全 文 ：第 24 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　7 月
Vol.24　No.3　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July 　2004
基金项目:上海农业科技攻关重点项目(农科攻 1—4),江苏省高技术项目(BG99501—4),南京农业大学 SRT 项目(0303B04)
第一作者简介:黄浩(1977—),硕士 ,主要从事蔬菜作物遗传育种研究。
＊通讯作者　E-mail:nauliulw@njau.edu.cn
收稿日期:2004-01-07
萝卜 CMS 不育系与保持系小孢子发生的细胞学研究
黄　浩1 , 2　柳李旺2＊　陈崇顺1　龚义勤2　宋贤勇2　韦开余2
(1.南京师范大学生命科学学院 , 南京　210097)
(2.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,南京农业大学园艺学院 , 南京　210095)
摘　要　研究了萝卜胞质雄性不育系 A2 、A4及其相应保持系 B2 、B4 的小孢子发生与花药壁发育
的细胞学特征。结果表明 ,不育系 A2 的绒毡层细胞在四分体时期出现异常 ,小液泡增多 ,至单核
期汇合形成大液泡 ,绒毡层细胞异常膨大;小孢子外壁染色浅 ,细胞壁受到破坏 ,最后与绒毡层一
同降解。不育系 A4在减数分裂期即表现出异常 ,绒毡层异常肥大;花药发育后期 ,小孢子外壁亦
染色较浅;绒毡层细胞融合形成细胞团块侵入药室挤压小孢子 ,两者一同降解。
关键词　萝卜;胞质雄性不育;小孢子发生;细胞形态学
Cytological investigation on microsporogenesis of cytoplasmic
male sterility in radish (Raphanus sativus L.)
HUANG Hao
1 ,2　L IU Li-Wang 2＊　CHEN Chong-Shun1　GONG Yi-Qin2　SONG Xian-Yong 2　WEI Kai-Yu2
(1.College of Life science , Nanjing Normal University , Nanjing　210097)
(2.National Key Laborato ry of Crop Genetics and Germplasm Enhancement , College of Ho rticulture,
Nanjing Ag riculture University , Nanjing　210095)
Abstract　The cy tology of the microsporogenesis and development of anther wall of cytoplasmic male sterile
(CMS)lines A2 , A4 and its maintainer lines B2 , B4 was studied.The results revealed that the tapetal cells of
the male sterile line A2 developed abnormally at tetrad stage , and they became vacuolated and numerous small
vacuoles are present;furthermore , the small vacuoles fused into large ones.Exine of microspore was light
stained , and cell wall w as destructed.Finally with degeneration of the tapetal cells , the pollen aborted.The
tapetal cells of CMS line A4 enlarged abnormally at meiotic phase , pressing microsporocyte seriously.Lately ,
light-staining exine of microspore could not be observed , and tapetal cells fused to form big lump invading the
loculi , and finally leading to pollen grain abortion.
Key words　Raphanus sat ivus;cy toplasmic male sterility;microsporogenesis;cy tomorphology
雄性不育性是蔬菜作物杂种优势利用的重要
手段 。雄性不育花药败育时期和方式多样 ,从造孢
细胞到三核花粉的各个时期都可发生 ,同一品系败
育特征既可出现在一个时期 ,也可出现在相邻两个
时期或多个时期;多数学者把花粉败育归因于花药
组织的异常发育 ,如绒毡层异常等[ 1] 。
萝卜是一种原产于我国的重要世界性蔬菜 ,其
杂种优势明显[ 2] 。自 Ogura不育胞质发现以来 ,国
内外对其不育性进行了较深入研究[ 3 ,4] 。萝卜不
育类型较多 ,败育细胞学特征是揭示 CMS 机理和
不育胞质分类的重要依据。目前对萝卜 CMS 不
同材料花药败育的细胞形态学特征进行了相关研
究 [ 5～ 7],但由于萝卜雄性不育遗传机制复杂性以及所
用材料差异 ,研究结果不完全一致 。
本文以新近培育的萝卜胞质雄性不育系 A2 、
A4及其相应保持系 B2 、B4 为材料 ,对其花药形态
和小孢子发生的细胞结构变化等细胞学特征进行
研究 ,为进一步阐明萝卜胞质雄性不育败育的机理
提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为南京农业大学园艺学院萝卜遗传
育种研究室选育的萝卜胞质雄性不育系 A2 、A4 及
其相应的保持系 B2 、B4 。
1.2　方法
在萝卜盛花期 ,取不育系和保持系各不同发育
时期的花序作为花药发育的研究材料。在卡诺氏
固定液中抽气 、固定 , FAA 固定液保存。材料经各
级乙醇脱水 ,石蜡包埋和切片(蜡带厚度 6 μm)后 ,
用铁钒—苏木精染色 ,固绿复染 ,中性树胶封片 ,制
成永久切片[ 8] 。在 OLYMPUS —BH2显微镜下观
察花药在不同发育时期的细胞形态学特征 ,并拍
照。
2　结果与分析
2.1　保持系的小孢子发生
萝卜保持系 B2 和 B4 的发育形态学特征基本
相似 。雄蕊原基顶端经细胞分裂 、分化产生四棱状
的花药 ,随后在四个棱角处的表皮细胞内侧分化出
孢原细胞 ,后者经有丝分裂形成周原细胞和造孢细
胞 ,以后周原细胞再进行平周分裂和垂周分裂 ,花
粉囊壁建成。其四层结构自外向内依次为表皮 、药
室内壁 、中层 、绒毡层;同时造孢细胞也进行分裂形
成小孢子母细胞 ,位于药室中(图版 Ⅰ:1)。进入减
数分裂期后 ,绒毡层细胞排列整齐 ,中层呈窄带状
并开始解体;小孢子母细胞陆续进入减数分裂期 。
造孢细胞所分泌的胼胝质逐渐积累 ,包围花粉母细
胞(图版Ⅰ :2)。减数分裂结束 ,四分体形成 ,包围
在胼胝质中;中层只剩下残痕;绒毡层原位排列规
则 ,此时绒毡层细胞生长增大 ,细胞质液泡化程度
高 ,并有大的液泡形成 (图版 Ⅰ:3)。胼胝质壁解
体后 ,小孢子释放出来。小孢子外壁染色浅 ,绒毡
层呈矩形原位排列 ,开始萎缩(图版 Ⅰ:4)。至单核
晚期绒毡层细胞边缘模糊 ,表明绒毡层已开始解
体 ,小孢子液泡化(图版Ⅰ :5 , 8)。小孢子进入有丝
分裂期 ,绒毡层细胞原位降解 ,有的只剩下轮廓或
残迹 ,药室内壁开始增厚;小孢子形态各异 ,有的已
开始进行有丝分裂 ,有的仍呈圆形 ,并可见胞质中
存有液泡和细胞核 (图版Ⅰ :6 , 7)。
2.2　胞质不育系 A2 小孢子发生细胞学
从造孢细胞发生到小孢子母细胞开始进行减
数分裂这期间 ,不育系与保持花药发育特征相似 ,
如花粉囊壁分化形成 ,小孢子母细胞产生 ,进而进
入减数分裂 ,中层被挤压解体 ,绒毡层细胞液泡化 ,
花药明显变大等(图版 Ⅱ:9 , 10);可是到了四分体
时期 ,两者之间发育开始出现差异 ,尤其是在绒毡
层的发育行为方面。此时与保持系绒毡层细胞内
表现出小液泡增多并有大液泡的现象不同 ,不育系
A2 绒毡层细胞径向伸长 ,胞质中小液泡增多 ,但不
融合形成大的液泡 ,绒毡层体积几乎无变化 ,呈柱
形 ,细胞间间隙大(图版 Ⅱ:11)。进入单核花粉期 ,
小孢子释放出来 ,不育系小孢子外壁染色较浅;绒
毡层细胞体积增大 ,细胞质内形成大的液泡 ,胞质
部分染色较深;相邻小孢子相互粘连 ,有的则与绒
毡层细胞粘在一起 ,细胞质收缩 ,有液泡出现(图版
Ⅱ:12)。此后 ,不育系与保持系的花药和小孢子发
育行为表现差别更为突出 ,不育系花药败育特征表
现更为显著 ,绒毡层细胞异常膨大 ,细胞破裂胞质
侵入药室(图版Ⅱ:13 ,14);有的花药绒毡层异常肥
大 ,细胞彼此粘连难以分清界限 ,形成大的细胞团
块侵入药室 ,占据药室的大部分空间;随后小孢子
粘连在一起 ,胞质进一步收缩且染色深 ,形状不规
则 ,已开始降解(图版 Ⅱ:15 , 16)。随着花药的发
育 ,药室内层生长增厚 ,异常绒毡层已完全降解只
剩下轮廓;小孢子与侵入药室的绒毡层残留物混在
一起 ,外部形态已分辨不清 ,并最终降解 ,成为干瘪
药室 (图版 Ⅲ:17 ～ 21)。
2.3　不育系 A4 小孢子发生细胞学
不育系 A4 植株的花药在减数分裂期已出现
异常 。此时绒毡层细胞体积明显比保持系大 ,呈柱
形且排列紧密 ,伸向药室 ,细胞边缘模糊似已降解 ,
有的已融合一起 ,可见双核 ,并有液泡出现;小孢子
母细胞正在进行减数分裂 ,染色体清晰可见(图版
Ⅲ:22)。花粉母细胞完成减数分裂 ,四分体小孢子
形成 ,细胞核清晰 ,胞质着色浅 ,绒毡层细胞进一步
融合 、异常膨大 ,径向壁模糊 (图版 Ⅲ:23)。至单
核早期 ,绒毡层细胞融合形成大的团块 ,胞质模糊
不清 ,颜色变淡(图版Ⅲ:24);有的花药囊壁的绒毡
层细胞液泡化 ,小孢子胞质收缩 ,但仍可见细胞核
306 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
(图版Ⅳ:25)。在单核晚期 ,花药绒毡层细胞内液
泡增多并融合形成大的液泡 ,细胞异常膨大 、破裂;
小孢子内仍可见到核存在 ,细胞质不浓厚 ,小孢子
外壁染色浅 ,此时小孢子之间则互相粘连(图版Ⅳ:
26)。随着花药的发育 ,绒毡层进一步膨大 、降解 ,
侵入药室挤压小孢子 ,小孢子最终败育(图版Ⅳ:
27 ,28)。
3　讨论
生殖组织及花粉囊壁尤其是绒毡层与正在生
长发育的小孢子之间的同步协调发育是必要
的[ 9 ,10] 。在萝卜保持系中绒毡层具有很高的代谢
活性 ,各期形态表现不一 ,其中包括绒毡层的降解
过程[ 5～ 7 ,11] 。许多研究表明 , 不育系多在四分体
时期出现异常 ,通常表现为绒毡层异常肥大以及小
孢子降解。本文发现不育系 A4 绒毡层在减数分
裂期即出现异常 ,不育系 A2 则发生在四分体时
期 ,随之小孢子在单核早期出现败育迹象 ,这与以
前部分研究结果类似[ 3] 。可以认为 ,绒毡层异常
是花粉败育的细胞学原因 。有研究表明 ,花粉外壁
是由绒毡层和小孢子两者分泌的孢粉素沉淀而
成[ 9] 。本研究发现胞质不育系 A2 、A4 花药中小孢
子外壁染色较浅 , 推测可能与其发育受到抑制有
关;而且绒毡层较早出现异常 ,可能是因其异常肥
大 ,内耗增多 ,致使孢粉素沉淀量减少的缘故 。
药壁组织特别是绒毡层异常会导致雄性不育 ,
但不育最根本原因是细胞核和细胞质的不协调而
导致小孢子败育 ,而且败育程度 、方式和时期会随
着两者之间的协调性程度变化而不同。如菜薹不
育系中孢原细胞分化期前不形成花粉囊 ,以及随后
各典型时期都有败育现象出现 ,这可能与菜薹是由
异源胞质直接转育而来有关[ 12] 。本文所用不育系
A2 、A4也是从其他萝卜不育系中将不育胞质进行
转育而成 ,核背景不同 ,所以两者败育时期和方式
也有所不同 ,如不育系 A2 较保持系绒毡层在四分
体时期即表现异常 、而不育系 A4 在减数分裂期绒
毡层提前降解。但败育方式也有一定的相似性 。
研究发现 ,具有相同来源不育胞质的作物不仅在绒
毡层行为表现 ,还是在小孢子败育的时期和方式等
方面都具有相似性[ 7 ,13～ 15] , 故其异常行为表现也
可作为推测不育胞质来源的重要依据。不育系 A2
绒毡层异常出现在四分体时期 ,败育方式与来源于
ogura胞质不育源表现相似 ,故其胞质类型可能类
似于 ogura不育胞质。
致谢　试验与论文撰写过程中 ,得到王庆亚博士热情
指导 ,特此致谢!
参　考　文　献
1.Kaul M L.Male sterility in higher plants.Monog raph on
Theor Appl Genet , Springer-verlag.Berlin.1988 , 10:22 ～
25
2.汪隆植 ,柳李旺 , 龚义勤 ,等.萝卜优质高效四季栽培.北
京:科学技术文献出版社 , 2001.5 ～ 7
3.龚义勤 , 汪隆植 , 柳李旺 , 等.萝卜细胞质雄性不育
(CMS)研究概况.中国蔬菜 , 1999 , 6:48～ 50
4.Terachi T , Yamaguchi K , Yamagishi H.Sequence analysis
on the mitochondrial orfB lo cus in no rmal and ogura male-
sterile cytoplasms from wild and cultiv ated radishes.Cur-
rent-Genetics , 2001 , 40:(4)276 ～ 281
5.陈懋琳 , 汪隆植.萝卜小孢子发生和雄配子体发育的细
胞形态学观察.南京农业大学学报 , 1988 , 11(3):14 ～ 19
6.粟翼玟 ,赵双宜 , 张燕君 , 等.萝卜雄性不育系小孢子发
生的细胞形态学研究.园艺学报 , 1995 , 22(4):348～ 352
7.董庆华 ,利容千 , 王建波 , 等.萝卜雄性不育系花药发育
的细胞形态学研究.武汉大学学报(自然科学版), 1996 ,
42(2):207 ～ 212
8.李正理.植物制片技术.北京:科学出版社 , 1987.138 ～
149
9.Engelke T ,Hulsmamm S , Tatliog lu T.A comparative study
of microsporogenesis and anther w all development in differ-
ent types genic and cy toplasmic male sterilities in chives.
Plant Breeding , 2002 , 121:254 ～ 258
10.Goldberg R B , Beales T P , Sanders P M.Anther develop-
ment:basic principles and practical applications.Plant Cell ,
1993 , 5:1217 ～ 1229
11.徐汉卿.植物学.北京:中国农业出版社 , 1996.176 ～
182
12.董庆华 , 利容千 , 王建波.菜薹细胞质不育系小孢子发
生的细胞形态学研究.园艺学报 , 1997 , 24(2):150～ 154
13.Ogura H M.Study on the new male-sterility in Japanese
radish , with special reference to the utilization of this steril-
ity towards the practical raising of hybrid seeds.Mem Fdc
Agric , 1968 , 6:39 ～ 78
14.Singh V P , Kobabe G.Cy to-morphological investigations
on male-sterility in Allium schoenoprasum L.Indian.J
Genet Plant Breed , 1969 , 29:241 ～ 262
15.Ho lford P , Croft J H , Newbury H J.Structural studies of
micro sporogenesis in fer tile and male-sterile onions(Allium
cepa L.)containing the cms-S cy toplasm.Theor Appl
Genet , 1991 , 82 , 745～ 755
图　版　说　明
Explanation of plates
图版Ⅰ 　1～ 8;图版Ⅱ　9 ～ 16;图版Ⅲ　17～ 24;图版Ⅳ
3073 期　　　　　　　　　　　黄浩等:萝卜 CMS 不育系与保持系小孢子发生的细胞学研究
　25 ～ 28
1～ 7:示保持系 B2的小孢子发育和绒毡层生长过程
1.药室形成 ,可分辨四层花药壁结构(×380);2.减数分
裂期 , 绒毡层细胞液泡化 , 可见胼胝质壁 , mMC 位于其中
(×380);3.四分体时期 , 绒毡层液泡化程度高 , 小孢子可
见核(如箭头示)(×380);4.单核早期 , 小孢子外壁正在
形成 , 绒毡层降解 (×380);5.单核晚期 , 小孢子液泡化
(如箭头示),绒毡层细胞质着色浅(×400);6 , 7.绒毡层进
一步降解 , 药室内壁增厚(如箭头示), 花粉逐渐成熟(×
390 , ×390);8.保持系 B4 花药发育中绒毡层液泡化 , 并已
经降解 ,小孢子液泡化(×380);
9～ 21.示不育系 A2 的小孢子败育过程;9 , 10.减数分
裂期 ,绒毡层细胞质稀薄 , 细胞呈柱形排列(×380 , 380);
11.四分体时期 ,绒毡层小液泡增多(如箭头示)(×360),
小孢子染色浅;12.单核早期 , 绒毡层液泡化程度高(如箭
头示),小孢子细胞质收缩 , 粘连(×360);13 , 14 绒毡层进
一步异常膨胀 , 小孢子细胞壁染色浅(×340 , ×340);15 ,
16 绒毡层融合形成大的团块(如箭头示), 小孢子胞质进一
步收缩(×380 , ×380);17 ～ 21.绒毡层降解 , 药室萎缩 , 与
小孢子混合在一起降解为干瘪药室(如箭头示)(×340 , ×
340 , ×360 , ×360 , ×200);
22～ 28.示不育系 A4 小孢子败育过程;22.减数分裂
期 ,绒毡层细胞呈柱形排列 , 细胞质色浅(×320);23.四分
体形成 , 绒毡层细胞融合 , 胞质部分模糊;小孢子仍可见核
区(×320);24.单核早期 , 绒毡层细胞进一步融合形成团
块(如箭头示),小孢子染色浅 , 仍可见核区(×340);
25 , 26.绒毡层细胞液泡化(如箭头示), 小孢子细胞质
收缩(×360 , ×360);27 ～ 28.绒毡层异常膨胀 , 细胞质降
解;小孢子降解并粘成一团(如箭头示)(×400 , ×400)
PlateⅠ 　1 ～ 8;PlateⅡ　9～ 16;PlateⅢ　17 ～ 24;PlateⅣ
　25 ～ 28
1 ～ 7.Microspo ro genesis and tapetal development in
maintainer line B2
1.Four single cell layers of microsporang ium (×380);2.
Vacuolization and enlargement tapetal cells and microspore
mother cells confined in callose walls during meio tic stage(×
380);3.High vacuolization tapetum and microspore with nu-
cleus (arrow head)during tetrad stage(×380);4.Fo rmation
of microspore exine just released from tetrads;degeneration of
Tapetum (×380);5.Vacuolization of microspore (ar row
head) and light-staining tapetal cells just befo re mitosis (×
400);6 ～ 7.Fur ther degeneration of Tapetum , thickening of
endo thecium(arrowhead) and Pollen g radually ripening (×
390 , ×390);8.Degeneration vacuolated tapetum and vac-
uolization of microspo res in maintainer line B4(×380);
9 ～ 21.Microspo rogenesis in CMS line A2;9 , 10.
Tapetal cells arraying pole-likely with thinner cy toplasm dur-
ing meiotic stage(×380 , 380);11.Tapetal cells with more
little vacuoles(arrow head)and light-staining micro spores dur-
ing tetrad stage(×360);12.Tapetum vacuolating heavily(ar-
rowhead)and micro spores sticking to each o ther w ith shrink-
ing cy toplasm during mono-nuclear early-stag e(×360);13 ,
14.Tapetum further enlarging abnormally and light-staining
cell w alls of microspores(×340 , ×340);15 , 16.Tapetal cells
fusing to form big lump(arrow head);microspores stained
heavily w ith shrinking cy toplasm(×380 , ×380);17 ～ 21.
Degeneration tapetum and microspores and collapsed locules
(arrow heads)(×340 , ×340 , ×360 , ×360 , ×200);
22 ～ 28.Microsporogenesis and tapetal development in
CMS line A 4;22.Dinucleate tapetal cells arraying pole-likely
and stained light during meio tic stage(×320);23.Fo rmation
of tetrads;tapetal cells fusing w ith indistinct cy toplasm (ar-
rowhead);clear nuclear zones of microspores (×320);24.
Tapetal cells fusing to form big lump(arrow heae) and light
staining micro spores(×340);
25 , 26.Vacuolization tapetal cells and shrinking of mi-
crospore cy toplasm (×360 , ×360);27 , 28.Tapetum enlarg-
ing abnormally;cy toplasm of tape tal cells degenerated;mi-
crospores degenerating into a mass (arrow heads)(×400 , ×
400)
308 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷