全 文 ：第 22卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　7月
Vol.22　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2002
菜豆种质资源 RAPD多样性的研究Ⅱ
栾非时1 　祖元刚2
(1.东北农业大学 , 哈尔滨　150030)
(2.东北林业大学 , 哈尔滨　150040)
摘　要　本研究收集了我国 43个栽培品种 ,国际热带农业中心 13个半野生品种 ,波兰 4个矮生
品种共60个菜豆品种资源 ,将其分成三大类型 ,即蔓生种 35个 ,矮生种 12个 ,半野生种 13个 ,从
RAPD标记上进行了研究 ,探明种内及各种群间的遗传相似度 、遗传距离 ,绘制聚类分析图。综合
RAPD标记聚类图 ,表明:蔓生种群分为五大类;矮生种群分为二大类;半野生种群分为二大类 。
我国是菜豆的主要育种 、栽培地区 ,收集国内外菜豆种质资源 ,开展 DNA水平的分子标记将有助
于了解菜豆种内 、各种群间的遗传基础 ,确定各资源材料间的亲缘关系 ,为我国菜豆种质资源的保
存及培育优良品种工作提供一定的理论依据 。
关键词　菜豆;RAPD;遗传多样性
RAPD DIVERSITY OF GERMPLASM RESOURCES
ON PHASEOLUS VULGARIS Ⅱ
LUAN Fei-shi1　ZU Yuan-gang2
(1.Northeast Agricultural University , Harbin 150030)
(2.Northeast Forestry University , Harbin 150040)
Abstract　Sixty varieties of Phaseolus vulgaris were collected in this study , including 43 from Heilongjiang
Province , 13 from The Center of International Agriculture Tropic and 4 from Poland , which were classified as
35 for vine , 12 for dwarf and 13 for semi-wild variety.This study was to analyze the genetic similarity and
genetic distance in population and among populations of the 60 varieties and to draw the dendrogram of cluster
analysis by using the markers of RAPD.Total 60 varieties in this study could be classified into 5 groups for
vine population , 2 for dwarf population and 2 for semi-wild population based on the analysis of the dendro-
gram of cluster analysis for the markers of RAPD.It is of importance to collect Phaseolus vulgaris resources
from home and abroad since Heilongjiang Province is the main area for breeding and cultivating Phaseolus
vulgaris in China.The analysis for the markers of RAPD would be beneficial for investigating the genetic back-
ground of Phaseolus vulgaris in population and among populations and for identifying the inter-relationship
in population.The present study would be valuable for preserving the germplasm and breeding good strains of
Phaseolus vulgaris in Heilongjiang Province.
Key words　Phaseolus vulgaris;RAPD;genetic diversity
第一作者简介:栾非时(1964-),女,副教授 ,博士 ,主要从事蔬菜分子生物学 、蔬菜专家系统 、设施园艺方向的研究。本文为作者在博
士后工作站期间研究的内容。
收稿日期:2001-02-16
　　菜豆又名四季豆 、梅豆 、芸豆 ,植物学上属于豆
科(Lequminosae)、菜 豆族 (Phaseoleae)、菜豆 属
(Phaseolus)的菜豆种(vulgaris),它属一年生草本植
物 ,是一种重要的豆类蔬菜 , 虽然 ,我国菜豆种质资
源非常丰富 ,由于自然生态环境逐年遭到破坏 ,广泛
栽培的只是几个基因型 ,因此 ,许多优良农家品种可
利用的遗传资源没有被利用且濒临灭绝 ,要保护这
些菜豆品种 ,从而保存它们携带的遗传信息重要资
源 ,了解它们的遗传基础 ,掌握各资源材料间的遗传
关系 ,进而确定保护途径和手段。
因此本试验旨在开展菜豆栽培种 、农家品种 、国
际热带农业中心的半野生种及波兰矮生种的资源调
查 ,开展DNA水平的分子标记 ,将了解我国菜豆栽
培品种的遗传基础 ,确定品种内 、变种群间的遗传距
离 ,根据遗传距离用标准差标准化 、平均距离法 、
UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic
mean)方法构建 RAPD标记的不同级别的系统分类
图。为我国菜豆种质资源的保存及育种工作提供进
一步的理论基础 。
1　材料与方法
1.1　试验操作
1.1.1　引物的筛选
从60个菜豆种质中分别选出蔓生栽培种 、矮生
栽培种 、半野生种各 20粒种子 ,进行播种 ,长出真叶
后取 10株叶片 ,制成 3 种混合模板 ,分别对 Operon
公司生产的四组引物(80个)进行筛选 ,选择的依据
是扩增谱带数目在三条以上 ,扩增带清晰 ,重复性较
好。
1.1.2　RAPD产物的电泳检测
采用 TAE电泳缓冲液(0.04mol Tris-乙酸 , 0.
001molEDTA),琼脂糖浓度 1.2%,凝胶中含 EB1μg
ml。取扩增产物 15μl与 2 ～ 3μl加样缓冲液混匀后
上样 ,稳定电压 3V cm ,时间 2 ～ 5小时 ,以 Hand Ⅲ
EcoRⅠ双酶切的λ-DNA作为分子量标准 。电泳结
束后 ,在紫外灯下观察并照相[ 1] 。
1.1.3　RAPD谱带的记录
电泳图谱中的每一条带均代表了模板 DNA 上
与引物互补的一对结合位点 ,可记为一个分子标记 。
在记录谱带时应选择清晰 、稳定 、重复性好的带 ,与
空白对照产物具有相同迁移率的带应视为污染带予
以排除。根据分子量标准的迁移率确定 RAPD带的
分子量 ,有扩增带用“1”表示 ,没有扩增带或者扩增
带极弱用“0”表示 ,得到原始数据[ 2] 。
(1)利用计算机软件 NTSYS-pc(1.80版)处理
RAPD数据
图 1　菜豆品种间聚类分析树状图
Fig.1　Dendrogram of cluster analysis of Phaseolus vulgaris population
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用SIMQUAL(Similarity for Qualitative Data)法计算各
品种间遗传相似系数。用 SAHN(Sequential ,Agglom-
erative ,Hierarchical and Nested Clustering)功能 ,按照
UPGMA法(Unweighted Pairgroup Method and Arithetic
Average)进行聚类分析 ,再用 Tree Display 功能做出
聚类图[ 3] 。
(2)RAPD标记共享度和遗传距离
根据Nei 和 Li(1979)的方法 ,计算 RAPD 片段
共享度(F)和遗传距离(D)
公式为 F = 2NxyNx+Ny 　　D =1-F
其中 Nxy 为 x 、y 两个品种共同拥有的 RAPD标
记数;Nx 、Ny 为 x 、y 品种各自拥有的 RAPD标记数 。
2　结果与分析
2.1　用NTSYS程序进行菜豆种质资源的遗传相似
度和聚类分析
NTSYS-PC开展遗传统计分析的计算机软件 ,
近年来多次被应用于 RAPD数据的统计分析[ 4] ,本
研究将 RAPD结果转换为 0 、1矩阵 ,并对各品种间 、
蔓生变种群 、矮生变种群 、半野生变种群的遗传相似
度进行估计 , 并根据遗传相似度矩阵开展聚类分
析[ 5] 。
菜豆种质资源品种内遗传相似度变化范围在
0.662 ～ 0.920之间 ,平均为 0.7611;蔓生种遗传相似
度变化范围在 0.666 ～ 0.911之间 ,平均为 0.7645;
矮生种遗传相似度变化范围在 0.720 ～ 0.917之间 ,
平均为 0.8315;半野生种遗传相似度变化范围在 0.
796 ～ 0.920之间 ,平均为0.8707。综合以上结果 ,菜
豆种质资源60个品种内遗传相似度变化幅度最大 ,
蔓生种遗传相似度变化幅度其次 ,矮生种再次 ,半野
生种遗传相似度变化幅度最小。按 UPGMA 法开展
品种内 、各变种群间聚类分析见图 1 、2 、3 、4。
图1表明:60个菜豆种质资源聚类出两大类 ,
即蔓生种有相同起源;花八月忙 、农家品种家雀蛋与
CIAT提供的大多数半野生菜豆种质有相同起源;大
连85—1 ,春风四与 CIAT提供的 41.42.51以及所有
矮生菜豆种质均有相同起源。
图 2　蔓生变种群聚类分析树状图
Fig.2　Dendrogram of cluster analysis of vine population
　　图 2 、3 、4表明:蔓生变种群聚类分析得到两大
类树状图 。对矮生变种群聚类分析也得到两大类树
状图 ,其中日本无筋绿 、波兰的 P-2 、P -4 、P-6品
种为一类 ,其余矮生种为一类 。半野生变种群聚类
分析得到两大类树状图中 , BELDAKHI -RR-2 、
BELDAK-RR-2 、DON390 、XAN309 四个品种为一
类 ,其余为一类 。该种分类方法与等位酶分类方法
基本相吻合 ,但也有个体差异 。
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图 3　矮生变种群聚类分析树状图
Fig.3　Dendrogram of cluster analysis of dwarf population
2.2　菜豆品种间遗传距离
通过计算菜豆种质资源间蔓生种 、矮生种 、半野
生种的 RAPD片段共享度 ,得到各品种间的遗传相
似度 ,进一步计算出遗传距离 ,结果列于表 1 、表 2。
该试验结果表明:矮生种与半野生种之间的遗传相
似度最高达 0.7767 ,矮生种与蔓生种之间的遗传相
似度其次达 0.7417 ,蔓生种与半野生种之间的遗传
相似度最低仅有 0.7359。相反矮生种与半野生种
之间的遗传距离最小 ,矮生种与蔓生种之间的遗传
距离其次小。
表 1　菜豆各类型品种内 、变种群间的遗传相似度
Table 1　Genetic similarity in variety and
among populations of Phaseolus vulgaris
类型蔓生种
Type vine
矮生种
Dwarf
半野生种
Semi-wild variety
蔓生种
Vine
0.7528
矮生种
Dwarf
0.7417 0.8063
半野生种
Semi-wild
variety
0.7359 0.7767 0.8569
2.3　菜豆品种间的特征谱带
菜豆蔓生变种群的特征谱带有 10条 ,其标记及
频率分别为 opa-03-1744出现频率为 0.2571 , opa
-08-4268出现频率为 0.2286 , opa-08-1540出现
频率为0.1429 , opa-11-3500出现频率为 0.1714 ,
opd-02-3420出现频率为 0.1429 , opd-02-698出
现频率为 0.1143 , opd -18 -3530 出现频率为 0.
1143 , opf-13-1744出现频率为 0.1715 , ope-02-
2779出现频率为0.1429 , ope-02-1161出现频率为
0.1143。矮生种的特征谱带有 1条 ,其标记及频率
分别为 OPA-10-889出现频率为 0.1667。半野生
种的特征谱带有 1条 ,其标记及频率分别为 OPD-
04-30出现频率为 0.3077。蔓生种标记较强 ,而矮
生种标记较弱的特征谱带及频率分别为 OPA-20-
564 ,蔓生种出现频率为 0.2286 ,矮生种出现频率为
0.0833;OPD-17-2027 ,蔓生种出现频率为 0.1714 ,
矮生种出现频率为 0.0833;OPF-13-1375 ,蔓生种
出现频率为0.3714 ,矮生种出现频率为 0.0833;OPE
-02-1904 ,蔓生种出现频率为 0.4571 ,矮生种出现
频率为0.0833;OPE-03-1375 ,蔓生种出现频率为
0.4286 ,矮生种出现频率为 0.0833。说明蔓生种特
征标记较多 ,遗传变异较大 ,矮生种的特征标记其
次 ,半野生种再次。(见表 3)
表 2　菜豆各类型品种内 、变种群间的遗传距离
Table 2　Genetic distance in variety and among
populations of Phaseolus vulgaris
类型
Type
蔓生种
Vine
矮生种
Dwarf
半野生种
Semi-wild variety
蔓生种
Vine
0.2472
矮生种
Dwarf
0.2383 0.1938
半野生种
Semi-wild
variety
0.2641 0.2233 0.1431
3253期　　　　　　　　　　　　　　栾非时等:菜豆种质资源 RAPD多样性的研究Ⅱ
图 4　半野生变种群聚类分析树状图
Fig.4　Dendrogram of cluster analysis of semi-wild population
表 3　菜豆变种群的特征谱带及其频率
Table 3　Special bands and their frequency of
Phaseolus vulgaris populations
出 现频 率Frequency
特征谱带
Special band
蔓生种
Vine
矮生种
Dwarf
半野生种
Semi-wild
variety
OPA-03-1744 0.257143 0 0
OPA-08-4268 0.228571 0 0
OPA-08-1540 0.142857 0 0
OPA-10-889 0 0.166667 0
OPA-11-3500 0.171429 0 0
OPA-20-564 0.228571 0.083333 0
OPD-02-3420 0.142857 0 0
OPD-02-698 0.114286 0 0
OPD-04-30 0 0 0.307692
OPD-17-2027 0.171429 0.083333 0
OPD-18-3530 0.114286 0 0
OPF-13-1375 0.371429 0.083333 0
OPF-13-1744 0.171429 0 0
OPE-02-2779 0.142857 0 0
OPE-02-1904 0.457143 0.083333 0
OPE-02-1161 0.114286 0 0
OPE-03-1375 0.428571 0.083333 0
　　通过形态 、等位酶 、RAPD标记 ,可尽快获得品种
间亲缘关系 ,特别是同类及类间品种的差异 ,增加选
择的准确性 ,缩短观察后代时间 ,从而减少育种中不
必要的杂交数目 ,免去繁重而漫长的工作 ,也免去了
很困难的人工杂交 、培植 、观察后代性状的工作 ,尽
快获得有效的杂交组合 ,优化育种目标 ,培育出优量
品种。
3　结论
3.1　RAPD 反应的优化条件为:20μl 反应总体系 ,
4μl(88ng)模板 , 1.5μl(15ng)引物 , 2μl(200μmol L 每
种)dNTP , 97℃预变性 7min ,加入 1U TaqDNA 聚合
酶 ,再进行 40次热循环 ,循环条件为 94℃1min ,36℃
1min ,72℃1min ,最后在 72℃下延伸 7min 。
3.2　菜豆蔓生种的遗传相似度为 0.7645 ,矮生种为
0.2082 ,半野生种为 0.8707 ,遗传距离依次为蔓生种
>矮生种>半野生种 。
3.3　在全部 314条扩增带中 ,有 10条谱带分别为
蔓生种所特有 ,矮生种及半野生种分别有 1条特征
谱带 ,说明蔓生种的特征标记较多 ,遗传变异较大 ,
矮生种的特征标记其次 ,半野生种再次。
4　讨论
由于菜豆种内的遗传多样性主要分布于蔓生变
种群内 ,在所研究的蔓生 、矮生 、半野生变种群中 ,蔓
生变种群的遗传多样性水平最高 ,矮生变种群其次 ,
半野生变种群最次。变种群内平均遗传相似度为
0.8053 ,变种群间为 0.7514。变种群内的平均遗传
距离为 0.1947 ,变种群间为 0.2419。因此在等位酶 、
RAPD标记的聚类图中蔓生变种群类型较多 ,差异也
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较大。说明黑龙江省菜豆种质资源遗传基础较宽 ,
亲缘关系较远 ,遗传变异主要存在于蔓生种群内部 ,
菜豆变种群内遗传多样性较为丰富 ,可以作为育种
材料储备种质资源。
参　考　文　献
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Appl Genet , 1993 , 87:54～ 49
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in Rosa.Theor Appl Genet , 1996 , 92:273～ 277
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