全 文 ：第 21 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001 年　10 月
Vol.21　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2001
东北红豆杉细胞培养物 PPO 活性研究
胡风庆1　王森林1　马　辉1　王关林2
(1.辽宁大学生命科学系 , 沈阳　110036)
(2.辽宁师范大学生命科学系 , 大连　116029)
摘　要　研究证明 ,多酚氟化酶(PPO)与东北红豆杉细胞生长存在密 切关系 ,利用 Vc、NaCl 、苯
甲酸 、亚硫酸钠 、柠檬酸 、草酸等可有效抑制 PPO的活性 ,降低褐化程度 ,促进东北红豆杉细胞培
养物的生长 。而利用硫酸铜 、水解酪蛋白 、椰乳 、乙烯吡咯烷酮等可有效抑制 PPO 活性·加重褐
化 、抑制东北红豆杉细胞培养物的生长 。
关键词　多酚氧化酶;东北红豆杉;抑制剂
THE PPO ACTIVE STUDY OF CELL CULTURE SUBSTANCE
OF TAXUS CUSPIDATA
HU Feng-qing1　WANG Sen-lin1　MA Hui1　WANG Guan-lin2
(1.The Department of Life and Science , Liaoning Univ ersity , Shenyang 110036)
(2.The Department of Life and Science , Liaoning No rmal University , Dalian 116029)
Abstract　The study testify that PPO has close relationship w ith grow th of cell culture substance of
Taxus cuspidata.Vc , NaCl , benzoic acid , Na2SO3 et al can rest rain PPO active of cell culture sub-
stance of Taxus cuspidata , which can alleviate brow n and promote continue grow th of cell culture
substance of Taxus cuspidata.However ,CuSO4 ,CA , PVP et al can activate active of PPO ,which can
agg ravate cell culture substance becoming brow n and restrain further g row th of cell culture substance
of Taxus cuspidata.
Key words　PPO;Taxus cuspidata;inhibi tor
1　前言
近年来人们从红豆杉科 (Taxoceoe)红豆杉属
(Taxus)植物树皮中提取出多种紫杉烷类化合物 ,
其申有 10多种化合物具有抗肿瘤活性 ,尤其以紫杉
醇(Taxol ,结构如图)活性最强[ 1] ,经临床证明对治
疗卵巢癌 、肺癌 、结肠癌 、转移性乳腺癌 、黑色素瘤 、
白血病等多种搔症有特效[ 2 ,3 ,4] ,美国 FDA 于 1992
年正式批准紫杉醇在临床用于卵巢癌治疗 ,致使紫
杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一[ 5] 。
由于红豆杉树皮中的紫杉醇含量非常低(约
0.01%～ 0.02%),从树皮提取紫杉醇根本无法满足
需求 ,而且利用提取法获取临床及基础研究所需的
紫杉醇[ 6] ,将给红豆杉属植物的长期存留及地区分
布带来威胁 。为此 ,许多学者采用不同方法以解决
紫杉醇来源问题 。目前常见的方法有:(1)全合成;
(2)半合成;(3)栽培法;(4)分漓产紫杉醇真菌 ,利用
微生物工程法生产;(5)植物组织细胞培养法等。其
第一作者简介:胡风庆(1971-),男 ,讲师 ,理学硕士 ,主要从事植物分子生物学及天然产物研究开发的研究。
本论文由沈阳市科委农村处重点攻关项目(199925044-01)、辽宁省教委重点资助项目(99012018)、辽宁大学青年启动基金项目等多
项资助。
收稿日期:2001-07-21
中研究较多的是植物组织细胞培养法 ,但在进行红
豆杉细胞培养过程中 ,常常会遇到褐化问题 ,细胞培
养物褐化会限制细胞的进一步生长 ,甚至导致细胞
死亡 。笔者在研究东北红豆杉细胞培养过程中发现
多酚氧化酶活性的变化与褐化程度相关 ,异且发现
Vc 、NaCl、苯甲酸 、柠檬酸 、草酸可抑制多酚氧化酶
活性 ,进而可在一定程度上减轻褐化 ,促进细胞培养
物的生长 。
2　材科与方法
2.1　东北红豆杉细胞培养
供试材料为东北红豆杉(Taxus cuspidata sieb
et zuce)采自辽宁大学校内及熊岳植物园 。东北红
豆杉细胞系为本实验室建立并保存 。以 B5 为基本
培养基 ,补加适量组合激素及 20g/L 蔗糖 ,灭菌前
调 pH至 5.5 ～ 5.8 , 121℃下灭菌 30min 。每瓶接约
5g新鲜愈伤组织 ,摇床上 110rpm 培养 ,培养温度
25℃,每天光照 10h。
2.2　PPO提取及活性测定方法
培养 N 天的东北红豆杉细胞 ,经离心收集细胞
沉淀 。称取1g 细胞 ,加入0.05mol/L 冰浴的磷酸缓
冲液(pH 为6.8)15ml ,在 0℃下研磨 ,离心收集上清
液。此上清液即为 PPO的粗酶提取液 ,可于低温下
保存备用 。
以 0.02mol/L 邻苯二酚为底物 ,将底物与酶在
25℃下与经 25℃预热的磷酸缓冲液(pH6.8)混匀 ,
保温30min 。测定在487 nm下的OD值 , 酶活性标
准以光密度变化 0.00l为 l个单位(U)。
2.3　东北红豆杉细胞培养物鲜重生长量的测定
在进行细胞培养过程中 ,每隔 6天 ,用电子分析
天平测定培养瓶中东北红豆杉细胞培养物鲜重。细
胞培养物鲜重计算方法:
液体培养基自然失重率=[新配制培养基重(未
接培养物)-在培养物培养条件下 N 天后的培养基
重] /新配制培养基重(未接培养物)
东北红豆杉细胞培养物鲜重=培养 N 天后(培
养液+培养物)重量-(培养液+培养物)重量×(l
-液体培养基自然失重率)
3　结果
3.1　影响多酚氧化酶(PPO)活性的因素
为确定影响多酚氧化酶活性的因素 ,分别测定
了在硫酸铜 、柠檬酸 、抗坏血酸(Vc)、苯酚 、氯化钠 、
草酸 、亚硫酸纳 、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、水解酪蛋
白酸等物质存在条件下多酚氧化酶活性变化 ,以促
进或抑制表示作用效果 。作用程度百分比表示:作
用程度%=(加入抑制剂后的酶比活-加入抑制剂
前的酶比活)/加入抑制剂的的酶比活 ,结果见表 1。
实验结果表明 ,抗坏血酸 、氯化钠 、苯甲酸 、亚硫
酸钠 、柠檬酸 、苯酚 、草酸等物质可抑制多酚氧化酶
活性 , 其中以抗坏血酸对 PPO 抑制程度最强 , 而
PVP 、椰乳 、水解酪蛋白 、硫酸铜等物质对多酚氧化
酶的活性有明显促进作用 。
3.2　多酚氧化酶活性(PPO)与东北红豆杉细胞培
养物生长的关系
为确定多酚氧化酶活性对东北红豆杉细胞培养
物生长的影响 ,在培养基中添加表 l中可影响多酚
氧化酶活性的物质 ,分别测定培养 N 天后实验组与
对照组中东北红豆杉细胞的鲜重 ,计算鲜重增长倍
数 ,确定上述物质在培养基中的作用效果 ,结果见表
2。
不同物质作用效果计算方法 ,作用效果=(实验
组 30天鲜重增长倍数)-对照组 30天鲜重增长倍
数/对照组 30天鲜重增长倍数 。负值说明在添加物
存在下 ,细胞培养物鲜重增长缓慢 ,正值说明在添加
物存在下 ,细胞培养物增长迅速。
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　　表 1 不同物质对多酚氢化氧活性的影响
Table l The influence of different mattel on active of PPO
添加物浓度%
matter conceration
487nmOD值 PPO 比活(U) 作用效果
act effect
作用程度(%)
act on deg red(%)
硫酸铜 0.2 1.745 1745 促进 +550
柠檬酸 0.5 0.138 138 抑制 -48.6
抗坏血酸 0.02 0.074 74 抑制 -72.4
苯酚 0.2 0.233 233 抑制 -13.0
氯化钠 1.5 0.214 214 抑制 -20.1
草酸 1.0 0.187 187 抑制 -30.2
亚硫酸钠 0.02 0.075 75 抑制 -72.0
聚乙烯吡咯烷酮 2.0 0.473 473 促进 +76.5
水解酪蛋白 1.0 1.046 1046 促进 +290
椰乳 1.0 0.872 872 促进 +225
苯甲酸 0.3 0.128 128 抑制 -52.2
对照 0 0.268 268 — —
　　表 2 东北红豆杉细胞培养 N 天后细胞培养物的重量
Table 2 The weight of cell culture substance of T.Cuspidata after N days
培养 N 天后细胞培养物鲜重
fresh weight of cell culture substance of the N day s
0 6 12 18 24 30
培养 30 天后
净增长倍数
Grow th after
30 days
不同物质 作
用效 果 The
effect of dif-
ferent matter
acting
对照组 5.4 6.3 7.2 8.2 9.1 10.1 1.870 0
实验组 硫酸铜 5.5 5.8 6.4 7.3 7.8 8.2 1.490 -0.203
苯甲酸 5.3 6.4 7.5 8.6 9.5 10.7 2.109 0.128
抗坏血酸 5.2 6.3 7.2 8.4 9.9 11.2 2.154 0.152
椰乳 5.2 6.0 6.9 7.5 8.2 9.3 1.788 -0.044
水解酪蛋白 5.6 6.1 6.5 7.2 7.8 8.2 1.464 -0.217
亚硫酸钠 5.7 6.6 7.8 8.9 9.9 11.7 2.053 0.098
草酸 5.3 6.0 6.9 7.8 8.9 10.1 1.906 0.019
氧化钠 5.5 6.4 7.5 8.7 9.8 10.4 1.891 0.011
苯酚 5.6 6.0 6.6 7.8 8.9 10.3 1.839 -0.166
聚乙烯吡咯烷酮 5.8 6.3 7.1 7.8 8.5 9.1 1.568 -0.161
柠檬酸 5.4 5.9 6.4 7.7 9.0 10.2 1.899 0.010
　　由表 2结果可见 ,在东北红豆杉细胞培养基中
添加抗坏血酸 、苯甲酸 、氯化钠 、亚硫酸钠 、草酸 、柠
檬酸 、苯酚等 PPO抑制剂后 ,经 30天培养细胞鲜重
增长明显高于对照组 ,说明上述物质对东北红豆杉
细胞培养物的生长有明显的促进作用 ,细胞培养物
的褐化现象也明显减轻 。在培养基中添加硫酸铜 、
聚乙烯吡咯烷酮 、水解酪蛋白 、椰乳等 PPO激活剂 ,
细胞培养物鲜重增长明显低于对照组 ,说明这些物
质对东北红豆杉细胞培养物的生长有抑制作用 ,细
胞培养物褐化趋于严重。由此可确定 ,PPO 活性与
5854 期　　　　　　　　　　　　　　胡风庆等:东北红豆杉细胞培养物 PPO 活性研究
东北红豆杉细胞培养物生长之间存活着密切的关
系 ,而其活性高低直接决定了东北红豆杉细胞培养
物的生长状态。
4　讨论
褐化问题一直是红豆杉研究的焦点问题 。褐化
原因是红豆杉属植物在生长过程中会分泌出一些酚
类渗出物 ,这些酚类渗出物易被 PPO氧化成醌类物
质。醌类物质的积累会导致红豆杉组织 、细胞培养
物褐化 。褐化不利于红豆杉组织 、细胞培养物的生
长 、甚至会引起红豆杉组织 、细胞培养物死亡 ,因此
多酚氧化酶是引起红豆杉属植物细胞培养物褐化的
主要因素 。褐化也是不能利用组织细胞培养法解决
紫杉醇来源问题的根本原因。只有解决红豆杉细胞
培养过程中褐化这一根本性问题 ,才能通过束缚紫
杉醇获取的“瓶颈”。
本实验结果为解决红豆杉褐化问题提供了很好
的方法 ,可利用抗坏血酸 、苯甲酸 、氯化纳 、亚硫酸
纳 、苯酚 、柠檬酸等 PPO 的抑制剂抑制 PPO 的活
性 ,使红豆杉组织 、细胞培养过程中所分泌的酚类物
质不能被氧化成醌类物质 ,进而可避免红豆杉组织 、
细胞培养物褐化 ,促进组织 、细胞培养物的生长 ,使
利用组织细胞培养法生产紫杉醇成为可能。
参考文献
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