全 文 ：第 24 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004年　4 月
Vol.24　No.2　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH April 　2004
朱桔 Mn-SOD的纯化 、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用
程光宇　吴国荣　储慧君
(南京师范大学生命科学学院 , 南京　210097)
摘　要　朱桔叶中存在Mn-SOD 、Fe-SOD和CuZn-SOD三种类型 ,在 10%的PAGE中有三条活性
带 ,其中Mn-SOD的 Rf值大于 Fe-SOD与CuZn-SOD1 的Rf值相同;在 4%～ 35%的梯度胶电泳中
有四条活性带 ,而 Mn-SOD的 Rf 值最小 ,表明该酶带有较高的电荷密度。Mn-SOD 占总活性的
20%左右 ,已被纯化到均一程度 。该酶的比活性为 1 249 U/mg ,分子量和亚基分子量分别为
54.0 kD和 26.6 kD ,在紫外区最大吸收值为 280 nm ,在 95℃处理 15 min 仍保留了 46%的酶活
性 ,等电点为 5.06。该酶的活性不被 KCN 、H 2O2抑制 ,但对 1%SDS 和氯仿-乙醇液敏感。
关键词　朱桔;Mn-SOD;纯化;性质;电荷密度
Purification and differentiation of Mn-SOD from Citrus erythrosa and
application of gel concentration gradient electrophoresis
CHENG Guang-Yu　WU Guo-Rong 　CHU Hui-Jun
(School of Life Science , Nanjing No rmal University , Nanjing　210097)
Abstract　There were M n-SOD , Fe-SOD and CuZn-SOD in the crude ext ract of Citrus erythrosa
Tanaka leaves.In a 10%PAGE three act ive bands w ere seen , and Rf value of M n-SOD was big than
that of Fe-SOD and w as same as that of CuZn-SOD1.While in a 4%～ 35% gel concentration gradi-
ent electropho resis , four active bands w ere seen and M n-SOD s Rf value w as the smallest.This
means that the molecular weight of M n-SOD was the biggest and it had a high charge density .Mn-
SOD , which occupied about 20%of the total SOD activity , was purified to homogenei ty by means of
ammonium sulfate precipi tation , Sephadex G-100 gel filtration , DEAE-Sepharose and CM52 chro-
matog raphy etc.It s specific act ivity w as 1 249 U/mg.Its molecular and subuni t weight were 54.0
kD and 26.6 kD , respectively.It had one absorption maximum which w as at 280 nm.And it w as
stable to heat treatment ,46% of its activity w as retained at 95℃for 15 min.Isoelectric focusing elec-
trophoresis showed that it had a pI of 5.06.This enzyme was insensi tive to KCN and H2O2 , but w as
sensitive to 1%SDS or mix tures of chloroform and ethanol(3:5 v/v).
Key words　Citrus ery throsa Tanaka;Mn-SOD;purification;characterization;charge densi ty
超氧物歧化酶(Superoxide dismutas , 简称
SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶 ,根据
所含金属种类分为 Mn-SOD 、Fe-SOD 和 CuZn-
SOD三种类型。近几年在低等生物中还发现含 Ni
基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(1998SWXOSZ001)
第一作者简介:程光宇(1954—),男 ,高级工程师,主要从事植物生物活性物质研究及开发工作。
收稿日期:2003-11-15
的SOD同工酶 ,几种 SOD在不同植物和植物不同
器官及细胞的不同部位其分布都有所区别[ 1 ,2] ,但
它们都能有效清除对机体有害的超氧自由基 ,在防
护自由基的损伤 、预防肿瘤及植物逆境生理等方面
起到重要作用 ,特别是 Mn-SOD分子量大 ,稳定性
好 ,半衰期长 ,更加受到人们的关注 。
芸香科朱桔是长江以南广大地区常见植物 ,其
含有目前已报道的三种类型的 SOD ,在高等植物
中少见 。在含有三种 SOD的植物中单独提纯 Mn-
SOD ,由于其含量少并常常被 CuZn-SOD等主要同
工酶掩蔽 ,提纯过程较复杂 ,国内外尚未见详细报
道 ,在这方面我们做了些探索性的工作 。
1　材料和方法
1.1　材料
朱桔(Citrus erythrosa Tanaka)叶 ,取自5月上
旬的南京师范大学校园内 。
Sephadex G-100 、 DEAE-Sepharose 、 CM52 、
BSA 、Trypsin 、 cy tochromec (Sigma), SDS-PAGE
低分子量标准蛋白(上海东风试剂厂),其余试剂为
国产分析纯。
1.2　实验方法
1.2.1　酶活性测定
按S tew ert &Bew ley 的方法进行[ 3]
1.2.2　酶类型鉴定
采用抑制方法鉴定酶的三种 SOD同工酶类
型[ 1] 。
1.2.3　酶的凝胶电泳
均一胶电泳在 10%的分离胶上进行[ 4] ;梯度
胶电泳在 4%～ 35%的浓度梯度上进行[ 5] ,电泳持
续 4 500 v/h 以上 。酶活性染色采用 NBT 光化还
原法 ,蛋白质染色用考马斯亮蓝 G250;酶的等电点
测定采用等电聚焦电泳法[ 6] 。
1.2.4　分子量和亚基分子量测定
亚基分子量测定在 7.5% ～ 20%的 SDS-
PAGE上进行 ,分子量测定用Sephadex G-100凝胶
过滤法。
1.2.5　紫外光谱分析
酶的紫外吸收光谱在岛津 UV-250型紫外可
见分光光度计上进行 。
1.2.6　蛋白质含量测定
采用 Bradford法[ 7]和 Folin-酚法测定 ,以牛血
清白蛋白为标准蛋白 。
2　结果
2.1　朱桔 Mn-SOD的纯化
500g 朱桔叶洗净剪碎于-25℃处理 12 h后 ,
按1:2(w/v)加入 50 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH
7.8 ,含 1 mmol/L EDTA)在组织捣碎机中破碎匀
浆。用 8层纱布过滤 ,去残渣 ,滤液经 10 000×g
冷冻离心 15 min ,上清液即为粗酶液 。向上清液中
加入硫酸铵至 35%饱和度 ,于 10 000×g 冷冻离心
15 min , 弃沉淀 ,上清液再加硫酸铵至 90%饱和
度 , 4℃静置过夜 。15 000×g 冷冻离心 30 min ,收
集沉淀 ,将沉淀溶于 5 mmol/ L 的磷酸缓冲液(pH
7.8 ,含0.1mmol/L EDTA ,以下称 A液),透析去盐 ,
将透析液冻干 ,用 A 液溶解上 Sephadex G-100 柱
(2.5 cm×80 cm)层析分离 ,收集对CN-不敏感的活
性 部 分 , 将 其 吸 附 到 DEAE-Sepharose 柱
(2.0 cm×25 cm)上 ,用 A液洗至A280低于 0.02后 ,
分别用含 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)的
0 ～ 400 mmol/L的 KCl和 1 000 mmol/L的 KCl进行
分段洗脱 ,Mn-SOD在 1 000 mmol/L KCL 浓度下被
从柱上洗下来(图 1)。把它们合并 ,透析冷干 ,用
20mmol/L的醋酸缓冲液(pH5.6)溶解后上CM 52
图 1　朱桔 Mn-SOD 的 DEAE-Sephrose柱层析图
Fig.1　Chromatog raphy of Mn-SOD on DEAE-
Sephrose column
柱(1.5 cm×15 cm)层析 ,收集 SOD活性部分 ,再
进行一次 Sephadex G-100柱层析(图 2),得到纯化
的 Mn-SOD。酶的纯化步骤见表 1 ,从 500 g 叶片
中得到 0.76 mg 纯酶 ,酶的比活性为 1 249 U/mg ,
与犬心 Mn-SOD比活性一致[ 8] ,经凝胶电泳后进
行酶活性和蛋白染色 ,表明该酶已达到均一程度
(图 3 , 1 、8)。
2.2　酶的电泳行为
2.2.1　均一胶电泳
朱桔叶 SOD在 10%的均一胶中有三条谱带 ,
其 Rf值分别为 0.45 , 0.57和 0.62 ,第一条是 Fe-
2412 期　　　　　　　　　程光宇等:朱桔 Mn-SOD的纯化 、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用
SOD(详情另做报道)。纯化的 Mn-SOD的 Rf值为
0.57 ,与粗酶液中 Rf值为 0.57谱带相同 ,纯化的
CuZn-SOD有两条谱带 ,其中 CuZn-SOD1的 Rf值
图 2　朱桔 Mn-SOD的 Sephadex G-100层析图
ig.2　Chromatography of Mn-SOD on Sephadex G-100 column
也为 0.57 , CuZn-SOD2 的 Rf 值为 0.62。可见 ,粗
酶液中 Rf 值为 0.57 的谱带包含有 Mn-SOD 和
CuZn-SOD1二种类型(图 3 , 1 ～ 3)。
2.2.2　梯度胶电泳
在分辨率更高的 4%～ 35%的梯度胶电泳中 ,
纯化的 Mn-SOD为一条谱带(图 3 , 12),粗提液中
SOD有四条谱带 ,其中 Rf值最小的一条与纯化酶
对应 ,为 Mn-SOD ,次之的一条为 Fe-SOD ,最大的
两条为CuZn-SOD ,(图3 , 13),三种类型SOD因分
子量大小不同在梯度胶电泳中能被完全分离开 ,显
示了梯度胶电泳在植物 SOD 分离提纯中的优越
性 ,同时也表明 SOD三种类型与在浓度梯度胶中
的 Rf值有一定的相关性。
表 1　朱桔 Mn-SOD的纯化
Table 1　Purification of Mn-SOD from Citrus ery throsa
纯化步骤
Purification step
总活性(U)＊
Total act ivi ty
总蛋白(mg)
T otal protein
比活性(U/mg)
Specif ic act ivi ty
纯化倍数
Purif ication(fold)
粗酶液C rude ext ract 287 700 3 662.4 78.6 1.0
30%～ 90%(NH4)2SO4 139 518 1 642.0 85.0 1.1
Sephadex G-100 59 514 480.0 124.0 1.6
DEAE-Seph rose 22 138 118.4 186.5 2.4
CM 52 1 134 1.948 582.0 7.4
Sephadex G-100 952 0.763 1 249.0 15.9
＊在 2 mmol/ L KCN 存在下测定　The activity was determined in the presence of 2 mmol/ L KCN
2.2.3　均一胶和梯度胶电泳两者的关系
在10%的均一胶电泳结束后 ,切取具有 SOD
活性未经染色的区带 ,放在已经预电泳过的 4%～
35%梯度胶上端(图 3 , 14),加入均一胶中 3.5%的
浓缩胶液 ,采用光照聚合将其固定后进行二次梯度
胶电泳 ,同时以相同的酶液量在梯度胶上点样(图
3 , 13)。在二次电泳中 Mn-SOD就是梯度胶中第
一条带和均一胶的第二条带 ,与纯酶相对应 ,均一
胶第二条带的二次梯度胶电泳条带经薄层扫描测
得 , Mn-SOD 活性约是 CuZn-SOD1 的两倍(图 3 ,
14)。在均一胶电泳中因 Mn-SOD带有较高的电荷
密度 ,其 Rf值明显变大 ,与 CuZn-SOD1谱带完全重
叠 ,若无 Mn-SOD 、CuZn-SOD纯酶作对照 ,即使使
用抑制剂也较难正确判断酶的类型 。
2.2.4　酶的等电聚焦电泳
纯酶在 pH 3.5 ～ 10的两性电解质载体上等电
聚焦 5 h 后 , 进行蛋白染色 , 呈现一条等电点为
5.06的蛋白带(图 3 , 11),与豌豆过氧化质体和莴
苣的 Mn-SOD等电点相近[ 9 ,10] 。
2.3　酶的理化性质
2.3.1　酶的紫外吸收光谱
用岛津 UV-250 型紫外分光光度计测定酶的
吸收光谱 ,该酶在紫外区最大吸收值是 280 nm ,与
来源于高等植物的 Mn-SOD的紫外吸收值相同 。
表 2　抑制剂对酶活性的影响
Table 2　Effect on Mn-SOD activity to inhibitor
CK KCN H2O 2 1%SDS C hlorofrom-ethanol
相对活性(%)
Relative activity(%) 100 96 90 33 28
Mn-SOD活性带
M n-SOD band Yes Yes Yes No No
2.3.2　分子量和亚基分子量
用凝胶过滤法测得朱桔 Mn-SOD 分子量为
54.0 kD ,该酶在 SDS-PAGE图谱上呈现单一区带 ,
其亚基分子量为 26.6 kD(标准蛋白质分子量分别
为 97.4 、66.2 、43 、31 、20.1和 14.4 kD)(图 3 , 9),
表明该酶由两个相同的亚基组成。
2.3.3　热稳定性
取适量酶液于不同温度中保温 15 min ,取样测
定酶活性 ,结果见图 4。纯化 Mn-SOD的热稳定性
虽较 SOD粗酶液降低 ,但在 95℃时仍保留了 46%
的活性 ,说明朱桔 Mn-SOD有较好的热稳定性。
242 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
图 3　朱桔 SOD 的电泳图谱(1～ 8:10%PAGE;9 , 10:7.5%～ 20%的 SDS-PAGE;11:等电聚焦电泳;12, 13:4%～ 35%
梯度胶电泳;14:二次梯度胶电泳);3 , 13 , 14为粗酶液;1 , 4～ 9 , 11 , 12为M n-SOD;2:CuZn-SOD;10:标准蛋白质;8～ 11
为蛋白染色 , 其余为活性染色;4:5 mmol/ L KCN;5:5 mmol/ L H2O 2;6:1%SDS;7:氯仿-乙醇混合液(3:5/ v:v)
Fig.3　10% PAGE(1 ～ 8), 7.5%～ 20% SDS-PAGE(9 , 10), isoelectric focusing(11), 4%～ 35% gel concentra-
tion gradient electrophoresis(12 , 13)and tw o times gel concentration gradient electrophoresis(14)of SOD from Citrus
erythrosa Tanaka.3 , 13 , 14:crude ex tracts;1 , 4 ～ 9 , 11 , 12:purified Mn-SOD;2:purified CuZn-SOD;10:molecu-
lar weight marker;8 ～ 11 are stained for protein and others are stained for SOD activity.4:5 mmol/ L KCN;5:5
mmol/ L H2O2;6:1%SDS;7:chloroform-ethanol(3:5/ v:v)
图 4　朱桔 Mn-SOD的热稳定性
Fig.4　Heat stability of Mn-SOD fromCitrus erythrosa Tanaka
2.3.4　酶类型和对抑制剂的影响
SOD有 Mn-SOD、Fe-SOD和 CuZn-SOD三种类
型 ,常采用 KCN 、H2O2 及氯仿-乙醇 、SDS 等几种抑
制剂鉴定它们。纯化的朱桔 SOD的活性不被 KCN
和H2O2抑制(图 3:4～ 5 ,表2),但对SDS和氯仿-乙
醇液敏感 ,用 1%SDS 和 0.25倍体积的氯仿-乙醇
液(2:3/v:v)分别处理纯酶后进行凝胶电泳 ,其活性
带都消失(图 3:6 ～ 7;表 2),说明该酶为 Mn-SOD。
3　讨论
本文纯化了朱桔叶 Mn-SOD ,并对它的理化性
质及凝胶电泳行为进行了研究 ,结果表明 ,朱桔含
有CuZn-SOD 、Mn-SOD和 Fe-SOD 三种类型的同
工酶 ,其中 Mn-SOD 占总活性的 20%左右 ,朱桔
Mn-SOD分子量虽较大 ,但所携带的电荷密度亦较
大 ,在较高盐浓度下才能将其从层析柱上洗脱下
来 ,故在分离纯化中增加了困难 ,以至于分子筛效
应柱层析和离子交换柱层析反复应用 ,得到了浓度
梯度胶电泳和等电聚焦电泳中单一条带的高纯度
Mn-SOD 。纯化的 Mn-SOD与其它来源于植物的
Mn-SOD具有相似的理化性质[ 9 , 10] ,但它在均一胶
和梯度胶电泳中的行为 ,表明它比其它来源的 Mn-
SOD带有较高的电荷密度 ,它在均一胶中的 Rf 值
明显变大 ,以至与 CuZn-SOD1重叠 ,类似的现象也
出现在水稻和枸杞中[ 11 , 12] ,可能是其氨基酸组成
中碱性和酸性氨基酸组成的差异而影响到酶的凝
胶电泳行为。由于目前采用均一胶电泳研究 SOD
同工酶 ,其 Rf值受酶所带电荷 、分子大小等因素影
响 ,当出现谱带重叠时 ,即使用抑制剂处理 ,由于不
同类型SOD对抑制剂敏感性不同 ,也难以得到正
确结果 ,特别是 Mn-SOD与 Fe或 CuZn-SOD重叠
时 ,会造成这类同工酶的漏检 。
通过二次电泳 ,阐明了植物中三类 SOD 在均
一胶和梯度胶电泳中的关系 ,其中 Mn-SOD 在第
一次均一胶电泳中的行为 ,表明它所带电荷密度大
于 Fe-SOD;在二次梯度胶电泳中的行为 ,说明了它
的分子量最大 ,符合三类 SOD 分子量大小特性 。
由于梯度胶电泳排除了电荷的干扰 ,而且其 Rf 值
大小与三种 SOD分子量呈负相关 ,据此可初步确
定 SOD类型 ,特别是当不同类型 SOD因所带电荷
差异较小出现 Rf值接近 、甚至相等的情况时 ,用梯
度胶电泳结合抑制剂处理 ,一次电泳就可准确判断
三种 SOD 类型。实验结果表明 , 对于朱桔 Mn-
SOD的分离 、鉴定 ,这种电泳是有效的 、可靠的 。
我们已将梯度胶电泳用于 50多种高等植物 SOD
同工酶研究 ,发现了许多植物含有 Fe-SOD ,而用均
一胶电泳却没能发现它们的存在[ 13] ,梯度胶电泳
能检测到 10-14mol/L 的 SOD ,是均一胶电泳检测
2432 期　　　　　　　　　程光宇等:朱桔 Mn-SOD的纯化 、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用
灵敏度的近百倍[ 5] ,对于研究体内微量 SOD ,有独
特之处 ,本研究发现在 Fe 和 CuZn-SOD 间还有一
条相对活性低于 1%的 、对 SDS 敏感的谱带(见图
3 , 13),它的类型和性质 ,有待我们进一步研究确
定。
真核生物 Mn-SOD 多为四聚体组成[ 9 ,14 , 15] ,
二聚体的酶主要存在于原核生物中 ,本文发现朱桔
Mn-SOD是由二个亚基组成 ,这一点相似于原核生
物的酶 ,但近年来也发现少数真核生物如犬心 Mn-
SOD[ 8] ,猴头和佛州侧耳子实体 Mn-SOD 都是二
聚体[ 16 ,17] , 珍珠 黍的 Mn-SOD 分 子量 为 35
kD[ 18] 。生物体内存在三种类型 SOD ,一般认为
Mn-SOD和 Fe-SOD起源很早 , 来源共同的祖先 ,
它们在一级结构及空间结构有很大的相似性 ,而
CuZn-SOD是在以后的发展中单独进化而成 ,是真
核生物的酶 ,它们都能有效清除体内的自由基 ,但
因Mn-SOD在歧化超氧自由基的过程中不会产生
中间产物羟自由基 ,并且定位于线粒体内 ,因而在
活性氧代谢中的地位更加引人注目。最近的研究
显示 ,Mn-SOD的基因的表达 ,既可因细胞受到辐
射 、细胞因子和病毒感染等因素的刺激而显著提
高 ,也可随细胞的癌变而大幅度降低 ,它的应激性
波动现象与肿瘤发生的相关性 ,已成为人们研究的
热点 ,张艳红等[ 19]进行的靶向性 Mn-SOD融合肽
的研究 ,为氧自由基相关的神经性疾病的治疗 ,开
拓了一条新途径。朱桔资源丰富 ,其 Mn-SOD含
量也较高 ,而且提取 、纯化相对容易 ,如在此基础上
改进工艺 ,提高 SOD得率 ,则有广阔的应用前景 。
参　考　文　献
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