophoretic bands of Korean Pine am plif ied wi th primer OPD-03;dNT P concen trat ion w ere 50 、100 、150 、
200 、300 、400 、600 、800umol/ L;3.Testing of Taq NDA polym erase concent ration:Line 6 w as molecular w eight standards;
Line1-5 w ere elect rophoret ic bands of Mongolian Oak amplif ied w ith primer OPA-03;Line 7-11 w ere elect rophoret ic bands
of Korean Pine amplif ied w ith primer OPD-03;Taq DNA polymerase concent ration w ere 0.5 、1 、2 、3 、4 、uni ts/Re;4.Testing
of reaction program:Line9 w as molecular weigh t standards;Line1-8 w ere elect rophoretic bands of M ongolian Oak ampli fied
w ith primer OPA-03;Line 10-17 w ere elect rophoret ic bands of Korean Pine amplif ied w ith primer OPD-03;React ion pro-
grams were A35 、A37 、E30 、E60 、C35 、C40 、C50 、William s.
200 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
夏铭等:RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进 图版Ⅰ
Xia Ming et al.:Study on Influencing Facto rs of RAPD and Optimization of RAPD Experiment Conditions
Plate Ⅰ
See explanation at the end of text