全 文 ：第 23 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　10 月
Vol.23　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2003
酿酒酵母 HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建
付　畅1 , 2　杨传平1＊＊　刘桂丰1　李淑娟1　姜　静1
(1.东北林业大学森林资源与环境学院 , 哈尔滨 150040)
(2.哈尔滨师范大学生命科学与环境学院 , 哈尔滨　150080)
摘　要　HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母 AS2.375菌株的 DNA 为模板 ,根
据已发表的序列设计引物 ,经 PCR扩增得到约 900 bp的 HAL1基因片段 ,连接到 pMD18-T 载
体上 ,转化大肠杆菌 JM 109 ,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定 ,结果显示已克隆到完整的
可读框 ,该基因的序列与已知序列同源性达 99%。将 HAL1 基因从 T-载体上切下连接到
pAM 194载体上构建了 HAL 1基因的植物表达载体 ,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化
植株 。
关键词　酵母;HAL1基因;克隆;耐盐
CLONINGOF HAL1 GENE FROM SCCHAROMYCES CEREVISIAE
AS2.375 AND THE CONSTRUCTION OF PLANT
EXPRESSION VECTOR OF HAL1 GENE
FU Chang1 , 2　YANG Chuan-Ping1　LIU Gui-Feng1　LI Shu-Juan1　JIANG Jing 1
(1.Department of Forest Resource and Environment , Nor theast Forestry University , Harbin 150040)
(2.Department of Life and Environment ,Harbin Normal University ,Harbin　150080)
Abstract　HAL1 gene is an impo rtant salt tolerant gene in yest.To tal genomic DNA was isolated
from Sccharomyces cerevisiae AS2.375.An about 900 bp DNA fragment w as obtained w ith PCR
technique by using the primer that designed according to the published sequence.The DNA frag-
ment w as cloned to T-vector and transformed to E.coli strain JM109.The restriction map of the
recombinant plasmid w as analyzed and the DNA fragment w as sequenced.The result show ed that
the entire open reading f rame had been cloned and the identi ty of i t s sequence to the published se-
quence is mo re than 99%.After cut ting the HAL 1 fragment from the T-vecto r , we ligated the
fragment to the pAM 194 vector and obtained the plant expression vector of HAL 1 gene.The trans-
formants of tobacco wi th improved salt tolerant have been screened.
Key words　Sccharomy cescerevisiae;HAL1 gene;cloning;salt tolerant
　　全球土壤盐渍化问题日益严重 ,作物产量和
生态环境因盐胁迫受到严重影响。找到关键的耐
盐基因 ,通过遗传工程的方法培育耐盐植物对于
发展农业和保护生态环境具有重要意义 。盐胁迫
所产生的影响主要包括两方面 ,一方面是渗透胁
迫产生质膜渗透势下降引起细胞膨压的丧失和水
基金项目:国家重大基础研究发展规划项目 973项目(G19999016003)
　　作者简介:付畅(1974—),女 ,博士研究生 ,研究方向:林木遗传育种。
　　＊＊通讯作者:杨传平(1957—),男 ,博导 ,研究方向:林木遗传育种。 Tel:0451-82190006 , E-mai l:yangcp@mail.nefu.edu.cn
　　收稿日期:2003-02-06
分的丧失 。另一方面是在细胞内产生特异的离子
毒害[ 1] 。酿酒酵母具有降低 Na+内流 ,促进 Na+
外流的能力 ,并能以此阻止 Na+在细胞内过度积
累。酿酒酵母的 ENA 1基因编码 P-型 Na+-AT-
Pase ,能调节 Na+和 Li+外流 ,阻止 Na+和 Li+在
细胞内积累。酿酒酵母由于没有特异的 Na+吸
收系统 ,通过 TRK 基因编码的 K+转运系统吸收
Na+ ,而 TRK 蛋白对 K+的亲和性高于 Na+ ,因
此在细胞内优先积累 K+[ 2] 。HAL1基因是酿酒
酵母中的重要耐盐基因子 ,其表达参与调节细胞
内离子浓度[ 3 ～ 5] 。尽管 HAL1本身不是转运蛋
白 ,但在盐胁迫下能与 ENA1基因协同作用促进
Na+外排 ,与其他转运系统协同作用增加 K+的吸
收 ,保持细胞内低的 Na+/K+比 , 以减轻 Na+毒
害[ 1] 。本文介绍了酿酒酵母 HAL1基因的克隆及
植物表达载体的构建 ,将该基因成功地转入烟草并
获得了耐盐性提高的转 HAL1基因烟草植株。
1　材料与方法
1.1　菌株与质粒
　　酿酒酵母菌株 AS2.375 购自哈尔滨微生物
研究所;农杆菌菌株 LBA4404为山东师范大学逆
境植物实验室馈赠;植物表达载体 pAM194由德
国吉尔大学提供;烟草(Nicotiana tabacom)种子
“龙江 911”由牡丹江烟草研究所提供 。
1.2　主要生化试剂
　　限制性内切酶 BamH Ⅰ购自 Promega公司;
T4连接酶 、碱性磷酸酶 、Taq 酶以及克隆载体
pMD18-T 购自宝生物大连有限公司;DNA 回收
试剂盒购自鼎国生物工程公司;PCR引物合成与
DNA测序由上海生工生物工程公司和宝生物大
连有限公司完成。Lyticase 酶解酶购自上海华舜
生物工程有限公司。
1.3　酵母基因组 DNA 的提取
　　将活化的菌种接种于 YPD培养基过夜培养 ,
收集菌体后用 Ly ticase酶解酵母细胞壁获得原生
质体 ,采用 SDS裂解酵母细胞提取酵母基因组总
DNA[ 6] 。
1.4　PCR扩增
　　在 20μL PCR反应体系中加入模板 DNA 1
μL ,10×反应缓冲液 2 μL , 2.5 mmol/ L dNTP 1
μL ,5′端和 3′端引物为 5 μmol/L , Taq 酶 0.5单
位 ,94℃5 min预变性后 ,进行 PCR循环 。循环参
数为:94℃变性 45 sec ,55℃退火 45 sec ,72℃延伸
1 min ,40个循环后继续在 72℃保温 10 min 。
1.5　HAL1基因的克隆和克隆载体的构建
将 HAL1基因的 PCR产物经琼脂糖凝胶纯
化后与 T-载体连接 ,转化大肠杆菌 JM 109 ,通过
蓝白反应筛选重组质粒(命名为 pMHF)的阳性
菌 ,对重组质粒 pMHF 进行限制性酶切鉴定 、
PCR鉴定和全序列测定。
1.6　HAL1基因植物表达载体的构建
用 BamHI 单酶切重组质粒 pMHF , 回收
HAL1基因片段 。用 BamHI 单酶切植物表达载
体 pAM 194 ,载体片段经去磷后与目的片段连接 ,
得到 HAL1 基因植物表达载体(命名为 pAHF),
转化大肠杆菌 JM109。对重组质粒进行酶切鉴定
及序列测定筛选正向重组的 HAL1 基因植物表
达载体 pAHF。采用三亲杂交的方法转化根癌农
杆菌 LBA4404。
1.7　HAL1基因转化模式植物烟草及转基因烟
草的耐盐性检测
　　用农杆菌介导的叶圆盘法转化模式植物烟
草。共培养结束后 ,将叶片切块置于选择脱菌培
养基(MS+NAA 0.1 mg/L +6-BA 0.5 mg/L+
Kan 50 mg/L +Cef 500 mg/L )中 , 25℃光照培
养。将转基因烟草的芽放入含有 NaCl的生根培
养基(1/2 MS+NAA 0.5 mg/L )中 。设置 NaCl
浓度梯度为 0.8%、1%、1.25%、1.5%,检测转化
烟草的芽在含盐培养基上的生根能力。
1.8　转 HAL 1基因烟草的 PCR鉴定
　　用CTAB法提取 8个烟草转化子的基因组总
DNA ,取 1 μL 总 DNA 为模板在 20 μL PCR反应
体系中进行 PCR鉴定。
2　结果与分析
2.1　HAL1基因的 PCR扩增
　　根据已发表的序列设计引物 ,序列如下:
　　5′引物:5′-GGTCTAGAATGGATT TCAAAGATTTAGGATTGCATG-3′
Xba I
　　3′引物:5′-CGGGATCCT TTTTCAACTATTCTGTGTTGATTG-3′
BamHI
434 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
　图 1 HAL1 基因的 PCR产物分析 　图 2 HAL1基因重组质粒 pMHF的酶切鉴定
Fig.1　Analysis of PCR products of HAL1 gene Fig.2　Identification of HAL1 genere combinant plasmid pMHF
1～ 3 , PCR product of HAL1 gene;4 , negative control; 1 , recombinant plasmid;2 , Bam HI digestion products;
5 , DL2000 marker(2 000 , 1 000 , 750 , 500 , 250 , 100bp) 3 , DL2 000marker(2 000 , 1 000 , 750 , 500 , 250 , 100bp)
　图 3 HAL1 基因的植物表达载体 pAHF的酶切鉴定 　图 4　转 HAL1 基因烟草的 PCR 鉴定
Fig.3　Identification of HAL1 plant expression vectorp AHF F ig.4　I dentification of transformed plants
1:pMHF plasmid;2:BamHI digestion products of pMHF; 1 ～ 8:PCRproduct of transformed plants;
3:DL2 000 marker(2 000 , 1 000 , 750 , 500 , 250 , 100bp); 9:PCR product of untransfo rmed plant;
4:Bam HI digestion products of pAHF; 10:DL 2000 marker(2 000 , 1 000 , 750 , 500 , 250 ,
5:pAHFplasmid; 100bp);
6:DNAladder(10 000 , 8 000 , 6 000 , 5 000 , 4 000 , 3 000 , 11:PCR product of pAHFplasmid
2 500 , 2 000 , 1500bp)
　　以酿酒酵母基因组总 DNA 为模板 ,经 PCR
扩增得到了一条 900 bp左右的单一条带 ,与预期
结果一致(图 1)。
2.2　扩增产物的克隆和分析
将经过琼脂糖纯化的 PCR产物与 T-载体连
接并转化大肠杆菌 JM 109 ,将蓝白反应筛选到的
阳性菌的质粒进行限制性酶切鉴定 , 用 BamHI
酶切 ,结果得到约 900 bp的电泳图谱带 ,与 PCR
扩增带的大小相同(图 2)。
2.3　HAL1基因的序列测定结果
对重组质粒 pMHF 进行全序列测定 ,其序列
测定结果显示 ,克隆片段全长 888 bp ,含有一个
885 bp的可读框 ,与已发表序列的完整可读框全
长完全相同 ,编码一个由 295个氨基酸编码组成
的蛋白质 。该核苷酸序列与已报道的序列相比同
源性大于 99%。
2.4　HAL1基因植物表达载体的构建
　　用 BamHI 单酶切重组质粒 pMHF , 回收
HAL1基因片段 。用 BamHI 单酶切植物表达载
体 pAM 194 ,载体片段经去磷后与目的片段连接 ,
得到 HAL1基因植物表达载体 pAHF ,转化大肠
杆菌 JM 109 。对重组质粒进行酶切鉴定(图 3)及
序列测定筛选正向重组的 HAL1 基因植物表达
载体 pAHF(HAL1 基因植物表达载体构建过程
见图 5)。采用三亲杂交法将该载体转化根癌农
杆菌 LBA4404后用叶圆盘法转化烟草植株 。
2.5　转 HAL 1基因烟草的 PCR鉴定
　　用CTAB法提取 8个烟草转化子的总 DNA
4354期　　　　　　　　　　　付　畅等:酿酒酵母 HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建
图 5　HAL1 基因植物表达载体构建过程
ig.5　The construction process of plant expression vector of HAL1 gene
进行 PCR反应鉴定。在检测的 8个转化子中有6
个转化子的 PCR产物得到约 900 bp的电泳图谱
带(图 4)。初步证明 HAL1基因已整合到烟草植
株的基因组中。
2.6　转 HAL1基因烟草植株的耐盐性测试
　　将筛选出的转化子的芽转入含有浓度为
0.8%、1%、1.25%、1.5%NaCl 的生根培养基
(1/2MS+NAA0.5 mg/L )中培养 。转基因烟草
在含有 1.5%NaCl的生根培养基上能够生根 ,而
对照烟草芽在含有 0.8%NaCl的生根培养基上
不能生根。结果表明 ,所构建的 HAL 1基因植物
表达载体转化烟草后能够提高植株的耐盐性 。
3　讨论
　　盐碱地是巨大的潜在资源 ,绿化盐碱地是扩
大耕地面积 ,进一步发展农业生产 、改善生态环境
的重要措施。利用基因工程手段培育能在盐碱地
上种植的林木 ,是利用盐碱地的一条经济而有效
的途径。盐胁迫对生物体产生的毒害作用一方面
是渗透胁迫 ,另一方面是特异的离子毒害 。酿酒
酵母 HAL1基因在盐胁迫下能与促进 Na+外排
的 EN A1基因及其他转运系统协同作用保持细
胞内低的 Na+/K+比 ,以减轻 Na+毒害 ,因而在
植物耐盐基因工程上具有很大的潜力。为了培育
转耐盐基因的杨树 , 本研究克隆了酿酒酵母的
HAL1基因并构建了该基因的植物表达载体 。构
建的 HAL 1基因植物表达载体已成功地转入到
模式植物烟草中并获得了耐盐性提高的烟草转化
植株。转 HAL1 基因烟草能在含有 1.5%NaCl
的生根培养基上生根 ,耐盐性明显高于对照 。本
研究目前已将该基因转化木本植物杨树以期获得
耐盐性得到提高的转 HAL1 基因杨树 ,用于盐碱
地的改良 。
参　考　文　献
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