全 文 ：华盖木多酚氧化酶酶学特性研究
马　均 ,马明东
(四川农业大学都江堰分校 ,四川 都江堰 611830)
摘要:以华盖木嫁接苗当年生茎段为试材提取 PPO 酶液 , 研究温度 、pH 值 、底物邻苯二酚浓度及抑制物对 PPO 活性的影
响。结果表明:华盖木多酚氧化酶的最适温度为 35℃,最适 pH 值为 7.0 ,温度和 pH 值过高或过低都会降低酶活性;邻苯二
酚浓度为 0.14 mol·L-1时 , PPO 活性最大 , 低于0.14 mo l·L-1时 , 随底物浓度的增加 ,酶活性增加 ,超过 0.14 mol·L-1时 ,加
大底物浓度酶活性降低;Na2SO4、柠檬酸 、抗坏血酸(Vc)对华盖木 PPO 的活性均有一定的抑制效果 , 其中 Vc的抑制效果最
显著。
关键词:华盖木;多酚氧化酶;酶学特性
中图分类号:Q946.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2009)01-0017-04
Study on the Enzymology Characteristics of Plyphenol Oxidase from
Mangliet iastrum sinicum Law.
MA Jun ,MA Ming-dong
(Dujiangyan Branch of Sichuan Agriculture University , Dujiangyan 611830 , Sichuan , China)
Abstract:PPO was ex tracted from the Manglietiastrum sinicum Law grafted plant stem before it w as 1 year old.The influences of
different temperature、pH、zymoly te o xopenic acid concentration and stay er on the activity of PPO were studied.The results showed
that the optimal temperature was 35℃ and the optimal pH value was 7.0 for plyphenol oxidase from M.sinicum Law ;The activi-
ty of PPO w ould reduce because of elevating o r reducing temperature or pH.The PPO activity w as highest when oxopenic acid con-
centration was 0.14 mol·L-1.Under the concentration , the enzyme activity increased with zymoly te concentra tion increase.Over
the concentration , the encyme activity decreased;Na2SO4、citric acid and Vc could suppress the activity of PPO , among them , Vc
possesed the most remarkable controlling effect.
Key words:Manglietiastrum sinicum Law;polyphenol oxidase;enzymology characteristics
　　多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase ,PPO)是广泛存在于植物体内由核基因编码 、能催化多酚类氧化成醌
类的含铜金属质体酶[ 1] 。植物组织的褐变主要是由多酚氧化酶氧化反应所生成的醌类物质引起的酶促
褐变 。通过 PPO的酶学特性研究 ,掌握 PPO 活性的变化规律就成了当前进行褐化控制研究的主要手段 。
华盖木(Mangliet iastrum sinicum Law)为木兰科单种属植物[ 2] ,与木兰科木莲属近缘 ,被认为是最原始的
木兰科植物[ 3 ,4] 。目前仅有 7株分布于中国三大特有中心之一的滇东南古特有中心的文山国家级自然保
护区的小桥沟[ 5] ,为国家Ⅰ级保护的极度濒危物种[ 6] 。为保护和扩大该物种种群 ,进行华盖木繁育技术
的研究就尤为迫切。目前华盖木的人工繁育主要采用嫁接 ,但该法繁殖率较低 ,不能满足扩大种群和保存
物种的需要。华盖木扦插不能成活 ,插后约 14 d插条就变褐死亡;在组织培养快繁过程中 ,严重的褐化现
象也成为了阻碍华盖木繁殖技术研究的一个重要问题 。而褐化主要是由 PPO引起的酶促褐变。目前还
未见华盖木 PPO酶学特性研究的报道。因此 ,本文对华盖木 PPO酶学特性进行了研究 ,旨在为华盖木繁
育过程中抑制褐化现象发生和优化培养条件提供理论依据 。
　收稿日期:2008-07-02;修回日期:2008-09-24
　基金项目:四川农业大学都江堰分校科技基金项目“华盖木生物学特性及繁育技术研究”(编号:N200702);四川省科技
厅应用基础研究项目“红色警报级几乎绝迹种华盖木人工繁育技术体系研究”
　作者简介:马　均(1975-), 女 ,四川内江人 , 四川农业大学都江堰分校讲师 ,硕士研究生 ,从事林木生物技术研究。
　通讯作者:马明东(1958-), 男 , 四川农业大学都江堰分校副教授 , 硕士生导师 , 从事森林培育的教学和研究工作。
E-mail:mmingdong@scfc.edu。
第 36 卷 第 1 期
2 0 0 9 年 3 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.36　No.1
Mar., 2 0 0 9
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料为四川农业大学都江堰分校苗圃的华盖木嫁接苗当年生枝顶芽下 2 ～ 3 cm 茎段 。材料采回
后立即进行测定 。
1.2　试验方法
1.2.1　PPO 酶液制备　称取茎段样品 2.0 g ,剪碎 ,加入少量石英砂和 10 mL 预冷的磷酸缓冲溶液 ,冰浴
碾磨成匀浆 ,转入离心管 ,在 4℃、10 000 r·min-1离心 20 min ,上清液即为酶液 。
1.2.2　PPO 酶活性的测定　取酶液 0.2 mL 加入 3 mL磷酸缓冲溶液置水浴中 10 min ,再加入邻苯二酚
溶液 0.5 mL。混合后立即转入比色皿在波长 470 nm 处测定光密度值 OD470 ,每 30 s读数 1次 ,共读 3
min。以每分钟光密度值增加 0.001为一个酶活单位。重复 3次 ,测定结果用 SAS 数据处理系统进行方
差分析和差异显著性检验 。
1.2.3　PPO 最适 pH 值测定　将酶促反应液分别于不同 pH 值(5.0 、6.0 、7.0 、8.0)、温度 25℃的磷酸缓
冲液中测定 PPO活性。
1.2.4　PPO 最适底物浓度测定　将酶促反应液于筛选出的最适 pH 值缓冲液中 ,分别加入不同浓度
(0.02 、0.06 、0.10 、0.14 、0.18 、0.22 mol·L-1)的邻苯二酚溶液 0.5 mL ,测定 PPO活性。
1.2.5　PPO 最适温度测定　将酶促反应液于筛选出的最适 pH 值缓冲液中 ,分别置于不同温度水浴(15 、
25 、35 、45 、55 、65 、75 、85℃)10 min ,加入 0.5 mL 筛选出的最适浓度的邻苯二酚溶液 ,测定 PPO活性。
1.2.6　抑制物对 PPO活性的影响　在筛选出的最适反应体系中分别加入不同浓度(0.01 、0.02 、0.04 、
0.06 、0.08 、0.1 mol·L-1)、不同抑制物(分别为 Na2SO4 、柠檬酸 、Vc)溶液 0.2 mL ,反应 10 min后加入三
氯乙酸 1 mL 中止反应 ,于 470 nm处测定光密度值 。以不添加抑制物的酶液作对照 。
2　结果与分析
2.1　PPO的最适 pH 值
由表 1可以看出 ,缓冲液 pH 值对 PPO活性有极显著影响 ,pH 值为 7.0时的 PPO 活性最大 ,极显著
地高于其它 pH 条件。由图 1可知 ,pH 值过低或过高都会降低酶的活性。pH 值<5.0时 ,酶活性大幅下
降 ,这主要是由于 PPO是一组含铜蛋白 , Cu2+是酚类合成及氧化酶类的组成成分与辅助因子[ 1] 。pH 值
低时 ,酚中的铜被解离出来使酶失活。当 pH值在 5.0 ～ 7.0之间时 ,酶有较高的活性 ,为适宜的 pH 范围 。
pH值为 7.0时 ,酶活性最高 ,为酶活性的最适 pH 值 。当 pH 值高于 7.0时 ,随着 pH 值的升高 ,酶活性急
剧下降。因为 pH 高时 ,酶蛋白与铜脱离成不溶的氢氧化铜 ,而使酶失活[ 7 ,8] 。所以选定 pH 7.0为华盖木
PPO酶活性测定的条件。一般认为 PPO 的最适 pH 值在 6.0 ～ 7.4 范围[ 9] ,本试验结果中 pH 值为 6 时
PPO活性略低于 pH 值为 5时 ,但二者之间没有显著差异 ,这有可能是由于测定时取材的差异导致了误
差 ,应进一步进行实验加以验证。
表 1　不同反应条件下 PPO活性差异显著性检验
反应条件 pH 邻苯二酚/ mol·L
-1
4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 0.02 0.06 0.10 0.14 0.18 0.22
PPO 活性 112D 154B 139BC 184A 152B 125CD 111D 164C 176C 218A 196B 178C
反应条件 温度/ ℃
15 25 35 45 55 65 75 85
PPO 活性 16B 31A 35A 20B 18B 15B 6C 0C
＊:表中字母标记结果为 SAS 多重比较结果 , 显著水平 99%, 下同。
·18· 福 建 林 业 科 技 第 36 卷
2.2　PPO最适底物浓度
在植物中 ,PPO最丰富的基质底物是邻苯二酚和一元酚类 ,而反应最快的是邻羟基结构的酚类[ 9] 。
所以选择邻苯二酚作为酶活性测定的底物。由表 1 和图 2可以看出 ,底物浓度对酶活性有极显著影响 。
底物浓度过低或过高都会使酶活性下降 。当底物邻苯二酚浓度低于 0.14 mol·L-1时 ,随着底物浓度的升
高 ,酶活性极显著上升。因为酶活性是通过测定产物的生成速度来表示的 ,所以在一定范围内随着底物浓
度的增加 ,酶活性增加 ,产物生成速度加快。当底物浓度高于 0.14 mol·L-1时 ,酶活性极显著下降。这可
能是由于底物浓度过高对氧化反应产生了抑制作用 。所以 0.14 mol·L-1为邻苯二酚作底物测定华盖木
多酚氧化酶活性的适宜浓度 ,此时 PPO 活性极显著地高于其它底物浓度下 PPO的活性。
2.3　PPO的最适温度
温度对 PPO的活性有着极显著的影响。一方面 ,提高温度可以增加酶促反应速度;另一方面 ,酶的本
质是蛋白质 ,温度过高可引起蛋白质的变性 ,导致酶失活。由表 1和图 3可以看出 ,当温度由 15℃升至
25℃时 ,PPO酶活性极显著增强。因为温度过低 ,酶易失活 ,达到 25℃时 ,植物体的生化过程基本都能有
效进行 。随着温度继续升高 ,酶活性仍有加强。35℃时 ,酶活性达到最高 ,极显著地高于其它温度条件 。
而当温度超过 35℃后 ,随着温度的升高 ,酶活性极显著降低 ,到 85℃时 ,反应完全停止 。所以 35℃是华盖
木多酚氧化酶作用的最适温度 ,也是测定酶活性的适宜温度 。
2.4　抑制物对 PPO 活性的影响
由表 2可以看出 ,Na2SO4 、柠檬酸 、抗坏血酸(Vc)对华盖木 PPO 的活性均有极显著的抑制效果 ,但当
抑制物达到一定浓度后 ,继续增加抑制物浓度 ,反应体系 OD值没有显著变化 ,即抑制效果己达到饱和 。
由图 4可以看出 ,随着抑制物浓度的增加 ,反应体系的 OD值下降 ,即随着抑制物浓度的增加 ,产物的生成
减少 ,说明随抑制物浓度的增加 ,对 PPO 活性的抑制作用加强。在 3 种抑制剂中 ,加 Vc 的反应体系 OD
值最低 ,说明生成的产物最少 ,抑制效果最明显 ,这与吴锦程等[ 1]的试验结果一致。Vc对 PPO的抑制作
用主要有 3个方面:将酚的氧化产物还原成酚;与酶分子中的 Cu2+螯合 ,使 PPO 失活;被 PPO直接氧化 ,
起到竞争抑制剂的作用[ 10 ,11] 。所以 ,加入抗坏血酸是抑制多酚氧化酶活性的一个有效方法。但在应用时
应注意 Vc的加入会降低体系的 pH 值 ,可能引起材料其它的生理不适反应 。
3　结论与讨论
通过对华盖木多酚氧化酶酶学特性的研究可以看出 ,反应体系的 pH 值 、温度 、底物浓度都会对华盖
·19·第 1 期 马　均 ,等:华盖木多酚氧化酶酶学特性研究
表 2　不同抑制物及不同抑制物浓度对 PPO活性影响的差异显著性检验
抑制物浓度/mol·L-1 Na2SO 4处理体系 OD值 柠檬酸处理体系 OD 值 Vc处理体系 OD值
0.01 1.130 A 0.723 A 0.635 A
0.02 0.904 B 0.456 B 0.317 B
0.04 0.804 BC 0.347 C 0.142 C
0.06 0.743 C 0.325 C 0.136 C
0.08 0.706 C 0.320 C 0.132 C
0.1 0.695 C 0.313 C 0.118 C
木 PPO的活性产生极显著影响 。pH 7.0时 ,酶活性最高 , pH 值过高或过低都会降低酶活性;温度升高 ,
酶促反应加快 ,当温度达到 35℃时 ,反应达到最快 ,温度继续升高 ,反应速度降低;在底物邻苯二酚浓度低
于0.14 mol·L-1时 ,随底物浓度的升高 ,反应速度加快 , 0.14 mol·L-1时达到最快 ,底物浓度超过 0.14
mol·L-1后 ,浓度再升高 ,反应速度下降 。Na2SO4 、柠檬酸 、抗坏血酸(Vc)对华盖木 PPO 的活性均有一定
的抑制效果 ,且随抑制物浓度的增加 ,对 PPO 活性的抑制作用加强。其中 Vc抑制效果最明显 ,Vc浓度达
到 0.04 mol·L -1后 ,继续加大 Vc浓度 ,抑制效果加强不明显。
植物体内褐化现象的发生主要是由于 PPO 催化体内酚内物质氧化成醌而产生的。所以 ,研究 PPO
的酶学特性又成为了研究华盖木褐变现象的必要内容 。依据本次试验研究结果 ,在以后的华盖木育苗过
程中 ,可以通过控制培养基的 pH 值(5.5 ～ 6.0)、培养温度(20 ～ 25℃)和添加适宜抑制物(如 Vc),以降低
PPO活性 ,减轻褐化现象。但这些手段在应用的时候也存在一定的问题 ,比如培养温度偏低会使材料的
代谢减弱 ,从而影响生根;基质 pH 值较低也可能会引起材料的生理不适应;而在组织培养时 ,可在培养基
中添加抑制剂以期减轻褐化 ,但抑制剂的加入又会强烈改变培养基的 pH 值和离子平衡 ,可能引起新的问
题。所以 ,在根据 PPO的酶学特性进行褐化控制的时候要综合各种因素考虑 ,协调各种因素之间的相互
关系才能取得理想的效果 。
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