全 文 ：第30卷第2期
2011年4月
生态科学
EcologicalS ience
30(2)：174．177
Apr．20ll
赵怡，凌辉生，李任强．枯草芽孢杆菌Mn—s0D基因的克隆及原核表达[J】．生态科学，2011，30(2)：174一177．
ZHAOYi，LINGHui·sheng，，LIRen—qiallg．CloIlingofMn-SODene丘Dm觑f跏J甜6打胁andexpressionin西砌洲曲面cD疗【J】．
&Df(泓4，＆fgwB201l，30(2)：174一177．
枯草芽孢杆菌Mn—SOD基因的克隆及原核表达
赵怡，凌辉生，李任强+
暨南大学生物工程学系，广州510632
【摘要】为了实现Mn．s0D基因在大肠杆菌(E∞ff)中的可溶性表达，根据枯草芽孢杆菌(B口cf，，螂s材6“胁)168sodA核酸序列
设计引物，以枯草芽孢杆菌ATCC9372基因组为模板，PCR扩增获得了Mn．SOD基因。将此基因重组至原核表达载体pET．28a，
构建含Mn．sOD基因的重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL2l(DE3)。异丙基．B—D．硫代半乳糖苷(IPlG)诱导表达获得Mn．sOD，
蛋白分子量约为26l【D，占全菌蛋白的45．6％。改良的连苯三酚自氧化法测定sOD活力，菌体可溶性总蛋白s0D比活为51．09U
·mg～，是对照组的4．84倍。枯草芽孢杆菌ATCC9372Mn．SOD基因在大肠杆菌BL2l(DE3)中首次成功表达，产物具有较高的
可溶性和活性，为大量制各Mn．SoD奠定了基础。
关键词：枯草芽孢杆菌；~h1．SOD；原核表达；活力
doi：10．3969／j．ism．1008．8873．2011．02．014中图分类号：Q78l 文献标识码：A 章编号：1008．8873(2011)02．174．04
CloningofMn—SoDgenefrom曰口c批s．s口6f抛andexpressionin协幽P眈办缸c口历
ZHA0Yi，LINGHui-sh锄g，，LIR∞一qi柚g。
Dep砷n硎耐B龇chnolo斟，J{n册踟量v哪i桫’勖锄簪h佣5l0632．Ch№
Ab蚰阻ct：hlord盯t0achievetllesolubleexpressionofMh—SODgeneinEcD矗，Mh-SODge∞w觞锄plifiedf-romtlleg∞omicDNAof
鼠配l盯淞s甜6矗凰ATCC9372accord啦t0thesodAgeneseq啪ceof&s“6打凰168．TheclonedMn-SODgenew髂iIlscned础on坞
exp∞ssionvectorpET-28atoberccombin柚tplaLsfIlidpET·28a-Mn-SOD孤dwasthen仃allsfonnedforexpressionillEcD疗BL2l(DE3)．
111eMn-SODproteinw mmolecul盯weightofabout26kDwasexpressediIlEcD，fa胁iIlduction惭tlls叩r叩yl毋D—
thiogalactoside(IPTG)，whichacco呲bedforapproximately35．6％oftotalbacterialpmtein．Theer四rme扯tiv埘ofMn-SOD啷
船sayedwimimprovedpyrogallic∽id舭，【idationmetllod．111e佗sultssh0WedmatthespecificactiV时ofSODinthetotalsoluble
pro痂w酗51．09U·mg一，andw勰4．84tiIllesofcon仃oIgroup．Mn-SODg∞eof丑s甜6打凰ATCC9372isfirstuccess劬yexpressed
illE∞矗BL21(DE3)，龃ditsproductspossesslliglldissolubil时柚denzymeactiVity．
Keywords：觑f舰ss“6“凰；m衄g锄ese—superoxidedismutase；proka巧oticexpress on；detenllinationofactiV时
收稿日期：20lO加8．14收稿，2010．1lm2接受
基金项目：暨南大学自然科学基金(“0073)
作者简介：赵怡(1985一)，女，河南洛阳人，主要研究方向为蛋白质工程。
’通讯作者：李任强，E-mail：仃qli@jnu．edu．∞
万方数据
2期 赵怡，等：枯草芽孢杆菌Mn．s0D基因的克隆及原核表达 175
1 前言(Introductions)
’
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)是
一种金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反
应生成氧气和过氧化氢，保护生物细胞免受超氧自由
基和活性氧类物质的毒害【l】，是重要的氧自由基清除
剂。按照其结合的金属辅因子不同可分为4类：
Cu／『Zn．SOD、Mn—SOD、Fe．SOD和Ni—SOD。由于SOD
具有防御氧毒性、增强机体抗辐射损伤能力、抗肿
瘤等功效【2训，广泛受到国内外科研工作者的关注和
重视。近年来也有研究表明，SOD可以明显提高植物
的耐寒、耐旱、耐病等抗逆能力【5】。目前SOD大多是
从天然动植物中提取，由于原材料有限及纯化困难等
原因导致制品纯度低、产量少且生产成本耐6|。因此，
通过基因工程技术实现SOD的大规模发酵生产，开发
廉价、安全、高效的SOD表达系统将具有良好的应用
前景【7】。虽然目前国内已从许多生物体克隆到了
Mn．SOD基因，并且部分基因已经在原核或真核生物
体内进行了表达【7。01，但对于枯草芽孢杆菌ATCC
9372Mn．SOD的克隆表达等还未见报道。枯草芽孢杆
菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微
生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食
品、畜牧业、水产及科研诸领域。本研究以枯草芽孢
杆菌ATCC9372菌株为材料，利用原核表达系统在
大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的Mn．SOD基因，为该
基因研究和大规模发酵生产SOD打下基础。
2 材料与方法(MateriaIsandmethods)
2．1菌种及质粒
E．co，fDH5a、E．co，fBL21(DE3)、pET一28a为
本实验室保存；曰卯f胁J“6疗凰ATCC9372由广东省
微生物研究所惠赠。
2．2试剂
限制性内切酶EcoRI和NotI、T4连接酶及
PrimestarDNA聚合酶购自Takara公司；细菌基因组提
取试剂盒购自Omega公司；DNA纯化试剂盒、质粒小
量抽提试剂盒、蛋白marker购自北京天根公司；抗生
素kanamycin购自si伊Ila公司；其余试剂均为分析纯。
2．3引物设计
根据Geneballl(发表的肋cf，，姗s甜6打份168的sodA．
基因序列设计引物，并在上下游引物的5’端分别引入
EcoRI、NotI酶切位点(下划线)。上游引物序列
为：5’一GGC鱼丛I!￡ATGGCTTACGAACTTCC-3’，
下游引物序列为：
5’AGAAT堑匿墓iQ￡￡!三￡TTATTlrI’(；(了rrCCK]rGTA．3’。
引物由上海生工生物有限公司合成。
2．4基因组DNA的提取和PcR扩增目的基因片段
按照细菌基因组提取试剂盒说明提取枯草芽孢
杆菌ATCC9372的基因组DNA。取2此作为PCR扩
增的模板，PCR扩增程序为：94℃预变性3min，98
℃lOs，58℃15s，72℃1nlin，30个循环，最后
延伸5min。PCR产物用琼脂糖电泳进行检测，并用
DNA纯化试剂盒回收目的基因片段。
2．5重组表达载体的构建、序列测定和分析
用EcoRI和NotI双酶切目的基因片段，通过
DNA纯化试剂盒回收，．并进一步将目的片段克隆到
表达载体pET．28a上，转化到克隆宿主菌DH5a，在
LB平板(含卡那霉素)上培养过夜，挑取单菌落抽提
质粒，单、双酶切鉴定该重组质粒，并进行DNA
序列测定和分析(序列测定由上海生工生物有限公
司完成)。
2．6重组质粒在大肠杆菌BL2l(DE3)的表达
将构建好的重组表达质粒pET．28a—SOD转化入
大肠杆菌BL2l(DE3)，涂布于含卡那霉素的LB平板
上。挑取含有重组质粒的单菌落至LB液体培养基(含
卡那霉素)中，37℃摇瓶培养12h后，按1％的接种量
接种到10nlLB液体培养基(含卡那霉素)，37℃培
养至A600=O．4～0．6时，加入IPTG至终浓度为l
珊【nol·L～，37℃继续培养4h后收集菌体。超声(功率
400W，时间3s，间隔5s，共60次)破碎菌体，离心
后分别收集上清液和沉淀。SDs．PAGE分析蛋白质的
表达，所用的分离胶浓度为12％，恒流25II迭。
2．7soD活力和蛋白质含量的测定
分别离心收集37℃诱导过夜的重组菌和未诱导
的重组菌(对照组)，PBS重悬菌体，超声破碎后离
心取上清。将两种上清液适当稀释后作为样液，用改
万方数据
76 ’E态科学Ec01雌啪】scI⋯ 30枯
良的连苯互酚n舨化法制定样液的s0D活力⋯’．每
种样液噩氲测lO日：。BcA泣铡定样液的蛋白质浓度．
以牛血清白蛋n为杯准蛋白。
3结果与讨论(Resu帖andAnalv∞s)
3．1枯草芽孢杆菌ATcc9372基因组DNA和目的基
因的鉴定
从帖草芽抱杆菌A1℃c9372中提取得到基因组
DNA经I％球脂耩凝腔屯泳检测没有杂带，符合PcR
的要求(图1)。以基凼组DNA为模扳．用特异引物
进行PcR扩埔，1％琼脂精凝股电泳结果娃示在620bp
附近ilj现一条带，与预期太小相符(嘲2)。
Ml1㈣㈨“1：Mns0D∞叱RF#
圈2Mn{0D基茵的PcR扩增鉴定
以木擞酶切和已做啦晰切的程组质粒为埘照．
pETl28a．s0D经E∞Rl和NolI般酶切鉴定．出现r
s3kb的载体片段和约620bp的目的片段(煳3)，620
bp片段与PcR产物大小致。将椅建好的重纽质粒进
行序列测定．所褂的U的肚园片段大小为609b口’序
列为预期的s0DJ争列，说明U的甚凼已经旷确连接到
载体上。BLAsT结果娃求．奠氨摹酸序州10j‘它几
株枯草芽孢杆菌Mn-s0D的同源件在90％以上．与枯
草芽孢杆菌168Mn．sOD的l目潍性为94％，活性中心扁
度保守。
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圈3重组衰选质粒的奠切鉴定
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Rg2lden6ncaH曲“PcR“meMn-∞D柙eby
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3．2 pET08a{oD重组质粒豹鉴定结果和序列分析
33M棚D基因的诱导衰达
对下不同的重组蛋白采用pET28系列表达其擐
佳诱导的I哪浓度、温度和时问都不相同．本研究
只采用常规诱导而投有探索摄佳诱导条件．因为首先
要验、证目的辈因是否能成功表达。根据该蛋白的分子
量大小和pET_28a载休中的多兜隆位点上游序列．预
测表选的蛋白大小约为26kD。对破碎菌上清液和沉
淀分别进行sDs．PAOB椅测，37℃在l叫noI．L‘lm
诱导4h后出现删姓的竹一虽白条带(图4)．大小约
为26kD，与理论值耵晰。对比茼体裂解液的L清和沉
淀．发现上清巾的条带报明显．说明重组蛋白大部分
以可溶性形式存在．少最以包涵体形式表逃。利川
Qu龃岫One软件分析．4h目的蛋n表达量占总蛋白
表选∞45％。
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万方数据
2期 赵怡，等：枯草芽孢杆茁‰{0D基因的克睡及原棱表述 177
用改良的连苯三酚自氧化法测定Im诱导后的
重组苗可溶性总蛋白s0D比活为5l09u·rⅡz。1，对
照组即未诱导的重组苗可溶性总蛋白s0D比活为
lO55u·mfl，即诱导后的重组苗s0D比活是对照组
的484倍。说明克隆的Mn—s0D基因在大肠杆菌中得
到了较高的表达。
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图4sOD基因在E∞日BulmE3l中寰选的sD}P^GE
H¨sDs·PAGE蚰_峥出ofs∞驴一Pre啪dhEm口
BL2l(DE∞
本研究成功克隆了枯草芽孢杆菌ATcc9372的
M小s0D基因，该基因含有609个碱基，编码203个
氨摹酸，与预期的s0D基因序列一致。其氨基酸序列
与其它几株枯草芽孢杆菌Mn．sOD相比同源性高达
90％以上。
成功构建了Mn—soD基因的原核表选重组质粒
6ET一2s}sOD．并首次实现了s0D在大肠杆菌中的
高效表达。
所表达的目的酶可溶性高，占苗体可溶性蛋白的
456％：酶活力高，比活力达5l09u哪一。同时也
避免了较为繁聩的包涵体变复性过程。该重组茁的构
建为利用微生物开展sOD基因工程及其下游技术的
研究莫定了基础．具有广泛的经济价值和社会意义
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展，l蜩I，18【21：163
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万方数据
枯草芽孢杆菌Mn-SOD基因的克隆及原核表达
作者： 赵怡， 凌辉生， 李任强， ZHAO Yi， LING Hui-sheng， LI Ren-qiang
作者单位： 暨南大学生物工程学系,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2011,30(2)

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