全 文 ：第 25卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　10月
Vo .l 25　No. 4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH Oc.t , 　2005
基金项目:天津市重点项目(023804111)和天津市教委项目资助
第一作者简介:王振英(1966— ),女 ,遗传学博士,天津师范大学生物系教授 ,从事分子遗传学研究及教学工作。
*　通讯作者 Au th or for correspondence　E-m ail:pykcell@ eyou. com　Tel:022 - 23540057
收稿日期:2004 - 12 - 20
黑麦中与耐盐性相关的 cDNA片段的克隆与序列分析
王振英1　彭永康1*　郑坚瑜 2
(1.天津师范大学生物系 , 天津　300074)
(2.南开大学分子生物学研究所 , 天津　300071)
摘　要　S I800(Salt Induced 800 bp , S I800)为我们用 mRNA差别显示技术在盐胁迫的黑麦幼苗叶
片中分离到的一个盐胁迫应答 cDNA片段。利用低熔点琼脂糖凝胶电泳方法纯化了该片段 ,并将
其连接到 pGEM— T easy vector上转化大肠杆菌 JM 109 ,获得 30个阳性克隆子 ,经过酶切和 PCR
双重鉴定后 ,选取 2个阳性克隆子进行了测序 ,结果表明 , SI800长 735 bp , GenB ank B last结果显示 ,
该片段与细菌中的阿卓糖酸氧化还原酶基因的部分区段有较高的同源性。
关键词　黑麦;耐盐性;cDNA片段的克隆;测序
Cloning and sequencing analysis on the cDNA fragm ent SI800
separated from rye which related w ith salt tolerance
WANG Zhen-Ying1　PENG Yong-K ang1*　ZHENG Jian-Yu2
(1. Department o f B io logy, T ianjin Norm a lUniversity, T ian jin　300074)
(2. Department o f L ife Science, Nan Kai University, T ian jin　300071)
Abstract　SI800(Salt Induced 800 bp, S I800)was a cDNA fragment, which separated from rye leaves by
DDRT— PCR. In this study, we purified S I800 by low tempe ra ture agarose electropho resis and linked to
pGEM— T vector then transformed to Escherichia coli JM 109. 30 positive clonesw ere ob tained. 2 posi-
tive clones we re se lec ted random ly a fte r test by digestion, PCR and sequenced. The result indicated that
S I800 was composed o f 735 bp. DNA sequence analysis showed 68% homo logue to uxaB gene fo r altr-
onate oxido reduc tase in G enBank.
Key words　rye;sa lt to le rance;c loning o f cDNA fragmen t;sequencing
利用 mRNA差别显示技术研究盐胁迫下作物
体内相关基因的克隆及表达特性已有很多工作报
道 ,如 M oon等克隆了一个编码与耐盐性相关 ABA
应答 40 KD蛋白 cDNA O sr 40 C1,并发现在 ABA
和盐胁迫下 O sr 40 C1基因 mRNA的水平明显提
高 [ 1] ,李子银等从 31个水稻盐胁迫差异 cDNA片
段中克隆了 3个阳性片段 ,其中一个盐诱导片段
(600 bp)经克隆后序列分析表明与水稻 3-腺苷蛋
氨酸脱羧酶 (SAMOC)基因 3′端核苷酸序列有
96%的同源性[ 2] , SAMOC基因在水稻中有重要作
用。张驰等 [ 3]也同样利用 mRNA差别显示方法从
耐盐突变体水稻中克隆出 13个盐诱导蛋白的 cD-
NA片段 , 其中 cDNA SIGR 13与 ABA 诱导的
Rab 16有很高的同源性。马德钦等 [ 4, 5] 以盐胁迫
诱导的菠菜 mRNA为模板 ,利用 RT— PCR方法克
隆了 BADH基因。然而 ,上述研究虽然对作物耐
盐分子机理的理解上有很重要意义 ,但基本上属于
重复和跟踪性的[ 6, 7] ,前文[ 8]已报道了我们用 mR-
NA差别显示方法 ,从盐胁迫的黑麦幼苗中筛选到
了 14个差异 cDNA片段 ,我们对这 14个差异片段
逐一进行了 Northern、 Sou thern B lo tting及表达特性
分析 , 证实 3个 cDNA片段与黑麦耐盐性高度相
关 ,其中对用引物 S 271筛选到的特异片段 SI800
(Sa lt Induced 800 bp, S I800)进行了克隆与序列分
析 ,发现其与细菌中的阿卓糖酸氧化还原酶基因有
较高的同源性。本文报道了这一研究结果 ,期望能
为作物耐盐分子机理研究提供新证据 。
1　材料与方法
1. 1　黑麦总体 RNA的提取
黑麦种子用 10%安替福民消毒后 , 25℃培养
3 d, 然后将黑麦幼苗分成两组 , 一组以去离子水
培养 , 作为对照 , 另一组用 250mmo l L -1 NaC l
胁迫5 d, 分别收获两组幼苗叶片备用 。取 0. 2 g黑
麦叶片 , 在液氮中迅速研磨成粉末 , 加入提取缓
冲液 (4 mol L - 1的硫氰酸胍;NaAC , pH 4. 2),
用酸性苯酚和氯仿抽提后 , 异丙醇沉淀总体 RNA ,
70%的乙醇洗沉淀 3次 , 去掉盐分 , 用适量的
DEPC处理过的 ddH2O溶解 RNA , 总体 RNA的产
量和 纯度通过紫外分光光度法 进行测定 ,
OD 260 /OD280的比值大于或等于 2. 0的 RNA样品 ,
再经1. 0%变性的琼脂糖凝胶电泳 , 确定 28S RNA
和 18S RNA的亮度比为 2:1左右 , 证明 RNA样品
的完整性较好 , 可以用于 cDNA的合成 。
1. 2　S I800的回收和再扩增
在低熔点胶切下的差异 cDNA带 , 放在一干
净的事先称重的离心管中 , 称重 , 以 3mL g -1胶
重的比例加入 TE(pH 8. 0), 65℃水浴使胶熔化 ,
加入等体积的酚仿抽提 , 取上清冷乙醇沉淀后 ,
12 000 r m in-1离心 , 70%乙醇洗沉淀 2 次 ,
10 μL水溶解沉淀 , 取 5μL进行二次扩增 , 反应条
件:94℃变性 4m in;94℃变性 15 s, 40℃复性
30 s, 72℃延伸 30 s;35个循环 , 72℃补齐 7 m in。
所得产物经琼脂糖凝胶电泳确认 , 再次用低熔点
胶纯化后 , 可直接用于克隆和探针的标记。
1. 3　S I800的克隆
1. 3. 1　PCR产物加 “A”尾 (A-tailed)
总体系为10 μL,按下列顺序在冰上加入各种
成分以便在 DNA片段 3′端加 “A”:纯化的 PCR产
物 2 μL, Taq 酶 10 × buffer 1 μL, MgC l2
(25 mmo l L -1 ) 1 μL, dNTP ( 10mmol L - 1 )
0. 2μL, Taq酶 (5U /μL) 1 μL,W ate r 4. 8 μL。混
匀 , 瞬间离心 , 收集到管底 , 70℃保温 30 m in,取
2μL进行连接反应 。
1. 3. 2　连接反应
连接反应总体系 10 μL,其中:2×buffer 5 μL,
pGEM— T Easy V ector(50 ng /μL) 1μL, A-ta iled
产物 2 μL, T4 DNA 连接酶 (3 U /μL) 1μL, 水
1μL。通过吹吸混匀 , 室温连接 1 h, 为了得到更
高的转化效率 , 可以在 4℃连接过夜 。
1. 3. 3　连接产物转化大肠杆菌 JM 109
在冰上取 2 μL连接产物加到 100 μL JM 109
感受态细胞液中 , 轻弹混匀 ,冰上放置 20 m in,在
42℃热休克 45 ～ 50 s,立即置冰上 2 m in,室温下加
入950 μL SOC培养基 。 37℃缓慢摇动培养 2 h,离
心收集菌体 , 以 100μL菌液涂布含 IPTG、X-gal、
Amp的 SOB平板。静置 30 m in, 使培养基充分吸
收菌液 , 37℃倒置培养过夜 (16 ～ 24 h)
1. 3. 4　重组克隆的 PCR筛选
随机挑取白色重组菌落于少量 LB液体培养
基中培养过夜 ,取少量菌液加入 1. 5 mL离心管中 ,
沸水浴 5m in, 8 000 r m in-1离心 3 m in ,取 2μL上
清作为模板 , 12. 5 μL体系进行 PCR扩增 ,电泳检
测插入片段的大小。 PCR所用引物为 pGEM— T
Vector多克隆位点两侧的序列:
primer1:5 ′TGGCGGCCGCGGGAATTCGA 3′
primer2:5′GCAGGCGGCCGCGAATTCAC 3′
PCR参数:94℃ 15 s, 55℃ 30 s, 72℃30s, 30
cycles后 , 72℃补齐 7m in。
1. 3. 5　质粒酶切鉴定重组子
用灭菌牙签挑选白色菌落 ,分别点涂于另一含
Amp的 LB平板上 ,将挑菌牙签放入 5 mL含 Amp
的 LB液体培养基中 , 37℃ 130 r m in- 1 , 过夜培
养;取过夜培养的菌落 1. 5mL, 4 000 r m in- 1离
心5 m in,收集菌体 ,弃上清。用碱裂解法提取质粒
DNA。酶切体系为 10 μL,其中质粒 DNA 5 μL, 10
×buffer 1 μL, 20 U /μL EcoRI 1 μL, H2O 3 μL。
37℃ 3 h,电泳鉴定酶切结果。
1. 4　基因组的 Southe rn杂交
将30 μg黑麦总体总体 DNA分别经 EcoRI、
Hind III酶切 ,进行琼脂糖凝胶电泳 ,紫外灯下观察
酶切是否完全 ,确保酶切完全后 ,在 0. 5mo l L -1
NaOH溶液中进行 DNA变性 ,转膜。将 DNA转移
到尼龙膜上 , 80℃烘干 2 h以固定 DNA。随机引物
法制备32 P标记的 cDNA探针 , 42℃预杂交 4 h后 ,
加入 cDNA探针 , 杂交过夜 (12 h以上)。2×SSC ,
428 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
图 1　黑麦叶片总体 RNA
Fig. 1　Tota l RNA o f lea f in rye
0. 1% SDS少量洗膜 15m in。2×SSC , 0. 1% SDS;
1×SSC , 0. 1% SDS;0. 1×SSC , 0. 1% SDS;0. 1
×SSC洗膜各 1次 , 每次15 m in。所得的膜用保鲜
膜包好 , 压上 X光片 , - 20℃曝光 10 d。
1. 5　测序及同源性分析:由上海生工测序 , Gen-
Bank B last进行同源性比较分析 。
2　结果与分析
2. 1　黑麦总体 RNA的分离
能否分离出高质量的总 RNA直接影响到合成
cDNA 的 质 量 , 我 们以 黑 麦 3 d龄 幼 苗 , 用
250mmo l L -1 N aC l胁迫 3 d后 ,分离出叶片的总
RNA ,图 1为总体 RNA的变性胶电泳结果 ,从图 1
中可以明显看到 28S和 18S两条 RNA谱带 ,比值
约为 2:1,证明 RNA的完整性比较好 ,其质量符合
RNA的反转录实验要求。
图 2　SI800的二次 PCR扩增和 Sou thern Blo tting分析
a. 二次 PCR扩增;b. 基因组的 S ou thern B lot ting
F ig. 2　Second PCR amp lification of the specific cDNA SI800
and genom ic Southern B lo tting
a. Second PCR amp lification;b. Genom ic Sou th ern B lotting
2. 2　盐胁迫应答 cDNA片段 (SI800)的 PCR扩增
和 Southern B lo tting分析
前文已经报道 [ 8] , SI800特异片段是用 DDRT—
PCR方法 ,在经 250 mmo l L -1 N aC l胁迫 3 d的黑
麦幼苗叶片中分离到的 ,抗盐连锁性分析表明 ,
SI800是一个盐胁迫早期应答 cDNA片段。为了排
除假阳性和分析 S I800在黑麦基因组中的结构特点 ,
我们对 SI800进行了二次 PCR扩增 、Northern B lotting
和基因组 Southe rn b lo tting分析 , 图 2a是我们对
SI800的二次 PCR扩增结果 ,凝胶上 1条分子量约
为800 bp的清晰的谱带被检测到 。图 2b是黑麦基
因组 DNA经 EcoR I、Hind III限制性酶切后 , 1. 0%琼
图 3　阳性克隆子的筛选　 a. 目的片段的酶切鉴定;b. PCR鉴定
F ig. 3　Se lec t of the po sitive c loning s
a. Test of S I800 d igested by E coR I;b. Test ofS I800 by PCR;M 1:DL2000 DNA m ark er;M 2:λDNA E coRI /H ind IIIM arker
4294期 王振英等:黑麦中与耐盐性相关的 cDNA片段的克隆与序列分析
图 4　黑麦盐胁迫应答基因片段 SI800的核苷酸序列
Fig. 4　Sequence of sa lt induced gene (fragement)SI800 in Rye
脂糖凝胶电泳 、转移尼龙膜后 ,以32 P标记的 S I800为
探针的 Southe rn B lo tting结果 ,分别有 6条和 3条
杂交谱带被检测到 ,证明 SI800在黑麦基因组中是多
拷贝的 。
2. 3　S I800的克隆与序列分析
用 mRNA差别显示技术克隆作物早期应答基
因在作物耐盐分子机理研究已取得很大成绩 ,如张
弛等[ 3]克隆了盐胁迫诱导 cDNA片段 、Nelson[ 9]克
隆了 OSM 的 cDNA片段 、Liang等[ 10]从菠菜和甜
菜中克隆了 BADH的 cDNA片段等 ,证明 mRNA
差别显示技术在作物耐盐基因克隆研究中已成为
一种十分有用的工作 ,本研究中我们利用这种方法
成功克隆出 SI800 cDNA片段 ,图 3a, b分别为酶切
法和 PCR方法鉴定阳性克隆的结果 ,两种方法共
获得阳性克隆 30个 , 随机挑选 2个阳性克隆子 ,
经液体培养 ,再经酶切和 PCR两种方法鉴定 ,凝胶
上均能显示出 1条分子量为 800 bp的目的片段 ,经
过双向测序 ,得到了两个完全相同的碱基序列 (图
4)。 SI800全长为 735 bp, GenBank B last结果显示 ,
S I800与阿卓糖酸氧化还原酶有 68%的同源性。推
测 S I800系阿卓糖酸氧化还原酶基因的一个片段。
阿卓糖酸氧化还原酶基因最早在 E scherich ia coli中
发现 ,其编码的阿卓糖酸氧化还原酶参与阿卓糖酸
的合成 ,但在高等植物中目前还没有报道 , 其在高
等植物中主要的生物学功能目前还不清楚 。
3　讨论
由于对作物耐盐机理研究具有很大的应用价
值 ,因此从生理 (渗透剂)、生化 (盐诱导蛋白)及分
子生物学(耐盐基因 )等三个方面的研究已经积累
了大量资料 ,而对盐诱导蛋白与渗透调节剂的研究
尤为深入 [ 11, 12] 。脯氨酸 、脱落酸作为一种渗透剂 ,
参与调控作物中耐盐基因的表达 ,因而与作物中的
耐盐性有关 。阿卓糖酸是否具有类似于脯氨酸和
脱落酸那样的功能 ,参与作物的耐盐保护作用目前
还没有文献报道 ,但 S I800特异片段与细菌中的阿卓
糖酸氧化还原酶基因有68%的同源性 ,很可能 S I800
是植物中阿卓糖酸氧化还原酶基因的一个片段 。
考虑到细菌中该基因编码阿卓糖酸氧化还原酶 ,是
阿卓糖酸合成代谢中的主要酶 ,在高等植物中也应
该参与阿卓糖酸的合成。本研究中 ,当黑麦幼苗受
到盐胁迫后 ,得到一个与阿卓糖酸氧化还原酶基因
有较高同源性的 cDNA片段 。我们认为黑麦经盐
胁迫后诱导该基因的表达 ,使体内有较多的阿卓糖
酸的积累 ,阿卓糖酸可能是一种新的能提高作物耐
盐性的渗透剂。虽然本工作中得到的仅仅是与阿
卓糖酸氧化还原酶基因有部分同源性的 cDNA片
段 ,全基因序列的克隆及确切功能的探讨还需要深
入一步的工作 ,但无疑 ,这一实验结果为作物耐盐
分子机理研究提供了新的资料 。
430 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
参　考　文　献
1. M oons A, G ie len J, V andeke rckhove J, et al. An ab scisic-
ac id and salt-stre ss-responsive rice cDNA from a nove l plant
gene fam ily. P lan ta, 1997, 202(4):443 ～ 454
2. 李子银 , 张劲松 , 陈受宜. 水稻盐胁迫应答基因的克隆 、
表达及染色体定位. 中国科学(C), 1999, 29(6):561 ～
570
3. 张驰 , 陈受宜. 利用 DDRT— PCR技术分析在盐胁迫下
水稻耐盐突变体中特异表达基因. 中国科学(B), 1995,
25(8):841 ～ 847
4. 马德钦 , 吕文 , 汤岚 , 等. 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克
隆与序列分析. 生物工程学报 , 1996, 12(1):65～ 70
5. 马德钦 , 吕文 ,汤岚 , 等.菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的 cD-
NA克隆. 植物学通报 , 1995, 12(1):47 ～ 48
6. K ing G J, Turne rV A , Hussey C E, et a l. Iso la tion and char-
ac te riza tion o f a toma to cDNA clone which codes for a sa lt-
induced pro tein. P lantM o l B io l, 1988, 10:401 ～ 412
7. Ram agopal S. D ifferen tialm RNA transcription du ring sa lin i-
ty stress in Barley. P roc NatlA cad Sc iUSA , 1987, 84:94 ～
98
8. 王振英 , 郑坚瑜. 用 mRNA差别显示方法分析黑麦盐胁
迫下应答基因 cDNA片段的表达特性. 作物学报 , 2001,
27(6):851 ～ 856
9. Ne lson D E , Ragho tham aK G, S ingh N K. Ana ly sis o f struc-
ture and transc riptional ac tivation o f an osmo tin gene. P lant
Mo l B iol, 1992, 19:577 ～ 588
10. L iang Z, M aD, Tang L, et al. Expression o f the spinach be-
taine a ldehyde dehydrogenase(BADH) gene in transgenic
tobacco plan ts. Chin J B io tcchno l, 1997, 13(3):153 ～ 159
11. G irauda t J, Parcy F, Bertauche N. Current advances in aba-
cisic acid action and signa ling, P lan t M o l Bio l, 1994, 26
(5):1557 ～ 1577
12. Gupta S, Cha ttopadhyay M K, Chatte rjee P. Expression o f
absc isic ac id-responsive e lem ent-binding p ro te in in sa lt-to l-
e rant indica rice(Oriza sa tiva L. cv. Pokkali). P lan t Mo l
B io l, 1998, 37:629 ～ 637
4314期 王振英等:黑麦中与耐盐性相关的 cDNA片段的克隆与序列分析