全 文 ：第 24卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004年　4月
Vol.24　No.2　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH April 　2004
转录因子 DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建
李　晶　朱延明 　李　杰
(东北农业大学 , 哈尔滨　150030)
摘　要　根据GenBank 中已发表的转录因子 DREB1A基因的 cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通
过 RT-PCR的方法从低温处理的拟南芥总 RNA中扩增出DREB1A基因的全长 cDNA片段。将其克
隆到 pMD18 T-vector中 。经测序证明该片段与 GenBank上报道的序列具有 99.8%的同源性。2个
碱基的置换导致了一处氨基酸的差异 ,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上 ,推测其不会影响
基因功能。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由组成型启动子 35S调控的 DREB1A 基因的植物
表达载体 pBDR35S ,为利用DREB1A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。
关键词　转录因子;DREB1A;基因克隆;植物表达载体构建
Cloning of transcription factor DREB1A gene and the
construction of plant express vector
LI Jing　ZHU Yan-Ming＊　LI Jie
(Northeast Agricultural University , Harbin　150030)
Abstract　According to the cDNA sequence of transcription factor DREB1A gene in GenBank a pair of primer
was designed and synthesized.Using the total RNA of low temperature treated Arabdopsis thaliana seedling
as templet , the full length of cDNA of DREB1A gene w as amplified through method of RT-PCR.It w as
cloned into pMD18 T vector.DNA sequencing indicated that the cloned fragment showed 99.8%identity to
the sequence of the gene in GenBank.The Two bases change leads to only one amino acid changed.But the
changed amino acid is not in the function domain so the cDNA will have the normal physiology function.The
plant express vector pBch was digested and ligated with the cloned cDNA fragment and got the DREB1A gene
express vector pBDR35s regulated by 35S promoter.
Key words　transcription factor;DREB1A;gene cloning;construction of plant express vector
干旱 、低温和高盐是农业生产中常见的逆境形
式 ,在许多地区成为农业发展的瓶颈 。这些环境胁
迫因子均可引起植物细胞脱水 ,从而诱导植物体内
许多基因的表达。根据已知蛋白的顺序同源性已经
推测了这些基因编码的许多蛋白质的功能 。归纳起
来 ,脱水胁迫诱导基因产物的功能大致可分为两种
类型 ,第一类是在植物中直接参与抗逆反应的功能
蛋白质 ,第二类是在信号转导及逆激基因表达过程
中起调节作用的蛋白质因子。尽管人们已经将大量
的抗旱 、抗寒及抗盐碱的相关基因应用于植物抗逆
性的改良[ 1～ 3] ,但多数结果不尽人意。植物对非生
物胁迫逆境抗性性状往往是由多基因控制的复杂生
通迅作者
第一作者简介:李晶(1970—),女,博士 ,副教授 ,主要从事植物学教学及植物基因工程的研究
收稿日期:2003-10-05
命过程 ,通过单基因改良的方式很难奏效 ,采用调节
基因策略 ,适合的转录因子不失为一个好的选择。
真核生物转录因子是近十几年来发现的一类在真核
基因转录时起调节作用的蛋白质。它们的作用是增
强或阻遏基因的转录起始 ,或者参与决定基因在何
种组织与何种发育阶段开始转录 ,也有的参与基因
应答外界环境因素所诱导的转录。
转录因子 DREB1A 是在拟南芥中克隆并鉴定
的[ 4] ,它能在干旱 、低温及高盐胁迫条件下调控报告
基因的表达 ,并在上述逆境胁迫信号传递中起重要
作用[ 5 , 6] 。由于 DREB1A转录因子可以调控多个与
植物干旱 、低温及高盐耐性有关的功能基因的表达 ,
因此 ,利用该转录因子来改良植物抗逆性较单基因
的遗传转化有明显优势。本研究从低温处理的拟南
芥中克隆了 DREB1A 基因的 cDNA ,并构建了由
CaMV35S启动子调控的植物表达载体 ,为进一步利
用DREB1A基因综合改良植物抗逆性提供了物质基
础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana )为 Columbia生态
型。
1.1.2　菌株和质粒
载体pMD18 T-vector购自大连宝生物工程有限
公司。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α和质粒
pBch均由东北农业大学生命科学院植物生物工程
研究室保存 。
1.1.3　试剂
Taq酶 、各种限制性内切酶 、氨卞青霉素 、IPTG 、
X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公司;
T4DNA连接酶购自 Promega公司;TRIzol Reagent和
AMV逆转录酶购自 Gibco-BRL 公司;DNA 回收试
剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;其他各种试
剂均为国产分析纯。基因测序由大连宝生物有限公
司完成。
1.2　方法
1.2.1　拟南芥 cDNA的制备
将拟南芥幼苗置于 4℃低温处理 1 h ,取叶片 ,
用 TRIzol试剂一步法提取植物总 RNA(操作步骤参
照产品说明书)。以总 RNA为模板 ,经反转录得到
cDNA(具体操作按照 AMV 逆转录酶使用说明书进
行)。
1.2.2　DREB1A基因的 PCR扩增
据GenBank 上发表的 DREB1A 基因的 mRNA
序列 ,应用 Primer Premier 5.0软件分析其内部酶切
位点情况 ,设计了一对引物 ,并根据后续构建植物表
达载体的需要 ,在上游引物一端加入一个 BamHⅠ位
点 ,在下游引物一端加入了 Kpn I位点。
上游引物:5′g↑gatcc tttcagcaaaccatac-3′
下游引物:5′ggtac↑c ttacactcgtttctcag-3′
以 cDNA为模板进行 PCR扩增 。反应条件如
下:94℃预变性 10 min;94℃变性 30 sec;56℃退火
30 sec;72℃延伸 60 sec;共 30个循环 。72℃延伸 10
min ,4℃终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检
查 ,采用上海华舜小量胶回收试剂盒回收纯化 ,用于
下一步反应。
1.2.3　DREB1A基因的克隆
利用PCR产物在3末端自动加A及pMD18 T-
vector上多克隆位点突出 T 的特点 ,将克隆到 DNA
片段与 pMD18 T-vector连接获得的重组质粒命名为
pTDR ,转化大肠杆菌 E.coli DH5α,在含有 IPTG和
X-gal的 LB/Amp平板上筛选白色菌落 ,对重组子进
行酶切鉴定 ,并对该片段进行测序。
1.2.4　植物表达载体的构建
pBch为带有CaMV35S启动子的非特异性植物
表达载体 ,在35S启动子下游有BamHⅠ和KpnⅠ等多
克隆位点 ,可供外源基因插入并使其在植物细胞中
表达。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒 pTDR ,回收
DREB1A 的 cDNA 片段。同样用BamHⅠ和KpnⅠ双
酶切质粒 pBch ,回收载体片段。将两个片段进行连
接 ,转化大肠杆菌 DH5α。在含有 Km 的 LB培养基
平板上筛选转化菌落。提取质粒并进行 BamHⅠ和
KpnⅠ双酶切鉴定 ,将重组质粒命名为 pBDR35S。
以上各步骤中连接反应 ,大肠杆菌感受态制备 、
转化及酶切反应等参考王关林[ 7]的方法。
2.　结果
2.1　DREB1A基因 cDNA的 RT-PCR扩增
根据报道[ 4] DREB1A基因在拟南芥中 4℃低温
1 h后表达水平达到最高 ,将拟南芥植株于 4℃低温
处理 1 h后取其叶片 ,TRIzol试剂一步法提取植物
总 RNA ,逆转录酶进行反转录。以反转录得到的
cDNA第一条链为模板 ,以水代替模板为阴性对照 ,
进行 PCR扩增得到一个约 800 bp左右的DNA片段
(图 1),与 GenBank上报道的长度一致 。
212 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24卷
图 1　PCR产物分析
Fig.1　Analysis of PCR amplification product
2.2　克隆载体的构建
利用PCR产物在3 末端自动加A及 pMD18 T-
vector上多克隆位点突出 T 的特点 ,将得到的 DNA
片段与pMD18 T-vector连接 ,获得的重组质粒命名
为 pTDR ,转化大肠杆菌 E.coli DH5α,在含有 IPTG
和X-gal的 LB/Amp平板上筛选白色菌落 ,对重组子
进行PCR及 BamHⅠ和 KpnⅠ双酶切鉴定 ,证明已经
将克隆到的 cDNA 片段连接到 T-vector 上。对 pT-
DR中的插入片段进行序列分析。
2.3　DREB1A基因 cDNA的序列分析
测序结果表明该片段长度为862 bp ,与 Gen-
Bank上报道的 DREB1A基因的 cDNA序列比较 ,长
度一致 ,在编码区内只有 2个碱基的变化 ,可以确定
克隆到的 DNA片段就是 DREB1A基因。发生改变
的两个碱基是 526位的 t被 c替代 ,609位的 g 被 a
替代。用 GeneDoc软件将克隆到的 cDNA 序列转换
为蛋白质序列(图 2)后 ,可知其中 t ※c 的置换导致
了氨基酸的变化 ,由原来的酪氨酸(Y)变成了组氨
酸(H),而 g※a的置换没有导致氨基酸的变化(GGC
和AGC均编码甘氨酸)。DREB1A转录因子与 DNA
特异性结合的区域非常保守 , 由 58 个氨基酸组
成[ 8] ,被称为 ERF/AP2 结构域。Yoh Sakuma 和
Qing Liu等[ 9]研究了 ERF/AP2结构域的氨基酸组
成及特点 ,发现其中第 14位的缬氨酸(V)和第19位
的谷氨酸(E)与蛋白质和 DNA的特异性结合关系密
切 ,这两个氨基酸的变化会使转录因子与 DNA序列
中DRE元件的特异结合能力显著下降 ,而其它氨基
酸的变化对两者的结合没有明显的影响。我们克隆
到的 DREB1A基因的 cDNA片段与原序列相比虽然
有一个氨基酸的变化 ,但这个氨基酸的位置不在
DNA结合的结构域内 ,保证了结构域内 2个重要氨
基酸没有任何改变 ,因而基因的产物应具有正常的
生理功能 。
图 2　DREB1A 的氨基酸序列
Fig.2　Amino acid sequence of DREB1A
阴影处为 DREB1A 基因的功能结构域;划线处为氨基酸置换;()内为原氨基酸
图 3　植物表达载体 pBDR35s 的构建
F ig.3　Construction of plant expression vecto r pBDR35
2.4　植物表达载体的构建
以植物表达载体 pBch 为基础 ,将几丁质酶基
因切下 ,替换成 DREB1A基因的 cDNA 片段 ,构建
一个含有NPT Ⅱ基因植物选择标记和CaMV35s启
动子调控的 DREB1A 基因的植物表达载体 pB-
DR35s(图 3),酶切鉴定见图 4。pBDR35s可用于农
杆菌介导的双子叶植物遗传转化 ,培育组成型表达
DREB1A 基因的转基因植株 。
3　结论
DREB1A 转录因子在基因工程方法综合性改
良植物抗逆性方面的应用前景日益受到重视[ 10] 。
虽然DREB1A 基因是在拟南芥中发现的 ,但其中与
DNA结合的 EREBP/AP2结构域的保守性很强 ,
2132期　　　　　　　　　　　李晶等:转录因子 DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建
图 4　植物表达载体 pBDR35s 的酶切鉴定
Fig.4　Identification of plant expression vector pBDR35s
研究表明含 EREBP/AP2 结构域的转录因子广泛
存在于拟南芥[ 11] 、西红柿[ 12] 、烟草[ 13] 、水稻[ 14] 、玉
米[ 15]等植物中 ,分别与细胞发育 、激素 、抗病 、低温
以及干旱 、高盐等信号传递有关 ,在各种基因表达
中起重要的调节作用。这说明 DREB1A 基因及其
在植物抗逆反应中的调控机理可能广泛地存在于
双子叶及单子叶植物中 ,它在改良植物抗逆性的基
因工程中有着可喜的应用前景 。
本研究以 4℃低温处理的拟南芥叶片为材料 ,
通过 RT-PCR方法成功地克隆到 DREB1A 基因的
cDNA 序列 ,经序列分析克隆到的片段所编码的蛋
白质应该具有 DREB1A转录因子的生理功能 。
构建了植物表达载体 pBDR35S ,该表达载体含
有NPT Ⅱ基因植物选择标记和 35S 启动子调控的
转录因子 DREB1A 基因 ,35S为非特异性表达的组
成型启动子。该启动子表达具有持续性 , RNA 和
蛋白质表达量也是相对恒定 ,不表现时空特异性 ,
也不受外界因素诱导 ,可用于 DREB1A基因在双子
叶植物中的组成型表达 。为利用 DREB1A基因改
良植物抗逆性及进一步探讨 DREB1A基因的抗逆
分子机理提供了物质基础 。
参　考　文　献
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