全 文 ：第 24卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　1月
Vol.24　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2004
5S rDNA间隔序列分析和 RAPD技术用于鉴定体细胞杂种
赵同金 向凤宁 聂　卉 夏光敏 陈惠民
(山东大学生命科学学院 , 济南　250100)
摘　要　主要对狭叶柴胡 (Bupleurum scoronerifolium)与川西獐芽菜 (Swerita musstii Franch)的
科间体细胞杂种愈伤组织 、小麦 (Triticum aestivum)与燕麦 (Avena sativa)的族间体细胞杂种愈
伤组织及再生植株进行 5S rDNA间隔序列及 RAPD分析鉴定 , 确证了它们为体细胞杂种。
关键词　5S rDNA;间隔序列分析;RAPD;体细胞杂种
Identification of somatic hybrids by the methods of
5S rDNA spacer sequence and RAPD analysis
ZHAO Tong-Jin　XIANG Feng-Ning　NIE Hui　XIA Guang-Min　CHEN Hui-min
(Life school of Shandong University , Jinan　250100)
Abstract　The present paper described the 5S rDNA spacer sequence and RAPD analysis in the identifica-
tion of hybrid nature of the calli line from interfamilial somatic hybridization between Bupleurum scoronerifoli-
um and Swerita musstii Franch , the calli line from intertribal somatic hybridization between Avena sativa and
Triticum aestivum L.and its regenerated plants.We confirmed that they were somatic hybrids.
Key words　5S rDNA spacer sequence;RAPD;somatic hybrid
　　近年来 , 植物体细胞杂交取得了长足的发展 ,
出现了大量的种间 、 属间 、 族间体细胞杂种 , 甚
至出现了远缘科间体细胞杂种[ 1] 。植物体细胞杂
交 , 尤其是不对称体细胞杂交 , 可以只将供体细
胞的部分基因组引入到受体细胞中 , 从而避免向
受体引入过多的不良性状 。
近年来 , 随着分子生物学技术的发展 , 新的
方法如 5S rDNA 序列差异分析 、 RAPD 、 RFLP 及
PCR-RFLP均有报道用于体细胞杂种的鉴定[ 2 ～ 8] 。
狭叶柴胡 (Bupleurum scoronerifolium)属于伞
形科 (Umbelliferae), 具退热解毒 、 舒肝解郁等作
用。川西獐芽菜 (Swerita musstii Franch)系龙胆
科 (Gentianaceae), 青藏高原特有种 , 亦称 “藏茵
陈” , 分布于西藏 、 青海海拔 3 800 ～ 5 000 m的高
寒地区 , 专治黄疸型肝炎及病毒性肝炎。狭叶柴
胡与川西獐芽菜的不对称体细胞杂交 , 获得了科
间体细胞杂种细胞系及杂种植株 。
燕麦 (Avena sativa)属燕麦族 , 耐旱 、 耐寒 ,
在粮食作物中蛋白质和脂肪酸的含量均具首位 ,
尤其是赖氨酸和不饱和脂肪酸的含量很高 , 同时 ,
亦可抗多种疾病 , 具有保健食品的益称。燕麦与
小麦的亲缘关系较远 , 有性杂交十分困难 , 至今
尚未见其有关报道。1999年 , 本实验室开展了小
麦与燕麦不对称体细胞杂交 , 已获杂种再生植
通讯作者:向凤宁 (1965—), 女 , 山东大学生命科学学院 , 副教授 , E-mail:xfn0990@sdu.edu.cn
　山东省自然科学基金重点项目 , Z2001D01
　第一作者简介:赵同金 (1979-), 男 , 清华大学生命科学学院博士生, 主要从事分子生物学研究。
　收稿日期:2003-02-21
株[ 9] 。
虽然 5S rDNA间隔序列分析和 RAPD技术均
可用于鉴定体细胞杂种 , 但二者各具优缺点 , 5S
rDNA间隔序列分析重复性高 , 但表现的多态性较
少;RAPD技术则表现高度的多态性 , 但重复性
相对较差。两种方法结合起来可以对体细胞杂种
中异源基因的存在进行相互验证 。本文采用 5S
rDNA间隔序列分析及 RAPD技术对柴胡与川西獐
芽菜及小麦与燕麦体细胞杂种细胞系及再生植株
进行体细胞杂种性质的鉴定。
1　材料与方法
1.1　材料
　　本实验选用的体细胞杂种材料为:(1)川西
獐芽菜的原生质体经紫外线照射 (1 min 、 2 min)
后与狭叶柴胡的原生质体在 PEG 诱导下融合再生
的愈伤组织;(2)小麦 (济南 177)继代 3天的悬
浮细胞系(T1)和继代7天的愈伤组织(T2)分离
制备原生质体作为受体 , 与经紫外线照射 1 min 、
2 min 的燕麦的原生质体经 PEG 诱导融合再生的
愈伤组织及再生植株[ 9] 。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取
用 CTAB法[ 10]提取狭叶柴胡与川西獐芽菜 、
普通小麦与燕麦体细胞杂种愈伤组织和叶片总
DNA , 用于 PCR分析 。
1.2.2　5S rDNA间隔序列分析
对杂种愈伤组织 、再生植株及双亲 DNA 进行
PCR扩增。PCR扩增体系为 20μL , 反应体系包含
1×Taq Buffer , 两种引物各 250 ng , 250μmol/L的
dNTP。反应程序为 94℃预变性 2 min , 然后 94℃
30 s , 60℃ 2 min , 72℃ 2 min 35 个循环 , 最后
72℃延伸 7 min。引物根据已发表的 5S rDNA 间隔
序列设计 , 序列为:PI:5′-GGATGGGTGACCTC-
CCGGGAAGTCC-3′; PII: 5′-CGCTTAACTGCG-
GAGTTCTGATGGG-3′。PCR产物经 3%的琼脂糖凝
胶电泳分离 , 用 EB染色并照相。
1.2.3 RAPD分析
选用 32个随机引物对杂种愈伤组织 、再生植
株及双亲 DNA进行 PCR扩增 。PCR扩增体系为20
μL , 反应体系包含 1 ×Taq Buffer , 引物 50 ng ,
250 μmol/L 的 dNTP。反应程序为 94℃预变性 2
min , 然后94℃10 s , 36℃30 s , 72℃50 s 44个循
环 , 最后 72℃延伸 7 min。PCR产物经 1.5%的
琼脂糖凝胶电泳分离 , 用 EB染色并照相 。
2　结果
2.1　川西獐芽菜 (+)狭叶柴胡杂种愈伤组织
的鉴定
用 5S rDNA间隔序列引物 (25mer)对川西獐
芽菜 、狭叶柴胡及二者原生质体融合再生愈伤组
织的 PCR分析如图 1 (a)。克隆6 , 10 , 11 , 14含
有双亲的特征带 , 证明是川西獐芽菜和狭叶柴胡
的科间体细胞杂种 。克隆 4仅含有狭叶柴胡的特
征带 。
RAPD分析 (图 1 (b)、 (c)、 (d))表明 , 克
隆3 , 4 , 6 , 10 , 11和 14具有双亲特征谱带 , 克
隆 6 , 10出现了新带 , 证明其为川西獐芽菜和狭
叶柴胡的族间体细胞杂种 。我们注意到尽管 5S
rDNA分析显示克隆 4仅含有狭叶柴胡的特征带 ,
但 RAPD分析表明其含有双亲的特征带 , 故克隆4
是川西獐芽菜和狭叶柴胡的科间体细胞杂种 , 这
一结果与形态学 、 同工酶 、 染色体分析结果一致 。
RAPD分析中共用了 32个随机引物 , 其中 8个产
生 RAPD标记 (表 1)。
表 1　川西獐芽菜 (+)狭叶柴胡杂种愈伤组织的鉴定中产生 RAPD标记的随机引物及引物序列
Table 1　Primers resulted in RAPD markers in the analysis of calli from Bupleurum scoronerifolium (+)Swerita musstii Franch
Primer 5′-3′sequence Polimorphism Primer 5′-3′sequence Polimorphism
F5 CCGAATTCCC 10 H5 AGTCGTCCCC 12
A8 GTGACGTAGG 7 C13 AAGCCTCGTC 10
A1 CAGGCCCTTC 6 H20 GGGAGACATC 12
A17 GACCGCTTGT 12 A19 CAAACGTCGG 9
1211期　　　　　　　　　赵同金等:5S rDNA间隔序列分析和 RAPD技术用于鉴定体细胞杂种
图 1　川西獐芽菜 (+)狭叶柴胡杂种愈伤组织的 5S rDNA 间隔序列分析
(a)和用随机引物 C13 (b)、 A19 (c)和 H20 (d)进行的 RAPD分析
子量标准 , 图 (a)为 DL 2000 , 图 (b)为λDNA/Hind III+EcoR I , 图 (c)、 图 (d)为 2-log Marker;S:川西獐芽菜;B:狭叶柴胡;
3, 4 , 6, 10 , 11 , 14为川西獐芽菜 (+)狭叶柴胡再生愈伤组织克隆;→:狭叶柴胡的特征带;※:川西獐芽菜的特征带; :新带
Fig.1　 5S rDNA spacer sequence analy sis (a)and RAPD analysis with random primers C13 (b)、
A19 (c) and H20 (d) of the regenerated clones from Bupleurum scoronerifolium (+) Swerita musstuii Franch
M:Molecular weight marker , Figure(a):DL 2000 ;Figure (b):λDNA/Hind III+EcoR I ;Figure(c)and (d):2-log
Marker;B:Bupleurum scoronerifolium ;S:Sw erita musstuii Franch ;No.3 , 4 , 6 , 10 , 11 , 14:regenerated clones from
Bupleurum scoronerifolium (+) Swerita musstuii Franch→:bands from Bupleurum scoronerifolium;※:the bands from Swerita
musstuii Franch; :new bands
表 2　小麦 (+)燕麦杂种愈伤组织的分析中产生 RAPD标记的引物及序列
Table 2　Primers resulted in RAPD markers in the analysis of the regenerated calli from Triticum aestivum L.
(T1 , T2)and Avena sativa
Primer 5′-3′Sequence Polymorphism Primer 5′-3′Sequence Polymorphism
C8 TGGACCGGTG 8 H5 AGTCGTCCCC 11
H12 ACGCGCATGT 7 H19 CTGACCAGCC 8
H20 GGGAGACATC 9 A4 AATCGGGCTG 12
A8 GTGACGTAGG 9 A11 CAATCGCCGT 6
2.2　小麦 (+)燕麦杂种愈伤组织的鉴定
　　对小麦 (T1 、 T2)(+)燕麦的杂种愈伤组织
进行 5S rDNA间隔序列分析 (图 2 (a)), 表明克
隆1 , 3 , 5和 12均含有双亲的特征带 , 证明是小
麦与燕麦的族间体细胞杂种。
RAPD分析选用 32个随机引物 , 其中 8 个产
生多态性标记 (表 2)。图 2 (b)、 (c)、 (d)表
明 , 1 , 3 , 5 和 12 亦存在双亲特征谱带及新带 ,
为小麦与燕麦的族间体细胞杂种 , 并有重组发生 。
122 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
图 2　小麦 (T1 、 T2)(+)燕麦杂种愈伤组织的 5S rDNA间隔序列分析
(a)和用随机引物 A4 (b)、 H20 (C)和 H5 (d)进行的 RAPD分析
M:分子量标准 , 图 (a)和 (c)为λDNA/Hind III+EcoR I;(b)和 (d)为:DL2000;T1:普通小麦 (济南 177)继代 3天的悬
浮细胞系;T2:普通小麦 (济南 177)继代 7天的愈伤组织;A:燕麦;No.1 , 3 , 5 , 12:小麦 (T1 、 T2)(+)燕麦再生愈伤
组织;→:小麦的特征带;※:燕麦的特征带; :新带
Fig.2　5 S rDNA spacer sequence analysis (a)and RAPD analysis with random primers
A4 (b)、 H20 (c) and H5 (d)of the regenerated clones from Triticum aestivum L(T1 , T2)(+)Avena sativa
M:Molecular weight marker , Figure(a)and(c):λDNA/Hind III+EcoR I ;Figure(b)and(d):DL 2000 ;T1:suspension calli subcultutred
for three days from Triticum aestivum L.(Jinan 177);T2:calli subcultured for seven days f rom Triticum aestivum L.(Jinan 177);A:Avena
sativa;No.1 , 3 , 5 , 12:regenerated clones from Triticum aestivum L.(T1, T2)(+)Avena sativa;→:the bands from Triticum aestivum
L.;※:the bands f rom Avena sativa; :new bands
3　小麦 (+)燕麦杂种再生植株的鉴定
　　对小麦 (+)燕麦的 、 杂种再生植株的 5S
rDNA间隔序列分析表明 (图 3 (a)), 植株 1 , 2 ,
3和 4均含有双亲的特征带 , 证明是小麦与燕麦
的族间体细胞杂种植株。
RAPD 分析选用 32 个随机引物 , 结果表明
(图 3 (b)), 植株 1 , 3和 4均产生了小麦和燕麦
的特征带 , 并且都产生了新带 , 这表明这些植株
为小麦与燕麦体细胞杂种植株 , 与 5S rDNA间隔
序列分析结果一致 , 并且杂种植株中有双亲遗传
物质的重组。
4　讨论
本文结果表明 , 两种方法在体细胞杂种检测
方面都有优点 , 它们简单 、 快速经济 、 与其它方
法相比需要 DNA 量少 。5S rDNA (即 5S rRNA 基
因)属简单多基因家族 , 在至今研究的所有真核
生物中以串联重复单位组成 , 与卫星 DNA类似 ,
120 bp的编码区之间是随不同生物而长度不同的
非编码区 , 基因本身表现出很高程度的保守性 ,
非转录间隔区由于本身并未处于与基因本身同样
的选择压力下 , 因而变异较大 。高等植物的间隔
序列长度在90 ～ 400 bp之间 , 同一属的不同种植
物之间以及同一种植物之间间隔序列的碱基序列
长度不同[ 2 〗。以保守的 5S rDNA编码区设计 PCR
引物 , 用来选择性地扩增变异较大的转录间隔区 ,
以区别融合双方的核基因 , 据此可进行体细胞杂
种的鉴定 。我们实验中从 5S rDNA 间隔序列
分析得到的结果进一步证明了这种方法的可行
1231期　　　　　　　　　赵同金等:5S rDNA间隔序列分析和 RAPD技术用于鉴定体细胞杂种
图 3:小麦 (+)燕麦再生植株的 5S rDNA 间隔序列分析 (a)和用随机引物H19进行的 RAPD分析 (b)
M:分子量标准 , 图 (a)为DL 2000 , 图(b)为λDNA/Hind III+EcoR I;T:普通小麦济南 177;A:燕麦;→:小麦的特征带;
※:燕麦的特征带; :新带
Fig.3　5S rDNA spacer sequence analysis (a)and RAPD analy sis with random primers H19 (b)of
the regenerated plants from Triticum aestivum L(T1 , T2)(+)Avena sativa
M:Molecular weight marker , Figure(a):DL 2000 ;Figure(b):λDNA/Hind III+EcoR I ;T:Triticum aestivum L.(Jinan 177);A:Ave-
na sativa;→:bands from Tri ticum aestivum L;※:the bands from Avena sativa; :new bands
性。5S rDNA 间隔序列分析重复性好 , 我们实验
中的扩增至少重复两次 , 扩增带稳定。RAPD可
以不受位点限制对基因组 DNA进行扩增 , 并且表
现出高度的多态性。因此可以用来进行体细胞杂
种的检测 , 特别是用于远缘或不对称体细胞杂交
得到的杂种 。此法能够较为准确的检测出融合双
方遗传物质的重组。
本实验结合两种方法 , 可以将二者的优缺点
互补 , 5S rDNA间隔序列分析多态性低可用 RAPD
弥补 , 而其重复性高又可以弥补 RAPD重复性较
差的特点 , 两者结合可以较为准确的检测体细胞
杂种 , 两者在检测狭叶柴胡 (+)川西獐芽菜再
生克隆 4的结合使用证明了这一点。两者结合起
来 , 我们可以更好的检测体细胞杂种。如果它们
能够同RFLP , PCR-RFLP结合使用 , 可以对体细
胞杂种中的外源基因做出更为准确的定位。
参　考　文　献
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