全 文 ：第 21 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001 年　10 月
Vol.21　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2001
用双向电泳分析百合减数第一分裂周期蛋白质的变化
王振英　彭永康　陈　宏
(天津师范大学生物系 ,天津　300074)
摘　要　利用双向电泳方法检测到百合减数第一分裂花粉母细胞内约有 130 种蛋白质组分 , 其
中有两类蛋白质呈现周期性变化。70KD/pI6.1 、66KD/pI6.4 、68KD/pI7.2在中期 、后期消失 , 末
期重新出现;而 10KD/pI5.3则在中 、后期出现 , 末期消失。在减数第一分裂不同时期也有多种
蛋白质的合成与降解现象 , 20 KD/pI3.7 、17 KD/pI3.8 、16 KD/pI3.7 、15 KD/pI3.3 、11 KD/pI3.
8 、10 KD/pI3.7六种蛋白质在后期合成;蛋白质呈现出周期变化和在不同分裂时期的合成与降
解可能与减数分裂不同时期的周期调控有关 。
关键词　减数第一分裂;双向电泳;细胞周期;调控;百合
STUDIES ON CHANGE OF PROTEINS AT DIFFERENT FIRST
MEIOTIC PHASES IN LILITUM DAVIDILL DUCH USING 2D SDS-PAGE
WANG Zhen-ying　PENG Yong-kang　CHEN Hong
(Department of Biology T ian Jin No rmal University , Tian Jin 300074)
Abstract　More than 130 protein species have been identified in the fi rst meio tic phase of pollen
mother cells in Lil ium davidii Duch.Comparing the proteins change during the different phase it
was show n that different pat terns of cyclic changes occurred in various proteins.70 KD/pI6.1 , 66
KD/pI6.4 , 68 KD/pI7.2 , were disappeared at metaphase , anaphase and were appeared again at the
telophase , protein specie , 10 KD/pI5.3 , how ever , was appeared at metaphase , anaphase and w as
disappeared at telophase.Synthetic and deg radation of some pro tein species w ere also observed during
the different first meiotic phase.Pro tein species of 20 KD/pI3.7 , 17 KD/pI3.8 , 16 KD/pI3.7 ,
15KD/pI3.3 , 11 KD/pI3.8 , 10 KD/pI3.7 were syntheticed at anaphase.It w as thought that there
are the relationship between the protein cyclic change , synthetic degradation at different first meiotic
phases and meiot ic cyclic regulation.
Key words　first meiosis;2D SDS-PAGE;cell cycle regulation;Lilium davidii Duch
　　自 Howand等在 1953年发现细胞周期现象后 ,
对真核生物细胞周期及周期调控的研究国内外已积
累了大量的资料[ 1 ～ 3] ,Cyclin和 CDK两类周期蛋白
的发现 ,使我们进一步了解到细胞周期及周期调控
的一些生化机理 。细胞周期运行是与许多生化事件
按一定顺序有条不紊地进行的 ,周期蛋白在调控 G1
※S 、G2※M 两个时相转换起着关键作用[ 4 ,5] 。目
前对于有丝分裂调控研究已取得突破性进展 ,如对
Cyclin 、CDK 、MF(有丝分裂因子)、IMF(有丝分裂抑
制因子)的生化性质及调控机理作了大量的研
第一作者简介:王振英(1965-),女 ,副教授 ,博士研究生 ,主要从事植物生理 、分子生物学的研究。
　　教育部《高等学校骨干教育资助计划》项目资助。
　　收稿日期:2001-04-16
究[ 7 ～ 9] ,尤其是细胞分裂周期基因(cdc)的发现和克
隆成功 ,使对细胞周期事件如染色质的凝集与去凝
集 、核膜崩解与重建的研究进入分子水平。细胞周
期及周期调控的研究虽然取得巨大进展 ,但仍有许
多空白点 ,如高等植物细胞有丝分裂周期尤其是 M
期周期 、周期调控 ,减数分裂周期 、周期调控的比较
研究等。本研究用高度自然同步化的百合花粉母细
胞为材料 ,用 2D SDS-PAGE 方法和超敏感银染技
术 ,对减数第一分裂周期蛋白质变化 、周期时相变化
有关特异蛋白的某些生化特性及与周期调控可能关
系作了初步探讨 ,主要结果如下。
1　材料与方法
1.1　实验材料
百合(Li lium davidi i Duch)花粉母细胞减数第
一分裂不同阶段花药为材料。
1.2　蛋白质样品的制备
在光镜下检查选取花粉母细胞处于减数第一分
裂的前期 、中期 、后期和末期的百合花药 ,并置载玻
片上 ,挤出其中的花粉母细胞丝状体 ,解剖针轻轻挑
开丝状体使花粉母细胞游离于 200μl无离子水中 ,
用移液器各吸取 100μl , 加等量蛋白质变性液
(60mmol/L Tris-HCl 、3%SDS 、5%β 巯基乙醇 、
10%甘油 、0.05%溴酚蓝),沸水下变性 3分钟 ,冷却
后供 2D SDS-PAGE分析用。
1.3　双向 SDS-PAGE
参照O Farrell[ 11]介绍的方法 。第一向等电聚
焦凝胶浓度为 3%,内含 9M 尿素 、2%Np40 、两性离
子(pH5-7 , pH3-10 , 2:1)、TEMED 、AP 。将凝胶
注入凝胶管(120mm×3mm),预聚焦(120V ,15min;
300V , 30min;400V , 60min)。预聚焦结束后 ,每管
加入蛋白质样品 60μl , 400V 下等电聚焦 16h。等电
聚焦结束后 ,将样品胶放入平衡液(6mmol/L Tris-
HCl , pH6.8 , β 巯基乙醇 , 10%甘油 ,2%SDS)中平
衡 20min。
1.4　第二向 SDS-PAGE分析
根据 Laemmli[ 10]等提供的方法 ,分离胶浓度为
12.5%,浓缩胶浓度为 2.5%。在 40mA条件下 ,电
泳至溴酚蓝前沿距凝胶底部 1cm 处停止电泳 。电
泳结果用 0.4%AgNO3染色[ 12] 。
2　结果
2.1　百合减数第一分裂花粉母细胞内的蛋白质组
分
用 2D SDS-PAGE分析表明 ,百合减数第一分
裂花粉母细胞内约有 130种以上的蛋白质斑点被检
测到 ,有较广泛的分子量范围(12 ～ 165KD)和较宽
的等电点(pI4 ～ pI7.5)。在所检测到的 130种以上
的蛋白质斑点中 ,约有 40 余种蛋白质斑点清晰 ,着
色深 ,表明其含量较为丰富 ,约有 16种蛋白质斑点
尤为如此 ,这 16种蛋白质斑点的分子量和等电点分
别为 97KD/pI5.7 、90KD/pI6.1 、 66KD/pI6.4 、
68KD/pI5.0 、40KD/pI4.4 、37KD/pI7.3 、 26KD/
pI4.5 、26KD/pI4.9 、24KD/pI5.0 、23KD/pI5.0 、
22KD/pI6.5 、18KD/pI6.4 、16KD/pI6.3 、 13KD/
pI5.1 、14KD/pI5.6 、13KD/pI7.1.
2.2　百合花粉母细胞减数第一分裂不同分裂时期
蛋白质的变化
(1)前期与中期:前期与中期的 2D SDS -
PAGE谱型基本一致 ,但蛋白质的变化非常明显 ,某
些蛋白质在这一时期合成 ,也有某些蛋白质在这一
时期降解 ,如与前期相比 ,至少有 6个蛋白质斑点消
失(如 120KD/pI5.7 、70KD/pI6.1 、66KD/pI6.4 、
68KD/pI7.2 、58KD/pI7.2 、35KD/pI7.2)了 , 而在
26KD/pI4.3和 12 KD/pI5.1处又产生两个新的蛋
白质斑点(图 1b箭头所示).
(2)中期与后期:与前期和中期相比 ,后期最明
显的特征是 2D SDS-PAGE的谱型变化较大 ,虽然
蛋白质分子量范围保持相对稳定 ,但 pI 的范围变
宽 , 在靠近酸性端有多个新的蛋白质斑点被检测
到 ,其中最为明显的是靠近低分子量处的 6个斑点
(20KD/pI3.7 、17KD/pI3.8 、16KD/pI3.7 、15KD/
pI3.3 、11KD/pI3.8 、10KD/pI3.7),在中期所合成的
蛋白质斑点(26KD/pI4.3 、12 KD/pI5.1)此处依然
存在 ,其中 12KD/pI5.1的斑点十分清晰。
(3)后期与末期:从 2D SDS -PAGE 谱型上
看 ,末期的变化与后期相比也是比较大的 ,有多个蛋
白质斑点的增加和消失现象 ,其中在低分子量区 ,有
一个含量很丰富的斑点显示(13KD/pI4.3),这一斑
点在前期 、中期和后期中是没有见到的(图 1d 箭头
所示)。除此以外 ,还有一些蛋白质斑点呈现出周期
性变化现象 , 如在大约 70KD 、66KD和 68KD高分
子量处 ,pI分别为 6.1 、6.4 、7.2的 3个斑点在前期
被检测到 ,但到了中期和后期消失 ,而末期时又重新
出现。在大约 10KD/pI5.3 低分子量处 ,则有一个
斑点在前期没有检测到 ,而在中期和后期时出现 ,但
到了末期时 , 这两个斑点又消失了(图 1d 箭头所
示)。
2.3　百合花粉母细胞减数第一分裂周期蛋白质的
变化规律:
5974 期　　　　　　　　　　　王振英等:用双向电泳分析百合减数第一分裂周期蛋白质的变化
用 2D SDS-PAGE检测结果表明 ,百合减数第
一分裂周期蛋白质呈现明显的变化 ,并有一定的规
律性 , 这一变化特征主要表现为:
(1)有 2类共 5种蛋白质呈现明显的周期性变
化现象 ,三种高分子量蛋白质(70KD/pI6.6 、66KD/
pI641 、68KD/pI7.2)在中期 、后期消失 ,到了末期又
重新出现;低分子量处 1种蛋白质(10KD/pI5.3)则
在中期 、后期出现 ,但到了末期又消失;
(2)多种蛋白质的合成和降解:除两类呈周期
性变化的蛋白质外 ,在花粉母细胞减数第一分裂的
不同时期均可检测在某一分裂时期新合成的蛋白质
和某些蛋白质的降解现象 。如前期到中期有两种蛋
白质(58KD/pI7.2 、35KD/pI7.2)在这一时期转换
中消失 ,中期至后期分别有 6种新的蛋白质合成 ,后
期到末期也有蛋白质合成与降解现象。
图 1　百合花粉母细胞减数第一分裂周期蛋白质的变化
Fig1.The changes of proteins at different first meiotic phase
A　前期;B　中期;C　后期;D　末期
A prophase , B metaphase , C anaphase , D telophase
3　讨论
细胞分裂周期和周期调控的生化 、分子生物学
分析在动物和酵母中已有很多报道[ 12 ～ 14] ,CDKs在
G1/S 和G/M 期的时相转换及 Cyclins在细胞分裂
周期中的作用机理也已有很好的理解 ,但上述研究
主要集中在间期-M 期 ,而对M 期不同时期的生化
及分子生物学分析尚未涉及 ,这一时期是否也有类
似CDKs 、Cyclins蛋白的合成与降解? 它们在 M 期
不同时期的时相转换有什么关系? 这方面的研究进
展较慢。而在植物中更加滞后 。虽然在很多高等植
物中 CDK基因已被克隆[ 15-17] ,但其在细胞周期及
周期调控中作用机理还没有弄清[ 6] , CDKs 、Cyclins
的作用机理了解更少 。减数分裂周期及周期调控的
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生化 、分子生物学分析则迄今为止尚未有人涉及 。
本研究以高度自然同步化的百合花粉母细胞为材
料 ,用 2D SDS-PAGE的方法结合超敏感银染技术
得到的初步结果表明:百合花粉母细胞减数第一分
裂周期蛋白质呈现出较有规律的变化 ,每一分裂时
期都有一些特定的蛋白质被合成或降解 ,尤其值得
指出的是其中两类呈周期性变化蛋白质 , 70KD/
pI6.1 、66KD/pI6.4 、68KD/pI7.2 三种蛋白质在中
期和后期消失 ,但在末期时又重新出现 , 10KD/pI5.
3蛋白质则在中期合成 ,延续至后期 ,在末期时又消
失。这两类呈周期性变化的蛋白质是否就是 M 期
的CDKs或Cyclins ,目前尚不能肯定 ,从分子量上看
也不吻合 ,但它们却与 M 期的不同时期的转换而产
生变化 ,可能是一类与 M 期周期变化有关的蛋白
质。由于本工作仅对这两类蛋白质的基本生化特性
(分子量 、等电点)做了初步分析 ,还没有完成细胞内
定位 、分离纯化及氨基酸序列分析 ,对这两类蛋白质
还不能做最后定论 ,但应该说明的是 ,本研究所选用
的实验材料是高度自然同步化的百合花粉母细胞 ,
并经严格镜检 ,取材无误 ,加之双向电泳实验结果的
重复性可以保证 ,超敏感银染技术方法可靠 ,因此 ,
这一实验结果对于深入开展高等植物减数分裂周期
及周期调控生化机理的研究是有一定参考价值的 。
参　考　文　献
1.Norbury C , Murse P.Animal cell-cycle checkpoint and
feedback controls.Nature , 1992 , 359:599 ～ 604
2.Nurse P.Universal control mechanism regulating onset of m
-phase.Nature , 1990 , 344:503 ～ 508
3.Hartwell LH , Weinert T.A.Checkpoints controls that en-
sure the order of cell cycle events.Science , 1989 , 264:629～
634
4.Heuvel SVD , Harlow E.Distinct roles for cy clin-dependend
kinases in cell control.Science , 1993 , 262:2050 ～ 2054
5.Kaffman A , Herukowitz I , T jian R, O Shea EK.Phospho-
ryl action of the transcription factor Pho4 by a cyclin-CDK
complex PHO80-PHO85.Science , 1994 , 263:1153～ 1156
6.Peter W , Doerner.cell cycle regula tion in plants.P lant
Physiol , 1994 , 106:823 ～ 827
7.Jerome , Wuarin , Paul Nurse.Regulatioing S phase:CDKs ,
Licensing and pro teolysis.Cell , 1996 , 85:785 ～ 787
8.Hir t H ,Mink M , Pfosser M , Bogre L , Gyorgyey J , Jonak
C , Garthe A , Dudits D , Heberle-Bo rs E.Alfalfa cy clins:
Differential expression during the cell cycle and in plant or-
gans.Plant Cell , 1992 , 1531～ 1538
9.Lew DJ , Reed SI , A proliferation of cyclins.T rennds cell
Bio , 1992 , 2:77～ 81
10.Laemmli , U K.Cleavage of stuctura proteins during the
assembly of the head of bacteriophase T4.Nature (Lond).
1970 , 227:680 ～ 685
11.O Farrell.P.H.High resolution of tw o dimensional elec-
trophoresis o f protins.J.Bio Chem , 1975 , 250:4007～ 4021
12.Wary , W , Boulikas T , Wary , V.P , Hancock.R.Silver
staining of proteins in polyacrylamide gels.Anal Biochem ,
1981 , 118:197 ～ 203
13.Norbury C , Nurse.P.Aminal cell cycles and their control.
Annu Rev Biochem , 1992 , 61:441 ～ 470
14.Fo rsburg SL , Nurse P.Cell cy cle regulation in the yest
Saccharomyces cerevisiae and Schizosccharomyces pombe.
Annu Rev Cell Biol , 1991 , 7:227～ 256
15.Ha ta S , Kouchi H , Suzuka I , Ishii T.Iso lation and char-
acterization o f cDNA clones for plant cyclins.EMBO J ,
1991 , 10:2681 ～ 2688
16.Hemerly AS , Ferreira P , Engler JDA , Montagu MV , En-
gler.C , Inze D.cdc ZA expression in A rabidopsis is linked
with competence fo r cell division.Plant Cell , 19933 , 5:1711
～ 1723
17.Hemerly AS , Bergounioux C Van Montagu M , Inze D.
Genes regulating the plant cell cy cle:Isoltion of a mitotin like
cyclin from Arabidopsis thaliana.P roc Natl Acad Sci , USA.
1992 , 89:3295 ～ 3299
5994 期　　　　　　　　　　　王振英等:用双向电泳分析百合减数第一分裂周期蛋白质的变化