全 文 ：第 23 卷 第 1 期 植 物 研 究 2003年 1 月
Vol.23 No.1 BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 2003
云南松外生菌根真菌分离培养研究
于富强 纪大干 刘培贵＊＊
(中国科学院昆明植物研究所 , 昆明 650204)
摘 要 就滇中一带云南松林进行了多次调查 ,共采集 、鉴定标本 130余号;从中选取 13科 , 19
属 ,33种真菌进行了菌种分离 、培养的研究。选用并修改 4种培养基进行了外生菌根真菌分离 、
培养的比较 ,结果共有 11科 , 17属 ,25种真菌分离获得成功 ,成功率高达 75.8%,4种培养基的分
离成功率依次为 36.4%、63.6%、33.3%和 57.6%。其中 ,修改 PDA培养基和松针 、玉米培养基
较适宜于云南松外生菌根真菌的分离 、纯化和培养 。
关键词 云南松;外生菌根真菌;纯培养
STUDIESON PURE CULTURE OF THE ECTOMYCORRHIZAL
FUNGI ASSOCIATED WITH PINUS YUNNANENSIS
YU Fu-Qiang JI Da-Gan LIU Pei-Gui＊＊
(Kunming Institute of Bo tany , Chinese Academy of Sciences , Kunming 650204)
Abstract Several surveys w ere carried out under Pinus yunnanensis Franch forest in Central Yun-
nan;the total collections are over 130.33 species , belonging to 19 genera , 13 families were selected
to supply a diversity of pure cultures.4 types of media were selected for the pure culture study of ec-
tomycorrhizal fungi.As a result , pure cultures of 25 species , 17 genera , and 11 families w ere ob-
tained.The total isolation success rate reached 75.8%;the success rate of 4 media (No.1 , No2 ,
No.3 , No.4)was 36.4%, 63.6%, 33.3% and 57.6% respectively.Modified PDA medium (No.
2)and pine needles medium (No.4)are more suitable for the isolation , purif ication and maintenance
of ectomycorrhizal fungi associated wi th P.yunnanensis.
Key words Pinus yunnanensis Franch;ectomyco rrhizal fungi;pure culture
云南地处我国西南 ,地质 、地貌独特 ,气候条件
优越 ,植被树种多样 、独特 ,是中国也是世界真菌资
源最丰富的地区之一 。云南松是我国西南部尤其
是云南省境内主要分布树种之一 ,在滇中高原的山
地分布极广 ,除云南的大部分地区外 ,北边一直分
布到四川的西昌 、木里 ,东北分布至贵州的毕节 、水
城 ,东部延至广西的西部 ,其成林分布的西部界线
在西藏察隅一带。在垂直分布上 ,云南松林所占海
拔范围很大 ,以 1500 ～ 2800 m 范围内分布最为集
中 ,与大型真菌集中分布的海拔范围大致相吻合;
大型真菌种类繁多 ,其中绝大多数为外生菌根真
菌[ 1] 。
基金项目:国家自然科学基金(No 30070004)、云南省自然科学基金(No 2000C0068M)
第一作者简介:于富强(1976-),男 ,山东人 ,硕士 ,主要从事真菌分类 、菌根学及食用菌引种驯化研究。
收稿日期:2002-08-16
＊＊通信作者
外生菌根研究具有重要的研究和应用价值 。
目前 ,外生菌根技术已广泛应用于树木引种驯化 、
菌根化育苗 、逆境造林 、经济林木栽培 、防止苗木根
部病害 、菌根食药用菌的生产等方面。云南松林下
具有丰富的外生菌根资源 ,但尚缺乏全面 、系统的
研究 。云南松外生菌根的研究 ,对我国西南部尤其
是云南省生态系统的恢复与重建 、农林园艺业生产
以及社会经济的发展等方面具有重要的意义 。
外生菌根真菌的分离培养是外生菌根 、大型真
菌研究和应用的前提与基础 ,无论是进行菌种的扩
繁 、菌剂的制备 、菌根及菌根真菌的生物学研究 ,还
是珍稀濒危真菌种质资源的保护 、野生菌根食菌的
引种驯化 ,都需要对外生菌根真菌进行分离 、培养 ,
获得纯菌株 。由于外生菌根真菌与林木之间为复
杂的共生关系 ,其共生机理涉及到的代谢产物等诸
多方面不明 ,许多菌根真菌的分离培养比较困难 。
因此 ,摸索菌根真菌的生物学特性 ,严格分离的技
术要求 ,配制合适的培养基等就成为菌根真菌分离
培养成功与否的关键[ 2] 。为此 ,将国内外较为常
用的 PDA和 MMN 培养基作了适当的修改 ,并自
行配制了另外 2种培养基 ,对 13科 ,19属 ,33种真
菌进行分离 、培养比较研究 ,并对所得菌株生长状
况进行了观察 、记录与分析。
1 材料与方法
1.1 外生菌根真菌的采集 、鉴定 、确认与分离培养
1.1.1 外生菌根真菌的采集和鉴定
2000年和 2001年雨季对昆明市辖区内的昆
明植物园 、黑龙潭公园 、老白龙 、筇竹寺及嵩明县的
阿子营 、白邑两乡的云南松林进行了普遍的踏查 ,
共采集 、鉴定标本 130余号。从中选取了 13科 ,19
属 ,33种真菌进行了菌种分离 、培养比较研究。
野外采集过程中 , 详细记录新鲜子实体的特
征 ,并绘制必要的特征图 ,同时制作孢子印 ,记录孢
子印的颜色。将标本烘干 ,带回实验室制作临时切
片 ,进行显微特征的观察 ,结合新鲜标本的特征及
孢子印颜色 ,进行综合鉴定。引用标本均存放于中
国科学院昆明植物研究所隐花植物标本馆
(HKAS)。
1.1.2 外生菌根真菌的确认
找出真菌子实体基部根状菌索或菌丝与宿主
根部之间的连接 ,然后确定连接附近宿主营养根部
有外生菌根形成。
抽取部分种类进行回接实验。接种方法为袋
装云南松幼苗人工接种 ,菌剂采用纯培养物和子实
体。3个月后采集菌根标本 ,在解剖镜下进行形态
特征的观察 、记录和拍照 。利用常规石蜡切片法制
作永久封切片 ,在高倍显微镜下进行菌根解剖特征
的观察 、记录和拍照;最后综合分析 ,确认是否为云
南松外生菌根真菌 。将另行报道 。
1.1.3 外生菌根真菌的分离 、培养
所有分离工作均在超净工作台上完成 。分离
中尽量选择新鲜幼嫩 、无病虫害的完整子实体 ,及
时进行分离。每个种用 4种培养基同时进行分离
培养 ,每个处理设 3 个重复 ,从子实体不同部位进
行分离。将试管放入恒温培养箱中 , 25℃下培养 。
4 ～ 5 天后检查培养基斜面是否有污染 ,有污染者
及早剔除 。根据外生菌根真菌菌丝体直接从接种
块上长出 、生长较慢及同种真菌形成的菌落形态一
致等特点 ,初步确定所分离是否为外生菌根真菌纯
培养物 ,对其生长特征进行详细观察和记录[ 3] 。
1.2 培养基配方
培养基配制采用通用的操作程序与方法 , 4种
培养基及其组分如表 1。
表 1 培养基及其组分
Table 1 The media and their ing redients
成分
Ingredien ts
修改 MMN 培养基
Modified MMN
Medium(No.1)
修改PDA 培养基
Modi fied PDA
Medium (No.2)
乳牛肝培养基
Sui llus granu latus
Medium(No.3)
松针 、玉米培养基
Pine needles corn
Medium (No.4)
马铃薯(g) (鲜重)150
点柄乳牛肝菌(g) (鲜重)150
云南松松针(g) (鲜重)150
玉米(g) (鲜重)150
酵母浸膏(g) 5 5
671 期 于富强等:云南松外生菌根真菌分离培养研究
麦芽汁(g) 10 10
琼脂(g) 17 17 17 17
葡萄糖(g) 10 10 10 10
蛋白胨(g) 2 2 2 2
柠檬酸(g) 0.1 0.1 0.1 0.1
KH2PO 4(g) 0.5 0.5 0.5 0.5
CaCl2·2H2O(g) 0.5 0.5 0.5 0.5
FeCl3(1%溶液)(mL) 1.2 1.2 1.2 1.2
M gSO 4·7H2O(g) 0.15 0.15 0.15 0.15
(NH4)2HPO 4(g) 0.25 0.25 0.25 0.25
VB1(mg) 10
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
蒸馏水(mL) 加至 l000 加至 l000 加至 l000 加至 l000
表 2 外生菌根真菌种名 、共生关系 、分离成功率 、产地及引证标本
Table 2 The species name , symbio tic relationship , isolation success rate , locality and specimens cited of ectomyco rrhizal fungi
种名
Species name
共生关系
S ymbiotic relationship
分离成功率
Isolation success rate(%)
产地
Locality
引证标本
Specimens
Agaricus macrosporus＊ Sap rophytic 100(12/ 12#) AZY HKAS38680
Amani ta farinosa PECMF 25(3/ 12) BY HKAS38679
A.pseudoporphyria ＊ ECMF 33.3(4/ 12) HLT HKAS38700
A.pseudovaginata＊ ECMF 0(0/ 12) LBL HKAS38706
A virgineoides ECMF 16.7(2/ 12) AZY HKAS38683
Greastrum hyg romet-
ricum ＊
ECMF 50(6/ 12) KBG HKAS38685
Bolet inus pinetorum ＊ ECMF 33.3(4/ 12) LBL HKAS38694
Boletus aereus ECMF 50(6/ 12) KBG HKAS37423
B.albidus＊ ECMF 41.7(5/ 12) BY HKAS38681
B.ed ulis ECMF 58.3(7/ 12) AZY HKAS38686
B.gr iseus ＊ ECMF 58.3(7/ 12) BY HKAS38696
Can tharel lus minor ＊ ECMF 0(0/ 12) HLT HKAS38711
Chroogom phis tomen tosus PECMF 0(0/ 12) LBL HKAS38684
Inocybe fast igiata ECMF 8.3(1/ 12) BY HKAS38703
Laccaria amethystea＊ ECMF 50(6/ 12) LBL HKAS38702
Lactarius ha tsudake ＊ ECMF 66.7(8/ 12) QZHS HKAS38689
L.echinatus ＊ ECMF 0(0/ 12) BY HKAS38695
Lycoperdon perla tum ＊ PECMF 100(12/ 12) KBG HKAS38687
L.wr ight ii ＊ PECMF 100(12/ 12) LBL HKAS38692
Pisolithus t inctor ius＊ ECMF 100(12/ 12) HLT HKAS38710
Ramariacf.f laviceps OECM F 8.3(1/ 12) AZY HKAS38704
Russu la nauseosa＊ PECMF 0(0/ 12) LBL HKAS38705
R.nigr icans ECMF 25(3/ 12) LBL HKAS38676
R.sangu inea ECMF 0(0/ 12) BY HKAS38677
R.virescens＊ ECMF 0(0/ 12) HLT HKAS38699
68 植 物 研 究 23 卷
S cleroderma cit rinum ＊ PECMF 100(12/ 12) AZY HKAS38690
Sui llus gran ulatus＊ ECMF 8.3(1/ 12) QZHS HKAS38709
S .pictus＊ ECMF 8.3(1/ 12) LBL HKAS38697
Thelephora ganbajun ＊ ECMF 25(3/ 12) HLT HKAS38691
Tricholoma f lavovirens＊ ECMF 33.3(4/ 12) LBL HKAS38688
T.matsu take ＊ ECMF 0(0/ 12) AZY HKAS38698
Tylopi lus bal loui i ＊ ECMF 75(8/ 12) HLT HKAS38693
T.f el lus ECMF 16.7(2/ 12) AZY HKAS38678
(1)ECMF=Ectomycorrhizal fungi associatedw ith Pinus yunnanensis(云南松外生菌根真菌), PECMF=Putat ive ectomycorrhizal fungi as-
sociated w ith Pin us yunnanensis(可能云南松外生菌根真菌), OECMF=Ectomycorrhizal fungi associated w ith other t rees(其他树种外生菌根
真菌), Saprophytic=(腐生)。
(2)KBG=Kunming Botanic Garden(植物园), HLT=Heilongtan(黑龙潭), LBL=Laobai long (老白龙), QZHS=Qiongzhusi(筇竹寺),
AZY=Aziying (阿子营), BY=Baiyi(白邑)。
(3)以＊标记者为进行人工接种实验种类;以#标记者为:分离成功的试管数/分离的总试管数。
2 结果
对 13科 ,19属 , 33种真菌进行了菌根真菌分
离培养研究 ,共有 11科 , 17属 ,25种真菌分离获得
成功 , 4科 ,5属 ,8种真菌未获得纯培养 ,分离成功
率达 75.8%, 远高于其他文献同类报道(表
2)[ 3 ,4] 。4种培养基的分离成功率依次为 36.4%、
63.6%、33.3%和 57.6%。其中以修改 PDA 培养
基分离效果为最好 ,松针 、玉米培养基次之 ,乳牛肝
培养基效果最差 。不同种类 、不同共生关系的真菌
在不同的培养基上分离 、培养结果存在着一定的差
异(表 3)。
3 讨论
实验结果表明 ,修改 PDA培养基和松针 、玉米
培养基分离成功率较高 ,适应于多数菌种的分离 、
培养 ,是比较理想的菌根真菌分离培养基。修改
MMN 培养基和乳牛肝菌培养基分离效果较差 ,其
中修改 MMN 培养基是人们在菌根真菌分离中所
经常采用的 ,只需对其进行微小的改动 ,加入马铃
薯煮液即可成为修改 PDA 培养基 ,然而二者的分
离效果却相差很大 ,是否马铃薯中的淀粉或其他类
物质在起作用 ,值得继续深入研究 。
菌根真菌对基质有着特殊的营养要求 ,天然基
质组成的培养基比人工合成的培养基更有利于其
生长 。基质中添加马铃薯 、玉米及松针等相关天然
物质煮液能促进菌根真菌的生长发育(如:松针 、玉
米培养基),但是加入外生菌根真菌(如:乳牛肝菌)
煮液分离效果却很差 ,这可能与菌根真菌之间的竞
争性拮抗物质的存在具有一定的关系 ,尚需进一步
验证 。
实验统计结果表明 ,不仅不同菌根真菌对生长
基质的要求有较大的差异 ,有时同种真菌不同个体
之间分离效果也会存在着差异 。马勃目和硬皮马
勃目真菌很容易分离成功 ,能在大多数培养基上进
行分离 、培养;蘑菇科 、牛肝菌科 、鹅膏菌科 、口蘑科
和革菌科等真菌分离成功也不困难;而红菇科和丝
膜菌科真菌的分离具有一定的难度;铆钉菇科和鸡
油菌科的真菌则很难分离成功。
从纯培养菌株的生长特征可以看出 ,除了光硬
皮马勃和彩色豆马勃菌丝呈淡黄至黄褐色外 ,大部
分菌丝体呈现白色。马勃类和硬皮马勃类等真菌
不但容易分离 ,而且菌丝生长速度快 、长绒状 、多具
大量气生菌丝 ,易于进一步培养和保藏 。牛肝菌类
真菌的菌丝多从接种块边缘长出 、棉絮质 、菌丝浓
密 、生长速度缓慢;红菇科 、鹅膏科和口蘑科真菌菌
丝短或长绒状 ,无或少气生菌丝 ,生长速度慢 ,十分
不利于进一步的研究和应用 。因此进一步筛选合
适的培养基 ,摸索适宜的分离 、培养条件 ,以提高菌
丝的生长速度 ,对于这些生长缓慢的菌根真菌的基
础和应用研究将具有十分重要的意义 。
真菌分离部位的比较结果表明 ,分离的成功与
否与所取部位的菌丝组织的结构和类型有关 。一
般伞菌类的子实体 ,分离菌盖和菌柄连接处的菌肉
组织较好;但是对于红菇科真菌 ,因其菌肉主要由
已经失去分生能力的泡囊菌丝组成 ,很难分离成
功 ,而选择其菌柄内侧接近外表皮处的非泡囊菌丝
进行分离 ,可获得较高的成功率。对于硬皮马勃目
691 期 于富强等:云南松外生菌根真菌分离培养研究
70 植 物 研 究 23 卷
和块菌目真菌 ,分离未成熟的造孢组织 ,比较容易
获得成功。马勃目真菌则以分离革质周皮内面组
织的效果为最好 。
仍有 4科 ,5 属 , 8种真菌未获得纯培养 ,除了
这些菌根真菌自身原因 ,难于分离 、培养外 ,主要是
由于没有筛选到合适的培养基和适宜的培养条件 。
因此 ,在此基础上进一步的菌根真菌分离 、培养研
究尚待深入。
参 考 文 献
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2.弓明钦 ,陈应龙 , 仲崇禄.菌根研究及应用.北京:中国林
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Agriculture.I nterna tional Myco rrhizal Workshop.Kaiping
China , 1994 , 2 , 70～ 76
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711 期 于富强等:云南松外生菌根真菌分离培养研究