全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 17 卷　第 1 期 1997 年　1 月
Vol.17　No.1 Jan., 　1997
小麦 G —型细胞质雄性不育的育性恢复因子 Rf3的研究
Ⅱ.总体 DNA构建提莫菲维小麦基因组文库①
高东杰①　曹海明　林江南　王同昌
(哈尔滨师范大学生物系 , 哈尔滨 150080)
摘　要　分别用 Pst Ⅰ 、Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ三种限制性内切核酸酶切割提莫菲维
小麦基因组 DNA ,再与用相应酶处理的载体 pUC119连接 ,然后转化到大肠杆菌
菌系 DH5α之中 。转化效率为 1.2×104/μg 。经α互补检测 ,初步筛选重组子。随
机挑取单菌落分别培养 ,提取质粒 ,经琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交 ,最后确定重组
子 ,重组率为 43.8%。粗略地估计了克隆片段在基因组中的拷贝数 。
关键词　提莫菲维小麦;基因组文库;斑点杂交;育性恢复因子
STUDIES ON FERTILITY RESTORER GENE Rf 3 AGAINST
G-TYPE CYTOPLASMICMALE STERILE IN WHEAT
Ⅱ GENOMIC LIBRARY CONSTRUCTION OF
T.TIMOPHEEVI USING TOTAL DNA
Gao Dong-jie1　Cao Hai-ming2　Lin Jiang-nan2　Wang Tong-chang2
(Department of Bio logy , Harbin Normal University , Harbin 150080)
Abstract　Genomic DNA of T .timopheevi was digested with three restriction en-
zymes , Pst Ⅰ , Hind Ⅲ and EcoR I.The fragments w ere ligated wi th the plasmid
pUC119 which w as treated w ith the some enzyme before.The transformation effi-
ciency is 1.20×104/μg.Recombinants were determined by means ofα-complemen-
tary test , agarose gel elect rophoresis and do t hybridizat ion.The recombination fre-
quency is 43.8%.
① 高东杰现工作单位:黑龙江大学生物研究所 ,哈尔滨 , 150080(Deparmen t of Biological Engineering Heilongjiang U-
niversity , Harbin 150080)
　　国家及黑龙江省自然科学基金资助项目
　　1996年 9月收稿。
Key words　Fertility resto rer , Genomic library , Do t hybridization , Tri ticum
timopheevi.
基因工程技术在当前农业生产上已显示出具有巨大经济效益的潜力。基因工程技术的
关键是目的基因的识别和分离〔1〕 。有了分离出来的基因才能进行基因重组 、遗传分析或遗
传操作 。自从 1979年美国斯坦福大学生物化学家 Berg 首次实现了 DNA分子的试管内重
组 ,以细菌质粒为载体与 DNA片段的重组实验取得了很大成功 ,目的基因的克隆技术逐步
建立起来〔2 , 5 , 6〕。但是 ,到现在为止 ,全世界克隆的植物基因不超过 100个 ,常用的才 30多
个。我国现有的工作基础和技术队伍都很薄弱 ,各有关实验室所用的基因大部分引自国外。
从长远发展来看 ,要发展植物基因工程研究 ,必须独立地克隆 、分离或合成具有潜在的巨大
经济价值的基因 。
在已经发展出来的分离植物基因的方法中 ,一种方法是依靠与目的基因紧密连锁的分
子标记 ,从基因组文库中钓取相应的克隆片段 ,再用“染色体滑步法”确定目的基因片段并最
后分离目的基因〔7〕 。最近的研究成果说明这一方法是可行的〔13〕 。从特定基因的近等基因
系中快速分离与该基因紧密连锁的 DNA 顺序的方法使这一程序更加具备了可操作
性〔10 , 11〕 。已经被确定的小麦G 型(即 T 型)细胞质雄性不育的育性恢复基因之一的 Rf3为
一显性基因 ,被定位于斯卑脱小麦的一个变种 T .spelta var.duhamel ianum 的 1B染色体
上 ,理论上可以认为提莫菲维小麦基因组中也存在这个基因或其等位形式拷贝 。我们设想 ,
从 Rf3基因的近等基因系中分离同 Rf3基因紧密连锁的分子标记 ,并以这个分子标记为探
针 ,从提莫菲维小麦基因组文库中寻找与 Rf3基因有同源关系的重叠的克隆片段(即 con-
tigs),研究 Rf3与提莫菲维小麦育性恢复基因之间的分子特征的异同 ,最后把这个基因分离
出来 。这无论对于雄性不育分子机理的探讨 ,还是在遗传育种操作方面都将具有重大意义。
我们利用质粒 pUC119载体 ,以大肠杆菌品系 E.coli DH5—α为受体菌 ,构建提莫菲
维小麦基因组文库 ,从中筛选重组克隆品系 ,并以斑点杂交对部分重组子的克隆片段在提莫
菲维小麦基因组中的拷贝数进行了初步鉴定 。对一些方法的细节做了讨论 。提莫菲维小麦
含有许多优良抗性基因。这个文库不仅可以被用来寻找雄性不育的育性恢复因子或其分子
标记 ,也可用于其它基因的分离或品系的鉴定工作 。由于这个基因组文库易于进行分子操
作 ,还可以用来进行 YAC文库的筛选和排序〔8〕 。
1.材料与方法
提莫菲维小麦(T .timopheevi)由黑龙江省农科院小麦所提供 。
质粒 pUC119和 E .col i DH5—α由本系遗传工程研究室和黑龙江省应用微生物研究
所惠赠。
主要试剂购自 Sigma、Promege、BRL 、ICN 等公司 ,限制性内切酶使用华美公司产品。
本实验所有程序均以 Sambrook et al.〔12〕为标准 ,基因组文库构建基本按照 Liu〔9〕的程
序进行 ,其中提莫菲维小麦基因组 DNA 提取参考 Bermatzky and Tanksley (1986)〔7〕;质粒
DNA的提取按碱法进行;酶切时将各 4μl的 Hind Ⅲ、Pst Ⅰ 、EcoR Ⅰ酶用 30μl缓冲液和
66μl水稀释成酶液 。20μ基因组和质粒 DNA 均用 10μl酶稀释液消化过夜 ,用微量琼脂糖
90 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
电泳检测酶切结果。线状质粒 DNA的去磷酸化 、感受态细胞的制备及载体与外源 DNA 的
连接参考曾际斌等〔4〕 ,连接设对照:(1)只有质粒载体(2)只有外源 DNA 片断(3)未去磷载
体+外源 DNA片断 。
转化(α互补检测)是在一事先准备好的含相应抗菌素的 LB琼脂平板上把 40μlχ-gal
贮存液(以 20mg/ml的浓度溶于二甲基甲酰胺中)和 4μl的 IPTG 溶液(浓度为 200mg/ml)
涂布于整个平板的表面 , 37℃保温直至所有的液体消失后 ,按下列程序进行:
1.取分装的感受态细胞 ,分别加入 50ng 的连接物(5μl)混匀 ,4℃存放 30min。
2.42℃热冲击 90s ,立即放冰浴中 1 —2min 。
3.加入 800μlLB培养基 ,37℃摇床温育 1h。
4.离心 ,去 800μl上清液 。
5.用一无菌的弯头玻棒轻轻将转化的细胞涂到琼脂平板表面。
6.将平板倒置于室温直至液体被吸收。
7.倒置平板 ,于 37℃培养 , 12—16h后可出现白色菌落即为重组子 。
注:设对照(1)(2)(3)分别为连接对照的转化 ,(4)未酶切质粒转化 ,(5)模拟转化
按下列步骤做重组子的电泳检测:随机挑取白色菌落 ,在含氨苄青霉素的平板上划线 ,
37℃培养过夜;分别挑取单菌落 ,接到 10ml含氨苄青霉素的液体培养基上 ,37℃摇床培养过
夜;分别提取质粒;琼脂糖电泳检测 ,出现带型滞后的质粒所在克隆即为重组子 。
斑点杂交使用北京军事科学医学院生产的光敏生物素核酸探针标记和检测试剂盒 ,按
说明的程序将提莫菲维小麦基因组 DNA标记为探针 、滤膜杂交并显色。
2.结　　果
在本实验第一阶段确立的 177个重组子中 ,EcoRⅠ酶切产生的重组子 4个 ,Hind Ⅲ 酶
切产生的重组子31个 ,Pst Ⅰ酶切产生的重组子142个。在随机选取的 18个重组子中进行
了斑点杂交 ,鉴定出 9个低拷贝数重组子 ,克隆的片段长度在 0.5-3.0kb 之间 。筛选工作
仍在继续进行之中。
3.讨　　论
构建小麦基因组文库一般使用核 DNA ,采用核 DNA提取方法〔14〕。我们的前期工作曾
用此法建库〔3〕 ,花费过高且不容易掌握 。考虑到细胞质 DNA 只是增加克隆筛选工作量 ,并
不影响文库的构建。利用总体 DNA替代核 DNA是基于实验条件所做的选择 ,这种选择也
见于其它人所作的工作〔7〕 。结构基因一般都存在于基因组的单拷贝顺序之中 ,构建以分离
基因为目的的基因组文库可以主要筛选单拷贝或低拷贝值顺序的克隆 ,这样使工作量大大
减少 。
外源 DNA片段的制备
我们提取的小麦总体 DNA经凝胶电泳检测 ,片段长度为 50kb 左右 ,没有 DNA大量降
解的情况 ,经岛津 UN-265紫外扫描结果可以看出吸收曲线是明显的 DNA紫外吸收曲线
特征 ,A260/A280=1.92。酶切后电泳图为一连续的长拖尾带 ,这是因为酶切产生了大小长度
不同的片段的结果。构建基因组文库要求克隆较长的 DNA片段 ,因此 ,操作过程中要避免
剧烈的振荡 ,防止机械剪切 。酶切要求 DNA样品具有较高的纯度 ,我们采用沉淀后再溶
911 期　　　　　　　　高东杰等:小麦 G —型细胞质雄性不育的育性恢复因子 Rf3 的研究
解 ,加蛋白酶 K ,然后再用酚/氯仿抽提的方法 ,不过多次抽提会增加机械剪切的机会 ,而且
会影响收率。
载体的制备
1.质粒 DNA 的提取　琼脂糖凝胶电泳检测为两条清晰的条带 。岛津 UV -265分光
光度计紫外扫描显示明显的紫外吸收特征。如果在第一步溶液 Ⅰ加入后 ,重悬菌体没有使
菌体完全分散 ,则会影响第二步的碱变性 ,使菌体没有破胞即被与沉淀一起弃掉 ,从而使收
率降低;如果在第二步碱变性时间不够长 ,会出现染色体 DNA 变性不够的情况 ,在下一步
的质粒复性过程中混入染色体 DNA ,电泳质粒带后可见一染色体带。操作过程(破胞后抽
提前)要保证在冰上进行 ,以免溶胞酶将自身 DNA降解 ,操作动作要轻 ,以免染色体 DNA
断裂污染样品。载体 DNA提取要纯净 ,以保证后面的酶切顺利 。
2.酶切　一般质粒提取电泳检测应为 2—3条带 ,包括超螺旋型 、线性质粒和有缺口的
环状质粒 ,迁移速率依次递减 。酶切不完全则带型复杂 ,甚至出现 4条带。本实验电泳检测
为单一均匀条带(见图 1),说明酶切彻底。我们进行酶切前做了预试验 ,并非酶加得越多酶
切越好 ,因酶制品中存在甘油 ,过多反而会抑制酶的活性。
　　1、2:经酶切的载体　
　　　3:重组子酶切:
图 1　4:未被酶切的载体:
　　　5:Markers
连接与转化:
连接效率只有通过转化实验才能反应出来 ,转化的阴性对
照(5)没有出菌落 , 说明转化是可信的。用未经酶切的
pUC119做阳性对照(4),计算转化效率大致为 1.2×104/μg 。
对照(1)有很少蓝色菌落出现 ,说明存在自身环化现象;对照
(2)无菌落出现;对照(3)与连接产物转化所得菌落数大体一
致 ,但蓝斑仅占 20%,相对的连接产物转化结果 ,蓝斑占 73%,
说明去磷酸化可以提高载体与外源 DNA 的连接效率 ,即重组
率。重组率的高低直接反应连接的成功与否。pUC119分别
经Pst Ⅰ 、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ单酶消化后产生粘性末端。两个相
同的粘性末端连接效率高 ,插入片段存在两个方向插入的可性
能 ,插入片段间可相互连接 ,导致载体中可能存在几个插入片
段。重组子的连接位点仍然为原酶切位点 ,载体自身环化机率
高。用磷酸酯酶去除线性载体 DNA两端的 5 磷酸 ,去磷酸化
的载体将不能自身环化 ,从而降低非重组子的假阳性背景 。
T 4DNA连接酶催化的共价连接 ,只能发生在未去磷酸的外源
DNA片段和去磷酸化的线性载体之间 ,产生的重组子虽有两个缺口但仍可转化细菌 ,通过
菌体内的修复系统使有缺口的环分子形成闭环分子。Pst Ⅰ 、Hind Ⅲ酶切后连接产物转化
所得菌落数基本一致 ,而 EcoR Ⅰ酶切后连接产物转化所得菌落数仅为前者的 20%,这可能
是由于 EcoR Ⅰ酶切所得连接片段较少的缘故 。要保证成功的连接反应应包含:①足量的
载体 DNA。对于如 pUC119一般大小的质粒 ,连接反应中含载体 DNA 应为 20—60μg/ml;
②末端浓度高于或稍高于载体 DNA的外源 DNA ,如果外源 DNA 浓度比载体低得多 ,有效
连接产物的数量会很低 ,这样就很难鉴别小部分携带重组质粒的转化菌落〔2〕 。转化率的高
低主要取决于感受态细胞的制备 。感受态细胞的制备与生长状态有很大关系 ,A660值一定
要保证在 0.4-0.6之间 ,这个状态下的细菌处于对数期 ,活性强 、感受性好 ,超出这个范围 ,
92 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
转化率将大大降低。离心机的温度要保证在 0-4℃,常温离心机容易改变菌体温度 ,使转
化率降低 ,用直接储存于-70℃冰冻培养基中的贮存原种接种而培养的细菌 ,所得到的转化
率最高 ,使用在实验室中连续传代 ,贮存于 4℃或贮存于室温的培养物 ,转化率极低。
重组子的鉴定:
α互补检测:
图 2
蓝白斑反应明显(见图2),去磷载体连接物转化菌落有
73%是白色的。转化的菌落生长 16—20h即应该用于分离
或于 4℃保存 ,如果时间过长 ,则会因转化生长使周围的氨
苄青霉素浓度降低 ,从而空白菌复苏 ,长出卫星菌落。挑取
白色菌落 ,在含相应抗菌素的培养基上扩大培养。带有 β-
半乳糖苷酶活性蛋白的菌落 ,其中间为淡蓝色 ,外周为深蓝
色。白色菌落偶而也在中央出现一个淡蓝色斑点。酶切后
未去磷的载体连接物转化菌落数是去磷载体连接产物转化
菌落的 5倍 ,然而白色菌落寥寥无几 ,这说明载体的自身环
化不仅增大筛选背景而且影响连接。因为载体经酶切后 ,
可能被切去两对碱基后再接上 ,产生白色菌落。因此 ,是白
色菌落未必就是重组子 ,尚须进一步检测。
电泳检测:
提取的质粒由于连接了不同长度的外源 DNA 片段 ,经
图 3
琼脂糖凝胶电泳检测 ,电泳图上看到前后不同的条带(图 3),保存有滞后条带质粒所在菌
种。连接片段为 500bp-3kb之间 ,过小的片段连接后与非重组子几乎看不出距离上的差
异。由电泳图谱鉴定的白斑菌落中 60%细菌为重组子 ,如此重组率为 73%×60%=43.
8%。
电泳要求制备的凝胶要均匀 ,电泳槽要平 ,以保证场强一致 ,使 DNA 带距离上的差异
即表现为分子量的差异。
酶切检测:
用相应酶切重组质粒 ,可见载体带前方有一条带 ,为外源 DNA 带(图 1)
斑点杂交:
随机取三种酶切所得的重组子进行斑点杂交 ,固相为各重组质粒 ,阳性对照为提莫菲维
小麦基因组 DNA ,阴性对照为 pUC119 的 DNA。探针为提莫菲维小麦基因组 DNA。除阴
931 期　　　　　　　　高东杰等:小麦 G —型细胞质雄性不育的育性恢复因子 Rf3 的研究
性对照外 ,全部杂交都出现印迹(图 4)。
图 4
克隆编号
OD260
C(μg/μl)
TH001
0.0612
1.20
TH002
0.0234
0.47
TH003
0.0311
0.62
TH004
0.0649
1.30
TH006
0.0325
0.64
TH007
0.0563
1.13
克隆编号
OD260
C(μg/μl)
TH008
0.0655
1.31
TH009
0.0528
1.05
TH010
0.0468
0.93
TP011
0.0585
1.17
TP012
00745
1.49
TP013
0.0308
0.62
克隆编号
OD260
C(μg/μl)
TP014
0.0617
1.23
TP015
0.0708
1.42
TP016
0.0532
1.06
TP018
0.0350
0.70
TE019
0.0924
1.85
TP020
0.0333
0.67
上表为各克隆提取样稀释了 400倍的光吸收值(OD260)及它们各自的 DNA 浓度(C), T
表示外源 DNA 为提莫菲维小麦 ,H 表示由Hind Ⅲ酶切所得克隆 ,P 表示由Pst Ⅰ 酶切产生
的克隆 ,E表示由 EcoR Ⅰ酶切产生的克隆 ,杂交时各点样 1μl ,参照 DNA 浓度和杂交印迹
的深浅将各克隆分组如下:
TH001　TH002　TH003　TH008　TH010　颜色相对深一些;
TH007　TP012　TP014　TP015　TE019　颜色适中;
TH004　TH006　TH009　TP011　TP013　TP017　TP018　TE020　颜色相对较
浅。
推测拷贝数第一组明显地高于第二组 ,第三组 ,然而并不一定准确 ,因为拷贝数还跟质
粒的分子量有关 。进一步鉴定拷贝数 ,将重组质粒 DNA梯度点样 ,定量提莫菲维小麦基因
组DNA做为对照 ,相同的质粒 DNA做为探针 ,杂交强度一致的斑点 ,杂交上的探针量是一
定的 。根据质粒的点样量 、分子量 ,和对照的点样量 、分子量 ,可以计算出所克隆片段的在基
因组中的拷贝数 。本次所做的杂交梯度小 ,每个仅为前一个的 1/5 ,杂交强度都大于对照。
考虑应该扩大梯度 ,降低起始浓度。斑点杂交背景较深 ,这是由尼龙膜本身的特点所决定
的。加大封闭量以最大限度地降低非特异性吸附 。用之做斑点杂交探针的 DNA ,则可以不
必考虑机械剪切 ,而只要求其纯度 ,被标记的核酸愈纯愈好 ,因所含杂质如 RNA 、蛋白质等
均可被标记 ,引起本底升高或假阳性。本文在提取总体 DNA作探针时加了两步酶消化 ,正
是考虑这一点。被标记的核酸应溶于灭菌注射用水或 0.1M 的 EDTA中 ,不宜使用 Tris ,因
94 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
后者带伯胺基 ,将被标记 ,消耗试剂 。限于条件 ,各克隆没有测分子量 ,因此对拷贝数未能做
出准确估计。下一步如果利用 RAPD 和近等基因系结合找到连锁标记 ,再与各克隆 DNA
进行斑点杂交来筛选 ,则可以省去鉴定拷贝数这一工作 。
本系 91级本科学生刘涛 、姜艳玲参加部分实验 ,中心实验室王好友讲师 、邢怡同志给予
大力支持 ,一并感谢 。
参　　考　　文　　献
1.陈章良.植物基因工程研究.北京:北京大学出版社 , 1993
2.黄翠芬.遗传工程理论与方法.北京:科学出版社 , 1987
3.王同昌 ,李文辉 ,李集临.G 型胞质不育的育性恢复基因 Rf3 的研究 1 , 构建提摩菲维小麦基因组文库.南京:植物遗
传学及应用学术研讨会文集 , 1994 , 575
4.曾际斌 ,石育原.一种简易的制备感受态大肠杆菌细胞的新技术.白求恩医科大学学报 , 1993 , 19(3)
5.Albertsen HM , Abderrahim H , Cann H , Danssel J , Le Paslier D , Cohen D , 1990.Construct ion and characteration of a
yeast artif icial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,
87(11):4256-4260.
6.Bennetzen JL and Jones JDG , 1992.Approaches and progress in the molecular cloning of plant disease resistance genes.in
Genetic Engineering Principles and M ethods(Jane K.Setlow , ed.), Vol.14 , pp.99-124.Plenum Press , New York
7.Bernatzky R and Tanksley SD , 1986 , Genet ics of actin related squences in tomato.Theor.Appl.Genet , 72(3):314
8.Coulson A , Waterston R , Jane Kiff J , Sulston J and Kohara Y , 1988.Genome linking w ith art ificial chromosomes.Nature
335(8):184-186
9.Liu yao-guang 1990.Restrict ion f ragment length polymophism (RFLP)analysis in w heat.I Genomic DNA library con-
st ruction and RFLP analysis in common w heat.Japanese Jou ral of Genetics , Vol.65(5):367-380
10.Martin GB , Williams JGK , and Tanksley SD , 1991.Rapid identi fication of markers linked to a Pseudomonas resistance
gene in tomato by using random primers in near-isogenic lines.Proc.Nat l.Acad.Sci.USA , vol.88:2336-2340
11.Muehlbauer GJ , Spech t JE , Thomas-compton MA , S tasw ick PE , and Bernard RL , 1988.Near lsogenic Lines-a poten-
t ial resource in the lntegrat ion of Convent ional and molecular marker linkage maps C rop S ci.28:729-735
12.Sambrook J , Fritsch EF and Maniatis T:Molecular C loning -a laboratory manual(Second edit ion), Cold S pring Harbor
Labortory Press , 1989
13.Wallace M R , Marchuk DA , Andersen LB, Letcher R , Odeh HM , Saulino AM , Fountain JW , Brereton A , Nicholson J ,
MitchellAL , Brow nstein BH and Collins FS , 1990.Type 1 neurrof ibromatosis gene:ident ification of a large t ranscript dis-
rupted in th ree NF 1 patients.S cience , 249 , 181-186
14.Watson JC and Thompson WF , 1986.Purification and rest riction endonuclease analysis of plant nuclear DNA , in Methods
in Enzymology , 118:57-75
951 期　　　　　　　　高东杰等:小麦 G —型细胞质雄性不育的育性恢复因子 Rf3 的研究