全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 18 卷　第 1 期 1998 年　1月
Vol.18　No.1 Jan., 　1998
中国东北落叶松属植物亲缘关系的研究
石福臣1　木佐贯博光2　铃木和夫3
(1.东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室 ,哈尔滨　150040)
(2.日本东京大学农学部附属北海道演习林 , 北海道　079-15)
(3.日本东京大学农学部 , 东京　113)
摘　要　本文用 RAPD方法对中国东北落叶松属植物的亲缘关系进行了研究。从
100个引物中筛选出41个引物 ,检测出 120个多态位点。应用 UPGMA法计算了种
群内和种群间的遗传距离 ,并构建了系统树 。实验结果表明 ,分布在长白山的落叶
松与分布在大 、小兴安岭的落叶松之间的差异 ,在遗传距离上还不能达到种间分化
水平 。分布在长白山的落叶松应视为兴安落叶松种下的变种 ,分布在东京城的落叶
松可能是兴安落叶松与长白山落叶松的杂交种。
关键词　落叶松;RAPD;遗传距离;兴安落叶松;长白落叶松
THE STUDYON RELATIONSHIP OF
LARCHES IN NORTHEAST CHINA BY RAPD
Shi Fu-chen1　Kazuo Suzuki2　Hiromitsu Kisanuki3
(1.Open Research Laboratory of Forest Plant Ecology , Northeast Forestry University , Harbin , 150040)
(2.Universtiy Foresty in Hokkaido The Universi ty of Tokyo , 079-15 , Japan)
(3.Faculty of Agriculture The University of Tokyo , 113 , Japan)
ABSTRACT　RAPD is taken to study the relationship of larches in Northeast of Chi-
na.41 primers are selected f rom 100 primers.120 Loci show polymorphism.UPGMA
is taken to calculate the genet ic distance w ithin and between populations.Systematic
t ree is constructed.The results prove that there is difference betw een larches in Daxin-
gan Mountain , Xiaoxingan Mountain , and larches in Changbai Mountain.But the ge-
net ic distance between them doesn t reach the standard of species.It is more reasonable
to regard larches in Changbai Mountain as a variaty of Larix gmalinii namely , Larix
gmelinii var.olgensis Ostenf.et sy rach larsen.
收稿日期:1997-6-10
Key words　Larch;RAPD;Genetic distance;Larix gmelinii;Larix olgensis
近年来 ,DNA分析手段的快速发展 ,为植物分类及种群内 、种群间遗传结构的分析提供
了新的方法。在分类学上 ,常用的方法有 RFLP(Restriction Fragment Leng th Polymo r-
phism),SSR(Single Sequence Repeat), SSCP(Single st rand conformation polymorphism)〔5〕 ,
RAPD(Random Amplif ied Polymorphic DNA)〔8〕。此外对保守顺序进行测序也是一种常见方
法。其中 ,用于碱基序列的解读和叶绿体 DNA 的 RFLP 等方法 ,常被应用于种间分类的研
究中 。
关于落叶松属植物种间关系的研究 ,根据叶绿体 DNA部分碱基序列的解读结果表明 ,
在系统关系上 ,未表现足够的碱基置换 。同时 , RFLP 分析结果显示落叶松属内多态很
少〔3 ,6〕 ,也没能得到充分的种内变异依据 。所以 ,本研究采用较容易检测多态的 DNA 分析
方法 ———RAPD ,对东北落叶松植物的亲缘关系进行了研究。
RAPD分析 ,可以在总 DNA 中 ,将由 10 个碱基所构成的引物之间的数百至数千个碱
基 ,通过 PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增 ,经电泳及染色后 ,得到可见的电泳谱带 ,用以
达到分析比较个体间差异的目的。通过引物序列的变化可以获得多样的 PCR扩增产物 ,由
此可以得出个体间丰富的多态〔11〕 。为分析中国东北落叶松植物亲缘关系 ,本研究在大兴安
岭 、小兴安岭 、张广才岭及长白山采取样品进行了 RAPD的分析研究。
1.材料与方法
1.1　供试材料
实验用的兴安落叶松材料 ,从大兴安岭的松岭林业局(以下称松岭)选取 3个体(S-1 , S
-2 ,S-3),小兴安岭的带岭林业局(以下称带岭)选取 3个体(D-1 ,D-2 , D-3)。从长白
山选取 5个体(C-1 ,C-2 ,C-3 ,C-4 ,C-5)。同时在长白山东北部张广才岭的东京城林
业局(以下称东京城)选取 5个体(T -1 , T -2 , T -3 ,T -4 ,T -5)(表 1),分别在每一个体的
树冠下部 ,采集落叶松的新鲜样品 。
　　表 1 供试材料及采集地
Table 1 Material and collect field
大兴安岭
Daxingan Mountain
小兴安岭
Xiaoxingan Moun tain
张广才岭
Zhangguangcai Mountain
长白山
Changbai Mountain
编号
Number
个体名
Samples
海拔(m)
Alt itude
编号
Number
个体名
S amples
海拔(m)
Altitude
编号
Number
个体名
Samples
海拔(m)
Alti tude
编号
Number
个体名
Samples
海拔(m)
Altitude
S-1 松岭 1 400 D-1 带岭 1 450 T -1 东京城 1-2 500 C-1 长白山 1 2000
S-2 松岭 2 400 D-2 带岭 2 450 T -2 东京城 2-1 500 C-2 长白山 3 1850
S-3 松岭 3 400 D-3 带岭 3 450 T -3 东京城 2-2 500 C-3 长白山 5 1150
T -4 东京城 2-4 500 C-4 长白山 6 1150
T -5 东京城 2-5 500 C-5 长白山 7 1150
1.2　总 DNA 的提取
采集的针叶样品在 DNA 提取之前一直保存在 4℃。DNA 的提取采用改良的 CTAB
法〔4 ,3〕 。取针叶 100—200mg ,加入冷藏的提取液(ext raction buf fer)2ml及 2-巯基乙醇(2-
mercaptoethanol)1μl ,磨碎 。将绿色液体吸出 1.5ml加入 Eppendorf , 6000rpm , 4℃离心 5分
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钟。在沉淀物中加 0.3ml的提取液 、 0.3ml 溶解缓冲液(nuclei ly sis buffer )及 0.12ml的
5%十二烷基钠(sarkosyl)充分混匀 ,待沉淀溶解后 ,置于 65℃的水浴锅中 ,温浴 15分钟。在
其中加入 0.6ml的氯仿/异戊醇(chloroform/ isoamyl alcohol)(24∶1)混合液混匀 , 15000rpm
室温离心 5分钟。回收上清液 ,再加入 0.6ml的异丙醇(isopropanol)室温静置数分钟后 ,
15000rpm 离心 10分钟。去掉上清液 ,再向其中加入 0.8ml 70%的乙醇(ethanol),沉淀溶解
后 ,15000rpm离心 10分钟 。去掉上清液沉淀干燥后加入 0.05ml的 TE buf fer将沉淀溶解 ,
置于-20℃中保存。
1.3　RAPD分析
对100个引物(Operon Technologies)进行筛选的结果 ,在 41个引物中检测到了多态 ,该
41个引物的碱基排列顺序见表 2。本实验的 25μl PCR反应体系中 ,包括 DNA 50ng , Tris-
HCl 10mM ,KCl 10mM ,dN TP (Pharmacia)0.2mM , MgCl2 4mM , Primer 10pmol , Taq 聚合
酶1单位。93℃2分钟变性处理后 ,进行 45 个循环的扩增 ,每个循环 93℃1分钟 、36℃1分
钟 、72℃2 分钟 ,最后进行 72℃5分钟的延伸反应 。将所得的 PCR产物电泳(0.5×TBE
buffer ,1.5%琼脂糖)。电泳的电压为 10V/cm ,电泳时间为 3小时 30分钟 ,电泳结束后在紫
外透射分析仪上进行分析照像 。
表 2 筛选出引物的碱基顺序(5′—3′)
Table 2 The sequence of Selected Primers
引　　物
Primer
碱基顺序
Sequence of primer
引　　物
Primer
碱基顺序
Sequence of primer
引　　物
Primer
碱基顺序
S equence of primer
A-04 AATGGGGCTG D-01 ACCGCGAAGG N-08 ACCTCAGCTC
A-08 GTGACGTAGG D-02 GGACCCAACC N-09 TGCCGGCTTG
A-09 GGGTAACGCC D-05 TGAGCGGACA N-11 TCGCCGCAAA
A-12 TCGGCGATAG D-06 ACCTGAACGG N-17 CATTGGGGAG
A-14 TCTGTGCTGG D-07 TTGGCACGGG N-18 GGTGAGGTCA
A-15 TTCCGAACCC D-08 GTGTGCCCCA X-06 ACGCCAGAGG
A-16 AGCCAGCGAA D-10 GGTCTACACC X-11 GGAGCCTCAG
A-19 CAAACGTCGG D-11 AGCGCCAT TG X-14 ACAGGTGCTG
B-01 GTT TCGCTCC D-16 AGGGCGTAAG X-15 CAGACAAGCC
B-02 TGATCCCTGG D-17 TTTCCCACGG X-17 GACACGGACC
B-03 CATCCCCCTG N-01 CTCACGTTGG X-18 GACTAGGTGG
B-04 GGACTGGAGT N-02 ACCAGGGGCA
B-06 TGCTCTGCCC N-05 ACTGAACGCC
B-11 GTAGACCCGT N-06 GAGACGCACA
B-16 T TTGCCCGGA N-07 CAGCCCAGAG
1.4　遗传距离的算出
根据 RAPD结果中电泳谱带的差异分析 ,计算出了遗传距离。
D=1-Ssm , 　　Ssm=(N xy1+N xy0)/Nt
D ———遗传距离
571 期　　　　　　　　　　石福臣等:中国东北落叶松属植物亲缘关系的研究
Ssm ———相似度指数
N xy1 ———个体 x 、y 共有的遗传位点数
N xy0 ———个体 x 、y 都不具有的遗传位点数
N t———遗传位点总数
用 UPGMA法〔7〕制成系统树 。遗传距离的计算和系统树的构建是采用日本九州大学农
学部白石进教授提供的程序完成的 。
2.结果与讨论
应用 41个引物进行分析 ,检出了 120个遗传位点呈现多态(表 3)。对 120个多态的遗
传位点中 ,大兴安岭 、小兴安岭 、长白山 、东京城各地的落叶松特有的遗传位点进行了分析。
图1是用 D-05引物检出的 240bps谱带 ,长白山的个体中全部具有 ,其它各地区的个体都
不具有。
表 3 RAPD分析中使用的引物及多态的遗传位点数
Table 3 Primers used in RAPD and the total number of Polymorphic loci
引物
Primer
位点数
Number of loci
引物
Primer
位点数
Number of loci
引物
Primer
位点数
Number of loci
引物
Primer
位点数
Number of loci
引物
Primer
位点数
Number of loci
A-04 3 B-01 3 D-01 5 N-01 3 X-06 2
A-08 3 B-02 3 D-02 1 N-02 4 X-11 4
A-09 3 B-03 4 D-05 2 N-05 1 X-14 4
A-12 4 B-04 2 D-06 2 N-06 2 X-15 2
A-14 3 B-06 3 D-07 2 N-07 1 X-17 3
A-15 2 B-11 2 D-08 2 N-08 5 X-18 2
A-16 3 B-16 3 D-10 2 n-09 2
A-19 D-11 1 N-11 3
D-16 6 N-17 2
D-17 5 N-18 5
计 41 120
根据多态的遗传位点上谱带的数据计算出的各供试个体间遗传距离见表 4 ,大兴安岭 、
小兴安岭 、长白山及东京城各地区间的平均遗传距离见表5 。大兴安岭的落叶松和小兴安岭
的落叶松之间的遗传距离为 0.233 ～ 0.452 ,平均为 0.341;大兴安岭的落叶松和长白山的落
叶松之间的遗传距离为 0.358 ～ 0.517 ,平均为 0.437;大兴安岭的落叶松和东京城的落叶松
之间的遗传距离为 0.308 ～ 0.425 ,平均为 0.363。
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图 1　RAPD 的分析结果
Fig.1　Analysis of RAPD Results
3 , 4 , 7:大兴安岭的落叶松
5 , 9 , 13:小兴安岭的落叶松
1 , 11 , 14 , 15 , 16:东京城的落叶松
2 , 6 , 8 , 10 , 12:长白山的落叶松
M :分子量标记; :长白山的落叶松的特异谱带
　　表 4 供试落叶松个体间的遗传距离
Table 4 Genetic distance between individual samples
S-1 S-2 S-3 D-1 D-2 D-3 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 T-1 T-2 T-3 T-4 T -5
S-1 0
S-2 0.225 0
S-3 0.308 0.333 0
D-1 0.333 0.392 0.425 0
D-2 0.300 0.325 0.325 0.300 0
D-3 0.233 0.342 0.392 0.283 0.317 0
C-1 0.417 0.475 0.408 0.483 0.433 0.517 0
C-2 0.425 0.467 0.500 0.408 0.392 0.492 0.375 0
C-3 0.358 0.383 0.417 0.408 0.358 0.408 0.358 0.367 0
C-4 0.400 0.458 0.442 0.467 0.450 0.417 0.333 0.408 0.342 0
C-5 0.425 0.517 0.467 0.508 0.475 0.508 0.342 0.300 0.350 0.358 0
T-1 0.383 0.408 0.358 0.350 0.317 0.400 0.417 0.408 0.275 0.433 0.492 0
T-2 0.350 0.342 0.425 0.400 0.400 0.400 0.358 0.275 0.333 0.442 0.333 0
T-3 0.308 0.317 0.367 0.358 0.342 0.375 0.408 0.333 0.300 0.408 0.383 0.325 0.242 0
T-4 0.350 0.325 0.425 0.417 0.333 0.367 0.467 0.375 0.225 0.317 0.442 0.317 0.250 0.308 0
T-5 0.375 0.333 0.383 0.408 0.375 0.392 0.358 0.417 0.333 0.358 0.433 0.325 0.275 0.317 0.275 0
591 期　　　　　　　　　　石福臣等:中国东北落叶松属植物亲缘关系的研究
表 5 各地域落叶松间的平均遗传距离
Table 5 Average genetic distance between larches in Different Place
大兴安岭的落叶松
Larches in
Daxingan Mountain
小兴安岭的落叶松
Larches in
Xiaoxingan Mountain
长白山的落叶松
Larches in
Changbai Mountain
东京城的落叶松
Larches in
Dongjingcheng
大兴安岭的落叶松 0
小兴安岭的落叶松 0.341 0
长白山的落叶松 0.437 0.448 0
东京城的落叶松 0.363 0.376 0.372 0
小兴安岭的落叶松和长白山的落叶松之间的遗传距离为 0.358 ～ 0.508 ,平均为 0.448;
小兴安岭的落叶松和东京城的落叶松之间的遗传距离为 0.317 ～ 0.417 ,平均为 0.376。东
京城的落叶松和长白山的落叶松之间的遗传距离为 0.275 ～ 0.467 ,平均为 0.372。比较各
地区间的遗传距离可以看出 ,代表兴安落叶松的大兴安岭 、小兴安岭两地域间落叶松的平均
遗传距离最小为 0.341;大兴安岭 、小兴安岭的落叶松与长白落叶松间的遗传距离较大分别
为 0.437和 0.448 ,平均为 0.443。东京城的落叶松与大兴安岭 、小兴安岭的落叶松间的遗
传距离以及与长白山的落叶松之间的遗传距离都小于长白山的落叶松与大兴安岭 、小兴安
岭的落叶松之间的平均遗传距离。
对各供试个体间的遗传距离采用 UPGMA 法进行了聚类分析(图 2)。结果表明 ,各供
试个体大致区分出了大 、小兴安岭 ,长白山 ,东京城三个类群 。大兴安岭 、小兴安岭的落叶松
单独形成一个类群。长白山的落叶松形成了一个类群但有一个个体(C-3),包含在东京城
的落叶松的类群中。从该聚类图中可以看出长白山的落叶松和东京城的落叶松与大 、小兴
安岭的落叶松有一定的差异 ,但由于遗传距离较近(0.443),还没有达到象日本落叶松和长
白落叶松等独立种之间那样大的遗传距离〔12〕 ,未能表现出物种级水平的差异。
分布在中国大 、小兴安岭的落叶松一直被认定为兴安落叶松(Laix gmelinii),而分布在
长白山的落叶松应作为种还是变种处理说法不一。1915年 Henry 将长白山东部俄罗斯境
内奥尔加地区的落叶松定名为 Larix olgensis ,以后中井(1938),竹内(1958)等多数学者将
长白山的落叶松也定名为 L .olgensis 。另外 ,在分类特征上长白落叶松球果种鳞数为 20 ～
35枚 ,种鳞的背面有腺毛 ,而兴安落叶松种鳞数为16 ～ 20枚 ,种鳞的背面无毛 。实际调查中
发现地域的不同常有中间特征类型出现 ,因此尚未确定能完全区别于以上 2种的形态特征 ,
有必要对此 2种间的分类关系进一步探讨 。由于长白落叶松的形态特征不稳定 , Ostenfeld
和 Larsen(1930)将其定为兴安落叶松的变种 L .gmel inii var.olgensis 。这种分类方法得
到了多数欧美学者的承认 ,并将分布在朝鲜半岛北部的朝鲜落叶松和长白落叶松也做为兴
安落叶松的变种处理〔2 ,9〕 。比较两种的开叶期 ,大兴安岭的落叶松开叶期在 4月 21日 ,长白
山的落叶松开叶期在 4月 26日 ,较前者为晚 ,表现出两树种在生态特性的差异〔1〕 。
东京城的落叶松处于长白山脉的东北部 ,位于兴安落叶松和长白落叶松分布的交错地
带 ,其形态特征经常可以看到以上两种落叶松的中间类型 。有人将该地区的落叶松做为长
白落叶松的变种 L .olgensis var.heilingensis (周以良等 1986),北川正夫(1979)则认为是
兴安落叶松的变种 L .dahurica var.hei lingensis ,表现出该地区落叶松特征的不稳定性 。
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图 2　各地域落叶松个体间的遗传距离的聚类分析
Fig.2　Cluster analysis on genetic distance among individual in different areas for larches
根据第三纪落叶松属化石资料表明 ,落叶松属起源于欧洲中北部 ,第四纪扩展到欧洲东
部 、西伯利亚 ,并向我国大 、小兴安岭及长白山延伸〔10〕 ,我国东北的落叶松属植物缺乏地理
隔离及生殖隔离条件 ,几近连续分布。根据 DNA的 RAPD分析 ,各地域落叶松间的遗传距
离在 0.225 ～ 0.500之间 ,表现出中国东北部落叶松属内的遗传分化尚不特别显著 ,分布在
长白山的落叶松做为独立种缺乏形态和遗传学依据 ,由此作者认为长白落叶松做为兴安落
叶松的变种(L .gmel inii var.olgensis)处理较为妥当 。
东京城的落叶松和兴安落叶松之间的平均遗传距离为 0.370和长白山的落叶松之间平
均遗传距离为 0.372 ,这两个值均小于兴安落叶松和长白落叶松之间的平均遗传距离0.443 ,
表明东京城的落叶松处于兴安岭叶松和长白落叶松遗传分化的中间类型 ,由此推测该地区
的落叶松可能是以上两落叶松之间的杂交种 ,详细工作有待进一步深入研究。
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