全 文 ：苜蓿抗感褐斑病品种内超氧化物歧化酶、
过氧化物酶和多酚氧化酶活性的比较
　
袁庆华 ,桂枝 ,张文淑
(中国农业科学院畜牧研究所 , 北京 100094)
摘要:利用离体叶接种技术分别将伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾 4个苜蓿品种内的植株分为抗病株和感病株 ,并
分别接种苜蓿假盘菌 ,对抗、感病植物叶片中的 SOD、 POD及 PPO的活性进行了测定。结果表明 ,接种前抗、感株叶
片中 4种酶的活性基本相同 ,接种后 17 d内酶活性先升后降 ,而抗病株的酶活性增加高于感病株。 最后抗、感病株
3种酶活性趋于一致。
关键词:苜蓿 ;褐斑病 ;超氧化物歧化酶 ;过氧化物酶 ;多酚氧化酶
中图分类号: S432. 1　　文献标识码: A　　文章编号: 1004-5759( 2002) 02-0100-05
⒇
　大量的研究结果表明 ,超氧化物歧化酶 ( SOD)、过氧化物酶 ( POD)及多酚氧化酶 ( PPO)都在植物的抗病过程
中起着重要的作用 [1～ 5 ]。 许多研究者认为 ,植物体内有一组保护酶系统 ( SOD、 POD及 PPO) ,在未受到病菌侵染
前使活性氧处于低水平的动态平衡状态 ;当植物受到病原菌侵染后 ,被侵组织的活性氧突增 ,而该保护酶系统具
有清除活性氧 ,防止植物受害的作用 [1, 6, 7 ]。
以往对不同作物接种病菌后保护酶的活性作了大量的实验研究 [1～ 3, 7 ] ,以探讨保护酶与寄主抗病性的关系 ,
作为筛选抗性材料的生化指标之一。但是 ,对于同一品种内 ,特别是同一牧草品种内不同抗、感植株的保护酶变化
的研究尚不多见。笔者和我国其他人员 [8, 9 ]曾对苜蓿品种抗褐斑病的特性分别开展过室内与田间的特性评价。在
以往工作的基础上 ,笔者通过离体叶接种 [ 10 ] ,已经从同一品种内 600个单株中筛选出抗病单株和感病单株 (待
刊 )。在此基础上 ,通过苜蓿假盘菌的接种 ,对抗、感株进行保护酶活性测定 ,以比较抗、感株酶活性的变化动态 ,对
离体叶接种的有效性做进一步检验 ,并为苜蓿抗褐斑病育种提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　供试品种　选用 4个苜蓿品种 ,即伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾 ,它们的病指数分别为 13. 48、 21. 48、
28. 25和 33. 68。用离体叶接种方法 [10 ]从每个品种 600株中筛选出最抗的和最感的苜蓿单株各 5株 ,进行无性扦
插扩繁 ,取扩繁后的各品种抗感单株各 30株 ,作为供试材料。
1. 1. 2　菌种与取样方法　苜蓿假盘菌 (Pseudopeziza medicaginis )在 V - 8碳酸钙琼脂培养基上培养 , 20℃恒温
黑暗条件下培养 30 d,按袁庆华等 [8 ]的方法接种病菌 ,分别于接种前 1 d,接种后 2、 7、 12、 17 d对抗感单株逐株取
相同部位的一个叶片 ,将同一抗病或感病单株的叶片放在一起 ,并用去离子水冲洗干净后 ,用于制备酶液。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　酶液提取　称取 0. 5 g去中脉的苜蓿叶片 ,放入研钵中 ,取 5 ml 1 /15 mol磷酸缓冲液 ( p H= 7. 8)倒入研
钵内 ,冰研磨成匀浆 , 6 000 r /min离心 20 min,倾出上清液 ,放入 5 ml试管内 ,剩余物加少量缓冲液冲洗后 ,再次
离心 ( 6 000 r /min, 5 min) ,取上清液 ,如此重复 3次 ,直到酶粗提液补足 5 m l。将酶液放入 4℃冰箱中保存备用。
以上方法用于 SOD、 PPO酶液的提取 ,而 PO D酶液的提取使用的是 0. 01 mol /L磷酸缓冲液 ( p H= 7. 2) ,其
余方法同上。
100- 104
6 /2002
草　业　学　报
AC TA PRAT ACULTU RAE SIN ICA
第 11卷第 2期
Vol. 11, No. 2
⒇ 收稿日期: 2001-08-07基金项目:国家自然科学基金资助项目 (编号 39870559)。作者简介:袁庆华 ( 1959-) ,女 ,天津人 ,副教授。
1. 2. 2　超氧化物歧化酶活性测定　 SOD活性测定参照王爱国等 [9 ]和韩雅珊 [11 ]的方法。 3 ml反应液中含有:
0. 013 mo l /L甲硫氨酸、 63× 10- 6 mo l /L氮蓝四唑、 1. 3× 10- 6 mol /L核黄素、 1× 10- 4 mol /L乙二胺四乙酸 ( ED-
T A)及 pH= 7. 8的 0. 05 mo l /L磷酸缓冲液 ,加入稀释 30倍的酶粗提液 1 ml ,在 30℃下用 4 000 Lux荧光照射
10 min,并在 560 nm波长下测量透光率。 以每克鲜重含有的酶活单位 ( U /gfw )表示。各样品均重复测定 2次。
1. 2. 3　过氧化物酶活性测定　采用愈创木酚做底物 ,用分光光度法测定生成物的含量。反应液中含有 1 ml 0. 1
mol /L磷酸缓冲液 ( pH= 7. 2)、 1 m l 0. 1 mol /L愈创木酚、 1 ml 0. 8% H2O2 ,并加入适量的酶液后在 30℃下反应
20 min,并在 470 nm波长下测定吸光值。以 1 ml去离子水代替 H2O2为对照。在上述反应条件下 ,以每分钟每克
鲜重 OD值变化 1. 00所需的酶量为一个酶活单位。各样品均重复测定 2次。
1. 2. 4　多酚氧化酶活性测定　在小试管中依次加入 1. 5 ml 1 /15 mol磷酸缓冲液 ( p H= 6. 8)、 1. 5 ml 0. 02 mol
邻苯二酚及适量的酶粗提液混合均匀后 ,放入 40℃的水浴锅中保温 30 min,在 525 nm波长下测量光密度 ,以磷
酸缓冲液代替酶液作对照。在上述反应条件下 ,以每分钟每克鲜重 OD值变化 0. 01所需的酶量为一个酶活单位。
各样品均重复 2次。
2　结果与分析
2. 1　超氧化物歧化酶活性的变化
由图 1可知 ,苜蓿的 4个品种在未接种苜蓿假盘菌前 ,抗、感株间 SOD活性无差异 ,接种后抗、感株 SOD的
活性比接种前高 ,随着接种后时间的延长 ,抗感株酶活性均显著下降 ,接种后 17 d抗感株 SOD的活性均低于接
种前。接种后抗病株 SOD的活性高于感病株 ,伊鲁瑰斯接种假盘菌后 12 d,抗病株 SOD的活性达到最大 ,比感病
株高 55% ;萨兰斯接种后 7 d,抗病株酶活性达到最高 ,比感病株高 20% ;沙湾从接种后 2 d开始到接种后的 17
d,抗病株酶活性都高于感病株 ,平均比感病株高 71% ;沙河从接种后 2 d到 12 d,抗病株酶活性显著高于感病株 ,
3个时期酶活性平均比感病株高 48% 。
2. 2　过氧化物酶活性的变化
从图 2可以看出 ,未接种苜蓿假盘菌前 ,抗病株和感病株之间 POD的活性差异较小 ,接种后抗、感株 POD的
活性都比接种前的高 ,但抗病株 POD的活性增加明显高于感病株。萨兰斯接种后 12 d,抗病株酶活性达到最大 ,
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
图 1　接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内 SOD活性的变化
Fig. 1　 Changes in SOD activit ies in alfalfa leaves af ter inoculation with P .med icaginis
101第 11卷第 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　草业学报 2002年　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
比感病株高 72% ;沙湾接种后 2 d,抗病株 POD的活性比感病株高 46% ;沙河于接种后 7 d,抗病株的酶活性达到
最高 ,比感病株高 94%。酶活性达到最高峰后 ,除伊鲁瑰斯有波动外 ,其余 3个品种的抗病株酶活性下降 ,而感病
株酶活性有所增加 ,最终在第 17 d时抗、感株酶活性极为接近。
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
图 2　接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内 POD活性的变化
Fig. 2　 Changes in POD act ivities in alfalfa leaves after inoculation with P .medicagin is
2. 3　多酚氧化酶活性的变化
所测试的 4个品种内抗病株和感病株之间 PPO活性的变化如图 3所示 ,接种前 ,抗感株间酶活性差异不大 ,
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
　
图 3　接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内 PPO活性的变化
Fig. 3　 Changes in PPO activit ies in alfalfa leaves af ter inoculation with P .med icaginis
102 ACTA PRATACU LTURAE SIN ICA (Vo l. 11, No. 2) 6 /2002
接种病菌后抗、感株酶活性均比接种前的高。接种后抗病株比感病株 PPO活性高 ,从接种后 2 d到 12 d各品种抗
病株酶活性分别比感病株提高 6. 7%～ 23. 2% (伊鲁瑰斯 )、 8. 5% ～ 15. 7% (萨兰斯 )、 12. 4% ～ 19. 5% (沙湾 )和
9. 7%～ 21. 2% (沙河 ) ,接种后的 17 d抗感株酶活性都有所下降 ,抗、感株之间酶活性较为接近。
3　讨论与结论
许多研究证实 [12～ 14 ] ,植物受到病原菌侵染时会产生大量的活性氧 ,多余的活性氧影响植物的正常生理活动 ,
它通过非酶促方式催化细胞膜中的不饱和脂肪酸而启动膜脂过氧化 ,破坏细胞膜的完整性 ,引起细胞膜透性的增
加及电解质的渗漏 ,最终导致细胞死亡 ,而超氧化物歧化酶、过氧化物酶等正是负责清除活性氧的保护酶。在不同
的病害研究中 SOD的活性变化差异很大 , Buona rio等 [15 ]认为 ,在抗病品种中 SOD活性一般呈下降趋势 ,而在感
病品种中基本不变甚至升高 ,而王雅平等 [ 16]认为抗感品种接种后 SOD活性均升高 ,抗病品种比感病品种升高的
幅度大 ,在 POD的研究中 ,许多研究者认为 ,植物受病菌侵染后 ,体内 POD的活性均显著增加 ,抗病品种酶活性
高于感病品种 [2, 3, 7 ]。本试验结果表明 ,利用离体叶接种技术从同一品种内筛选出的抗病株及感病株之间 SOD、
POD活性变化存在差异 ,接种苜蓿假盘菌后抗感株 SO D和 POD活力均升高 ,但抗病株酶活性始终高于感病株 ,
直到接种后 17 d抗、感株活性差异不明显。这可能是由于寄主受到苜蓿假盘菌作用后活性氧的积累刺激了 SOD
和 POD活性的提高。同时在 PPO活性的测定中发现 ,苜蓿叶片受苜蓿假盘菌侵染后 PPO的活性在抗病株中的
增加高于感病株 ,其原因可能是由于抗病株受病原菌侵染后能快速促进酚类化合物和木质素的合成和累积 ,以抵
抗病原菌的侵染和扩展 ,从而提高寄主的抗病能力。在苜蓿抗褐斑病育种中 ,通过测定 SOD、 POD及 PPO活性的
高低可作为筛选抗性材料的生化指标之一。实验结果也说明 ,用离体叶接种技术进行苜蓿植株抗病性选择是有效
的。
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103第 11卷第 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　草业学报 2002年　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Comparison of the activities of SOD, POD and PPO within alf alfa cultivars
resistant and susceptible to alfalfa common leaf
YUAN Qing-hua , GU I Zhi, ZHANG Wen-shu
( Insti tute of Animal Science, CAAS, Bei jing 100094, China)
Abstract: Plants wi thin each of four al falfa cultiv ars, w ere g rouped as resistant ( R) and susceptible ( S) to
Pseudopeziza medicaginis and the dif ferent g roups were equally inocula ted wi th Pseudopeziza medicaginis , us-
ing excised leaf ti ssue inoculation. Bo th R and S g roups wi thin each o f the cultiv ars w ere tested fo r activi ties of
three enzymes, SOD, POD and PPO, in their leaf tissues. The result show ed that the activi ties o f the three en-
zymes w ere simi lar in R and S g roups before inocula tion. During the 17 days af ter inoculation, however, the
activi ties of the three enzymes increased fi rst , wi th mo re increases in the R g roups than in the S g roups, and
then decreased in a later phase. Finally the R ad S g roups became simi lar each o ther in terms of the activ ities of
the three enzymes in the leaf tissues.
Key words: alfa lfa; SOD; POD; PPO
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