全 文 ：第 21 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001 年　10 月
Vol.21　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2001
Zn诱导的菹草叶抗氧化酶活性的变化和超微结构损伤
徐勤松　施国新　杜开和　郝怀庆
(南京师范大学生命科学学院 , 南京　210097)
摘　要　本文以培养在不同浓度梯度 Zn 溶液中的菹草为材料 ,研究 Zn对植物的影响 。培养第 5
天 ,测定叶内抗氧化酶系统活性等指标的变化 ,并用透射电镜观察对细胞超微结构的损伤。结果
表明:低浓度(<20mg/L)在短期内(5d)未对菹草产生影响 ,各生理指标呈上升趋势。当培养浓度
为 50mg/L 时 SOD和 CAT 活性达到峰值 ,而其他指标则下降:其中 POD 活性和叶绿素含量高于
对照 ,而可溶性蛋白含量则比对照低 。100mg/L 培养浓度各指标均明显降低 。同时电镜观察发
现过量Zn损伤了细胞的超微结构。当培养浓度大于 50mg/ L 时 ,叶绿体被膜断裂 ,叶绿体解体 。
线粒体脊突膨大 ,线粒体空泡化。细胞核核膜断裂 ,核仁散开。这说明过量Zn削弱了细胞抗氧化
酶的活性 ,同时对细胞超微结构产生致死性损伤 ,从而导致细胞死亡 。
关键词　Zn;菹草;抗氧化酶;超微结构;损伤
ANTIXIDANT ENZYMES ACTIVITY CHANGES AND
ULTRASTRUCTURAL DAMAGE WERE CAUSED BY ZINC IN
POTAMOGETON CRISPUS LINN .LEAVES
XU Qin-song SHI Guo-xin DU Kai-he HAO Huai-qing
(College of life sciences , Nanjing Normal University , Nanjing 210097)
Abstract　Potamogeton crispus Linn.was cult ivated in solut ion w ith different Z inc gradient concen-
tration fo r 5 days for studying the effect of Zn excess on plants.Changes of SOD , POD , CAT and
o ther indicato rs were analyzed and ultra structural damage w as observed using elect ron microscope.
The conclusion show ed that:None toxic ef fect was caused by low Zn concentration(<20mg/L), all
in indicato rs had an increment tendency.Activity of SOD and CAT reached maximum at 50mg/ L ,
while the other four indicators decreased , but activity of POD and chlorophyll content remain higher
than that of the control , soluble protein content w as low er than that of the control.All indicators de-
creased obviously at 100mg/L.Meanwhile ultra structural damage w as caused by on excess of Zn.
Such as disrupted chloroplast membrane , disintegration of chloroplasts;sw elling of cristae of mito-
chondria and vesiculat ion of mitochondria at last;disrupted nuclear membrane , break of nucleolus into
several small nucleoli and eventually cell death.So we could come to the conclusion that serious injury
was caused by on excess of Zn.
Key words　Zinc;potamogeton crispus Linn.;antioxidant enzyme;ult ra structure;damage
＊第一作者简介:徐勤松(1976—),男 ,在读博士 ,主要研究重金属污染水对水生高等维管束植物的毒害影响。
国家自然科学基金(39770046)和江苏省教育厅自然科学基金资助。
收稿日期:2001-07-01
　　Zn是植物正常发育所必需的微量元素[ 1] 。是
植物激素 IAA的重要原料 ,缺乏时植物体的吲哚乙
酸含量会降低 ,植物矮小。同时缺 Zn 还会阻碍叶
绿体的发育 ,并使植物出现明显的小叶病症状[ 2] 。
因此 , Zn 在植物中具有重要作用。然而 ,铅锌矿的
开采等使环境中的 Zn 元素超过植物正常生长的需
要。尽管 Zn的毒性远弱于Hg ,Cd ,As等重金属(毒
性系数:Hg=Cd=40 ,As=10 ,Zn=1)[ 3] ,但过量Zn
仍会对环境造成污染并影响植物细胞的结构和功
能 ,从而对植物产生毒害[ 4] 。目前关于 Zn对植物
的影响的研究多集中在对陆生植物生理生化的影
响[ 5] 。对水生植物 ,尤其是水生维管束植物缺乏系
统报道 。鉴于此 ,我们以全国分布广泛的沉水植物
-菹草为材料 ,从对叶抗氧化酶系统的影响和细胞
超微结构损伤两个方面 ,更系统的研究 Zn 对植物
的毒害影响 。同时 ,本实验还设了较高的培养浓度
(100mg/L),旨在研究Zn对植物最大可能程度的伤
害情况。
1　材料与方法
1.1　实验材料
菹草采自江苏省高邮湖和南京师范大学生命科
学学院水生植物培育池。在实验室中用蒸馏水洗
净 ,置于盛有蒸馏水的玻璃缸中驯化培养 7d。选取
生长状态一致的植株作为实验材料 。
1.2　实验方法
1.2.1　材料处理
在各玻璃缸中一次性施入 ZnSO4.7H2O , 使培
养液中 Zn2+(以纯 Zn2+计)的浓度梯度为 5mg/ L 、
20mg/L 、50mg/L 、100mg/L ,另设对照为 0 。培养第
5天 ,取相同部位的叶片 ,蒸馏水洗净 ,测定生理指
标 ,并取材观察超微结构的变化。
1.2.2　实验方法
1.2.2.1　叶绿素含量测定:分光光度法[ 6] ;
1.2.2.2 SOD 、POD 、CAT 和可溶性蛋白含量的测
定:
取材于预冷的研钵中 ,加入 0.05M/ L 的磷酸缓
冲液(pH7.8), 冰浴 , 研磨 , 10000rpm , 低速离心
20min ,取其上清液。SOD 、CAT 活性用一般分光光
度法测定 ,分别按从南京建成生物工程研究所购买
的试剂盒的顺序进行;POD活性按愈创木酚法[ 6]测
定;可溶性蛋白含量测定用考玛斯亮蓝染色法[ 7] 。
每组设 3个重复 。
1.2.2.3　叶细胞超微结构观察
处理第 5天上午 ,取相同部位的叶 ,用 2.5%戊
二醛和 2%锇酸双重固定 ,丙酮系列脱水 , Epon812
包埋 , LKB超薄切片机切片 ,切片经醋酸双氧铀 —
柠檬酸铅双重染色后 ,于 Hitachi-A-2 型透射电
镜下观察并拍照。
2　结果与分析
2.1　Zn对菹草 SOD活性的影响
从图 1看出 ,当处理浓度小于 50mg/L 时 ,SOD
活性随处理浓度的增加呈上升趋势 ,并在 50mg/L
浓度处理下出现抗性峰 ,比对照增加了 33.98%。
当浓度达到 100mg/L 时 ,酶活性降低 ,比对照降低
了10.60%,说明此时体内产生的 O2-·超过了它的
正常歧化能力 ,从而致使其活性下降。
2.2　Zn对菹草 POD活性的影响
在 0 ～ 20mg/ L 浓度时 ,POD活性呈上升趋势 ,
并在 20mg/ L浓度下达到最大 ,活性比对照上升了
144.40%。当浓度继续增大后 ,酶活性开始下降 ,
50mg/L 处理浓度的酶活性仍高于对照。当浓度为
100mg/L 时酶活性比对照减少了 20.57%(图 2)。
图 1　Zn对菹草 SOD活性的影响
Fig.1 Effect of Zn on activity of SOD
2.3　Zn对菹草 CAT 活性的影响
各处理浓度下 Zn 都诱导 CAT 活性增加 ,其中
50mg/L 处理浓度时活性最高 ,其后 ,随处理浓度的
增加而减弱 。但各处理浓度的酶活性都远大于对
照。这说明过量Zn对 CAT 活性在各浓度处理下并
没产生不利影响。表明在一定浓度范围内 CAT 对
Zn有较强的耐受性(图 3)。
2.4　Zn对菹草叶绿素含量的影响
5mg/L浓度下叶绿素含量最大 ,其后随处理浓
度的增大含量降低。在 10-50mg/L 浓度仍高于对
照 ,而 100mg/ L 则使叶绿素含量低于对照 ,减少了
37.52%(图 4)。
2.5　Zn对菹草可溶性蛋白含量的影响
570 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
图 2　Zn 对菹草 POD活性的影响
F ig.2 Effect of Zn on activity of POD
图 3　Zn 对菹草 CAT 活性的影响
Fig.3 Effect o f Zn on activity of CAT
图 4　Zn对菹草叶绿素含量的影响
Fig.4 Effect of Zn on chlorophyll content
　　可溶性蛋白含量在 5 ～ 20mg/L 处理比对照高 ,
在5mg/ L达到峰值 ,当培养浓度继续增大后 ,含量
则下降明显 ,尤其是在 100mg/ L 培养浓度下 ,可溶
性蛋白含量仅为对照的 12.12%(图 5)。
2.6　Zn对叶细胞超微结构的损伤
2.6.1　叶绿体　叶绿体是植物细胞特有的能量转
换细胞器 。正常叶绿体为长椭圆形 ,双层被膜完整 ,
内部结构清晰 ,基质浓密 ,基粒类囊体片层和基质片
层排列整齐 ,显示出良好的结构状态 。叶绿体对 Zn
元素有一定的耐受性 ,表现为:当浓度为 50mg/L
时 ,叶绿体才略有膨胀(图版 1.8),低于此浓度则观
察不到任何变化;当达到最大培养浓度 100mg/L
时 ,Zn对叶绿体产生明显损伤 ,类囊体膨胀 ,排列紊
乱 ,被膜断裂(图版 1.2);最终解体(图版 1.3)。
2.6.2　线粒体　正常叶细胞中的线粒体脊突为管
状 ,基质密集(图版 1.4)。线粒体对 Zn的反应较叶
绿体敏感。当 Zn 培养浓度为 20mg/L 时叶绿体结
构无变化 , 而线粒体脊突则膨大 ,并且部分间质消
失(图版 1.5);50mg/L 的 Zn培养则使线粒体成为
空泡状(图版 2.6)。
2.6.3　细胞核　对照细胞核核质密 ,核仁清晰 ,双
层核膜连续(图版 1.8)。当培养浓度小于 50mg/L
时 ,细胞核结构无变化;50mg/ LZn处理使核膜断裂
(图版 1.8);核仁分散成数小块(图版 1.9);100mg/
L 的处理浓度下 ,凝胶状的染色质和核质散入到细
胞质中(图版 1.10)。
3　讨论
叶绿素含量降低是衡量叶片衰老的重要生理指
标 ,本实验中当 Zn培养浓度大于 50mg/L 时 ,叶绿
素含量开始低于对照。说明低浓度的 Zn 短期(5
天)内未对叶绿素产生明显破坏。而高浓度
(100mg/ L)的 Zn则对叶绿素含量有明显影响 ,从而
导致植物缺绿 ,也说明高浓度 Zn 加速了植物的衰
老。前人[ 8] 研究认为高含量的 Zn 是通过干扰 Fe
的代谢而抑制叶绿素产生的 。过量 Zn对植物产生
毒性的生物学机制有二:1 是离子进入植物体内干
扰了离子间原有的平衡系统 ,造成正常离子的吸收 、
运输 、渗透和调节方面的障碍 ,从而使代谢紊乱[ 9] ;
2是较多的离子进入植物体内后 ,与某些酶蛋白的
非活性基团结合使其变性 ,或者取代某些酶和蛋白
质行使功能时所必需的特定元素[ 10] 。
SOD ,POD , CAT 是植物体内酶促防御系统的 3
个重要保护酶。其中 SOD能清除 O2-·形成 H2O2 ,
POD和 CAT 协同作用形成 H 2O 。三者协调一致 ,
能有效的阻止 O2-· 、H2O2 在植物细胞内的累积 ,使
生物自由基的产生和清除维持动态平衡 ,从而防止
自由基毒害[ 11] 。尤其是SOD ,其活性的高低与植物
的抗逆性大小有一定相关性。我们的实验结果表明
当 Zn 培养浓度小于 50mg/ L 时 , SOD , POD , CAT
5714 期　　　　　　　　　　徐勤松等:Zn 诱导的菹草叶抗氧化酶活性的变化和超微结构损伤
图 5　Zn对菹草可溶性蛋白含量的影响
Fig.5 Effect of Zn on soluble protein content
活性都能在一定程度上有大副升高。因此 ,可以认
为它们在抗Zn毒害中可能起主要抗氧化作用 。而
对于其活性上升机制 ,周长芳等[ 12]的研究结果认为
可能源于酶原的加工 、激活 ,但也不排除活性氧信号
作为第二信使 ,启动细胞防御反应机制的作用[ 13] 。
但同时可看到三种抗氧化酶系活性的增加是有限度
的 ,当培养浓度达到 100mg/ L时 ,SOD ,POD活性减
弱 ,分别为对照的 89.40%和 79.43%。CAT 活性
也表现出下降趋势。说明此时它们对活性氧的清除
能力已大大削弱 ,已经不能阻止自由基在细胞内的
过量累积 ,因此 ,自由基不可避免的将对膜系统造成
膜脂过氧化作用 ,导致细胞代谢紊乱。
同样 , Zn(>20mg/ L)在短期内对细胞超微结
构也造成损伤 ,并随浓度的增大 ,毒害程度也加剧 。
当Zn浓度为 20mg/L 时 ,对叶绿体和细胞核的结构
没有造成任何损伤 ,相比之下 ,线粒体更敏感 ,表现
为脊突膨大 。50mg/ L 的培养浓度则使叶绿体的类
囊体排列紊乱 ,线粒体成空泡状。细胞核核膜断裂 ,
核仁散开。最大培养浓度(100mg/ L)则对各细胞器
造成致死性伤害:叶绿体解体 ,细胞核凝胶状染色质
散入细胞质中 。由此也可看出 ,过量 Zn 主要对细
胞的膜系统产生影响 。这也与保护酶系统活性的紊
乱想吻合。而叶绿体是光合作用的主要器官 ,被膜
断裂和解体必将极大削弱植物光合作用的效率。线
粒体作为细胞的“动力站” ,前人[ 14]研究认为空泡化
会造成其全部功能的丧失 。核膜断裂和染色质散出
也将使细胞核丧失正常的调控功能 。这也在结构上
阐述了过量 Zn 导致细胞生理生化代谢紊乱的原
因。我们也可看到过量 Zn和重金属 Hg 、Cd一样对
细胞超微结构同样产生不可逆转的伤害 ,只是在剂
量效应上有差异[ 15] 。
综上可见 , Zn不仅削弱了叶内抗氧化酶系统
—SOD ,POD ,CA T 对植物细胞的保护能力 ,导致叶
绿素和可溶性蛋白含量降低 ,而且对各细胞器结构
也造成了严重破坏。因此造成对植物细胞膜结构和
生理生化反应的整体伤害[ 15] 。最终将加速植物的
衰老和死亡。
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图　版　说　明
Ce.叶绿体膜 CP.叶绿体 CW.细胞壁 Mi.线粒体 N.细胞核
Nm.核膜 Nu.核仁
1.对照叶细胞的超微结构 ,示叶绿体(×12000);2.100mg/
L Zn 处理 5 天的叶细胞 ,示叶绿体被膜断裂(×12000);3.
100mg/ L Zn 处理 5 天的叶细胞 ,示细胞基质中的类囊体(×
17000);4.正常叶细胞中的线粒体(×12000);5.20mg/ L Zn
572 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
处理 5 天的叶细胞 ,示线粒体脊突膨胀(×17000);6.50mg/
L Zn 处理 5 天的叶细胞 ,示线粒体空泡化(×17000);7.对
照叶细胞的超微结构 , 示细胞核和核仁 (×10000);8.
50mg/ L Zn 处理 5 天的叶细胞 , 示细胞核核膜断裂(箭头)
(×10000);9.50mg/ L Zn 处理 5 天的叶细胞 ,示核仁分散
成数个小核仁 ,主要分布在核膜(×12000);10.100mg/ L Zn
处理 5 天的叶细胞 ,示核膜破裂(箭头)(×10000)
Explanation of Plate
Ce.Chlo roplast envelop ;CP.Chloroplast;CW.Cell wall;
Mi.Mitochondria;N.Nucleus;Nm.Nuclear membrane
1.Ultrasturcture of control leaf cells , showing chloroplast(×
12000);2.Leaf cells treated with 100mg/ L Zn for 5 days ,
show ing disrupted chlo roplast membrane(×12000);3.Thy-
lakoids in the cytoplasmic matrix in leaf cells treated with
100mg/ L Zn for 5 day s(×17000);4.Mito chondria in control
leaf cell(×12000);5.Leaf cells treated with 20mg/ L Zn for
5 days , showing the sw ollen cristae of mitochondria(×12000)
;6.Leaf cells treated with 50mg/ L Zn fo r 5 day s , showing
vacuo ting of mito chondria (×17000);7.Ultrasturcture of
control leaf cells , show ing nucleus and nucleo lus(×10000);8.
Leaf cells treated with 50mg/L Zn for 5 day s , showing disrupt-
ed nuclear membrane(arrow s)(×10000);9.Leaf cells treat-
ed w ith 50mg/ L Zn fo r 5 days , showing break of nucleolus into
several small nucleoli mainly distributed nearby the nuclear
membrane(×10000);10.Leaf cells treated with 100mg/ L
Zn for 5 days , showing disrupted nuclear membrane(×10000)
5734 期　　　　　　　　　　徐勤松等:Zn 诱导的菹草叶抗氧化酶活性的变化和超微结构损伤