全 文 ：第 21 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　1 月
Vol.21　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2001
利用 RAPD标记技术对白桦种源遗传变异的分析及种源区划
姜　静　杨传平 　刘桂丰 　刘玉喜 　任旭琴
(东北林业大学 ,哈尔滨　150040)
摘　要　用随机扩增多态 DNA(RAPD)分子标记方法对白桦 17个种源 152个个体进行了遗传变
异的比较分析 ,通过 14个随机引物扩增共检测到 233 个位点 ,各种源多态位点百分率差异明显 ,
范围在 20.17%～ 32.19%之间 ,多态位点百分率最高的是帽儿山种源和清源种源 ,最低的是绰尔
种源 。遗传变异在种源间占 43.53%,在种源内个体间占 56.47%。根据种源间的遗传距离 ,构建
了白桦 17个种源的遗传关系聚类图 ,结果将东北地区的白桦聚为一类 ,华北 、西北地区的白桦聚
为另一类 。同时根据地理气候因子和遗传距离对白桦群体进行了种源区的划分 。
关键词　RAPD;遗传变异;白桦;种源;种源区划
ANALYSISOF GENETIC VARIATION WITHIN
AND AMONG BETULA PLATYPHYLLA PROVENANCES
AND PROVENANCE DIVISION USING RAPD MARKERS
JIANG Jing　YANG Chuan-ping　LIU Gui-feng　LIU Yu-xi　REN Xu-qin
(Nor theast Forestry University ,Harbin 150040)
Abstract　RAPD was used to detect genetic variation among 17 provenances , including 152 individu-
als.233 loci w ere amplif ied using 14 random primers.The differentiation of the percentage of poly-
morphic loci among different provenances was evident , ranging f rom 20.17% to 32.19%, among
which there were M aoershan provenance and Qingyuan provenance w ith the highest PPL and Chaoer
provenance w ith the lowest PPL .Most of the variation(56.47%)occurred among individuals w ithin
provenances , and 43.53%was at t ributed to differences among provenances.The dendrog ram of ge-
net ic relationship w as constructed acco rding to genetic distances among provenances.The result re-
vealed that the provenances f rom Northeast and others f rom North and Northwest w ere respectively
clustered into different g roups.At the same t ime , provenance division w as completed on the basis of
geographic climatic factors and genetic distances.
Key words　RAPD;Genetic variation;B.platyphyl la Suk;Provenance;Provenance division
　　白桦(Betula platyphy lla Suk.)是桦木科 、桦木
属的一个种 ,白桦具有更新好 、生长快 、适应性强的
特点 ,其材质又具有纹理细致 ,颜色洁白 ,表面光滑
度高等独有优点 ,因此用途广泛。不但可做工艺材 、
家具材 、纸浆材等 ,而且在餐饮业和医药业中广为利
用[ 1] ,更是单板类胶合板材的最适宜和最重要的原
料之一 。我国 “八·五”期间在种源(采种点)、强化
育种 、优树选择和白桦组织培养 、扦插繁殖等方面进
行了初步的研究 ,已取得了一定的成绩[ 2～ 4] 。
RAPD分子标记技术自 1990年产生以来 ,广泛
的应用于遗传图谱的构建 、基因克隆 、分子系统学及
第一作者简介:姜静(1960-),女 ,博士(副教授),分子生物学。收稿日期:2000-9-1
林木群体遗传结构等研究领域。由于 RAPD 分析
不需要对所研究的物种的分子遗传学背景有所了
解 ,扩增在基因组 DNA水平上随机进行 ,所检测的
位点在基因组中随机分布 ,因而可以更客观地说明
群体遗传多样性的水平 ,近年来已积累了大量的对
植物进行 RAPD分析的资料[ 5 ～ 8] 。
本文利用 RAPD标记技术 ,研究白桦群体的遗
传变异 ,探讨白桦种源间的遗传分化与环境的关系 ,
为白桦的良种选育提供资料 ,同时 ,在 DNA 水平上
进行了白桦种源区的划分 ,为种子调拨供理论依据 。
1　研究方法
1.1　材料来源
白桦 17个种源的种子分别采自东北 、华北和西
北(表 1),1998年 5月在东北林业大学校园内的塑
料大棚营养杯中播种育苗 。待苗木长出 4 ～ 5 片叶
子时 ,采集 1 ～ 2片幼叶 ,用蒸馏水洗净 ,擦净叶片上
的水 ,分别用小塑料袋装好 ,放在-70℃冰箱中保存
备用 。
1.2　总 DNA 提取
CTAB 法提取总 DNA , 利用美国 PERK IN
ELMER公司生产的 UV/V1S Spectrometer Lambda
Bio10测定所提 DNA的含量和纯度 。
　　表 1 白桦样品来源
Table.1 The sources of samples of B.Platyphylla
种源(采种点)
Provenances
种源代码
Code of provenances
个体数
No.of individuals
种源(采种点)
P rovenances
种源代码
Code of provenances
个体数
No.of individuals
莫尔道嘎 MG 10 辉南 HN 9
绰尔 CR 10 清源 QY 9
乌伊岭 WL 8 桓仁 HR 10
凉水 LS 9 草河口 CK 10
帽儿山 M 9 宁夏 NX 10
东方红 DH 7 甘肃 TS 7
小北湖 BH 8 青海 QH 10
汪清 WQ 8 新疆 XJ 10
露水河 LH 8
1.3　引物筛选
参阅国内外有关研究文献 ,参照Operon公司的
引物序列 ,在 TaKaRa 公司合成了 25 个 10 碱基长
度的寡核苷酸引物 ,分别扩增白桦 2个 DNA 样品 ,
进一步从 25个引物中筛选出扩增性强 、重复性好 、
多态性高的 14个引物(表 2),用于全部白桦 DNA
样品的扩增。
1.4　PCR扩增及产物的鉴定
RAPD-PCR扩增是在 Perkin-Elmer 9600 扩
增仪上进行的 ,每 20uL 反应体积中含 40ngDNA 模
板 ,30ng 引物 ,0.2mM 4×dNTP(Sangon产品),1×
PCR Buffer , 1UTaqDNA 聚合酶(Promega 产品)。
每个引物设一个空白对照反应 ,即将反应体系中的
DNA模板换为灭菌双蒸水 。
扩增程序为:94℃加热 3分钟 ,使模板 DNA 变
性 ,然后进入下列温度循环:94℃变性 1分钟 、37℃
退火 1分钟 、72℃延伸 2分钟 ,共计 40 个循环 。循
环结束后在 72℃延伸 7分钟 ,以保证 DNA 延伸彻
底 ,若不能立即电泳检测 ,可放入 4℃冰箱中保存。
PCR扩增反应结束后 ,采用 1×TAE电泳缓冲
液 ,在 1.5%的琼脂糖凝胶中(含 EB 0.5ug/ml)电泳
分离扩增产物 ,同时 ,在适当的位置上加上一个已知
分子量的 DNA 标准样品(100bp DNA Ladder 购自
MBI公司)。电泳结束后在 UVP 凝胶成像系统下
观察照相 。
1.5　数据统计与分析
电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板
DNA互补的一对结合位点 ,可记为一个分子标记 ,
根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置 ,
估计扩增产物的分子量大小 ,有带的记为 1 ,无带的
记为 0 ,形成 0/1矩阵图输入计算机。
1271 期　　　　　　　　姜　静等:利用 RAPD标记技术对白桦种源遗传变异的分析及种源区划
表 2 RAPD分析用的 14个随机引物序列
Table.2 Sequences of 14 arbitrary primers
引　物　名　称
Name of primers
序列 5 -3
Sequences 5 -3
引　物　名　称
Name of primers
序列 5 -3
Sequences 5 -3
OPA-02 TGCCGAGCTG OPQ-05 CCGCGTCTTG
OPA-14 TCTGTGCTGG OPQ-11 TCTCCGCAAC
OPA-19 CAAACGTCGG OPQ-07 CCCCGATGGT
OPA-09 GGGTAACGCC OPN-07 CAGCCCAGAG
OPB-07 GGTGACGCAG OPK-02 GTCTCCGCAA
OPB-17 AGGGAACGAG OPK-17 CCCAGCTGTG
OPC-12 TGTCATCCCC OPC-14 TGCGTGCTTG
　　采用 RAPDistance 软件包 , 用 Excoffier et al
(1992)遗传距离公式计算个体间的遗传距离 。用
Neighbor-Joining方法构建个体间树状聚类图。与
AMOVA分析软件连用 ,分析遗传变异在不同层次
上的分布 ,计算种源间的遗传距离 。
图 1 随机引物 OPB-17 扩增图谱
Fig.1 P rofile produced by the primer OPB-17
1 ～ 10 CR Provenance;11 、12 、14-20 MG Provenance;13
Molecular w eight marker(100bp DNA ladder);21 ～ 24 TS
P rovenance;25 Blank
图 2　白桦 17 个种源遗传聚类图
Fig.2 The dendrogram of B.platyphy lla between prove-
nances generated by STATIST ICA
1.NX;2.QH;3.XJ;4.TS;5.LS;6.M;7.WL;8.DH;9.
BH;10.QY;11.HR;12.CK;13.HN;14.WQ;15.LH;16.
CR;17.MG
2　结　果
2.1　多态位点比率
所谓多态位点是指在该位点上扩增 DNA 片段
出现的频率小于 0.99 的位点 。通过 14个 10碱基
随机引物对白桦17个种源 152个个体的DNA样品
进行了 RAPD分析。共检测到 233个位点 ,位点范
围在 250bp ～ 2000bp 之间(图 1),多态位点百分率
在 20.17%～ 32.19%之间 ,多态位点百分率最低的
是绰尔种源 ,最高的为帽儿山 、清源种源 。位于大兴
安岭地区的两个种源(绰尔和莫尔道嘎)的多态位点
百分率分别是 20.17%和 24.46%,位于小兴安岭 、
张广才岭和完达山地区各种源的多态位点百分率在
28.76%～ 32.19%之间 ,长白山地区各种源的多态
位点百分率在 27.04%～ 32.19%之间 ,华北 、西北
地区各种源的多态位点百分率在 23.61%～ 28.
76%之间(表 3)。
2.2　白桦群体遗传变异的分布
利用 AMOVA 软件对白桦 17 个种源进行
RAPD遗传变异分布分析 ,结果表明:遗传变异在种
源之间占 43.53%,种源内个体间占 56.47%。
2.3　白桦群体遗传距离聚类分析
为了确定白桦 17个种源间的遗传关系 ,利用
RAPD分析获得的遗传距离矩阵(表 4),输入 STA-
TIS TICA软件进行了聚类分析 ,构建了供试 17 个
种源的亲缘关系聚类图(图 2)。聚类结果表明:在
1.4的遗传距离上 ,白桦 17个种源明显分为两大类
群 ,即东北地区的大兴安岭 、小兴安岭和长白山地区
的种源聚为一类 ,而华北 、西北地区的种源聚为另一
类。其中聚在一起的东北地区白桦群体又分为两个
亚群 ,即大兴安岭地区聚为一个亚群 ,包括莫尔道嘎
和绰尔种源 ,小兴安岭 、张广才岭 、完达山和长白山
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分布区的种源聚为另一亚群 ,后者又分为两个组 ,第
一组为长白山地区的种源 ,包括露水河 、汪清 、辉南
和草河口种源;第二组为小兴安岭 、张广才岭和完达
山地区的种源 ,包括小北湖 、东方红 、乌伊岭 、帽儿
山 、凉水 、桓仁 、清源种源(后两个种源例外 ,位于长
白山地区)。在华北 、西北类群中 ,分为三个亚群 ,即
甘肃和新疆分别聚为独立的亚群 ,宁夏 、青海为一个
亚群 。
表 3 白桦不同种源的多态位点百分率
Table.3 The PPL of B.Platyphylla in different provenances
地　区
Regions
种　源
Provenances
个体数
No.of samples
位点总数
Total loci
多态位点数
No.of polymorphic loci
多态位点比率/ %
PPL
大兴安岭 莫尔道嘎 10 233 57 24.46绰尔 10 233 47 20.17
小兴安岭
张广才岭
完达山
乌伊岭 8 233 72 30.90
凉水 9 233 69 29.61
帽儿山 9 233 75 32.19
东方红 7 233 67 28.76
小北湖 8 233 70 30.04
长白山
汪清 8 233 63 27.04
露水河 8 233 72 30.90
辉南 9 233 77 30.05
清源 9 233 75 32.19
桓仁 10 233 74 31.76
草河口 10 233 70 30.04
华北.西北
宁夏 10 233 58 24.89
甘肃 7 233 56 24.03
青海 10 233 55 23.61
新疆 10 233 67 28.76
3　讨　论
多态位点百分率可作为度量遗传变异水平高低
的指标 。对白桦 17个种源多态位点百分率分析表
明 ,多态位点百分率在 20.17%～ 32.19%之间 ,各
种源多态位点百分率差异较大 。由于白桦分布区广
阔 ,全国 14个省区均有分布。白桦在东北地区为连
续分布 ,在华北 、西北为岛状或斑块状分布 ,是不连
续的 ,各种源所处地理位置的不同 ,水热条件的差
异 ,即降水量由东南向西北递减 ,大陆性气候越往西
越剧烈。加之华北 、西北地区受高山阻隔 ,生态条
件 、环境差异显著 ,导致种源间的遗传变异也较复
杂。这种种源间的差异 , 为开展白桦种源选择在
DNA水平上提供了理论依据。
白桦 17个种源的遗传距离聚类结果是:呈连续
分布的东北地区白桦群体与岛状分布的华北 、西北
地区白桦群体聚为两类 ,表明东北与华北 、西北地区
的白桦群体遗传差异较大 ,这种遗传差异可能是来
自于地理距离 、环境因子 、气候因子等因素影响的结
果。而东北地区的白桦群体在 0.9的遗传距离上分
为两个类群 ,即大兴安岭地区聚为一群 ,小兴安岭 、
张广才岭 、完达山和长白山分布区的种源聚为另一
群 ,结果说明:大兴安岭地区的白桦与小兴安岭 、长
白山 、完达山地区的白桦之间存在着一定的遗传差
异。
1291 期　　　　　　　　姜　静等:利用 RAPD标记技术对白桦种源遗传变异的分析及种源区划
表 4 白桦 17个种源的遗传距离矩阵
Table.4 Matrix of genetic distances between the B.platyphyll a provenances
MG CR LH WQ HN CK HR QY BH DH M WL LS TS XJ QH NX
MG 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
CR 0.12 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
LH 1.05 1.03 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
WQ 1.12 1.13 0.16 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
HN 1.11 1.10 0.50 0.57 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
CK 1.21 1.20 0.56 0.58 0.29 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
HR 1.21 1.18 0.66 0.73 0.67 0.75 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
QY 0.97 0.98 0.41 0.55 0.46 0.58 0.52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
BH 1.63 1.02 0.49 0.58 0.44 0.55 0.45 0.15 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
DH 1.05 1.06 0.56 0.69 0.59 0.69 0.60 0.12 0.11 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
M 1.03 1.01 0.54 0.58 0.52 0.59 0.48 0.31 0.34 0.44 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
WL 1.07 1.05 0.15 0.19 0.46 0.51 0.63 0.41 0.48 0.55 0.44 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
LS 1.13 1.13 0.71 0.74 0.47 0.79 1.65 0.48 0.55 0.63 0.13 0.64 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
TS 0.68 0.70 0.99 1.10 1.05 1.17 1.16 0.95 1.00 1.03 1.03 1.03 1.17 0.00 0.00 0.00 0.00
XJ 0.73 0.72 1.01 1.08 1.12 1.20 1.16 1.01 1.01 1.05 1.04 1.04 1.17 0.59 0.00 0.00 0.00
QH 0.52 0.55 1.03 1.12 1.11 1.21 1.16 1.01 1.05 1.10 1.06 1.10 1.20 0.71 0.68 0.00 0.00
NX 0.49 0.46 1.04 1.14 1.10 1.18 1.16 1.01 1.03 1.07 1.04 1.09 1.18 0.66 0.77 0.22 0.00
　　种源区是指立地条件相同 ,树种遗传特性基本
一致的自然地理区域 ,是气候条件 、遗传特性 ,植被
和森林特点等方面的综合 。种源区具有两个特点 ,
一是同一种源区是由表型和遗传相似的一个或若干
个种源组成的地域。二是组成同一种种源区的各个
种源在分布上应是相邻或连续的 ,且具有相对一致
的生态环境 。种源区的划分是用种及调种的依
据[ 9] 。由于白桦分布广 ,各种源间又存在着差异 ,
所以对白桦进行种源区划是必要的 。
传统的种源区划方法 ,是在种源试验的基础上 ,
根据种源的表型性状同时结合地理气候因子进行区
划的 。在高等真核生物个体中 ,只有不到 20%的遗
传密码用于编码基因 ,其中用于编码蛋白质的密码
仅占少部分 ,表型性状还受到环境因素的制约 ,因
此 ,利用表型性状来分析遗传的相似性不能全面 、客
观的揭示白桦种源的遗传组成 。认为传统的种源区
划有其不完善的方面 。
利用 RAPD 技术可以对基因组的所有序列直
接分析 ,不受环境因素的影响 ,在 DNA水平上揭示
群体的遗传变异 ,再结合地理气候因子进行种源区
的划分 , 可以克服上述之不足。为此 , 认为应用
RAPD技术 ,根据各种源间的遗传距离 ,结合各种源
的地理气候因子进行种源区的划分更准确。利用该
方法将白桦 17个种源区划为五个种源区 ,即 Ⅰ大兴
安岭种源区 ,(包括绰尔 、莫尔道嘎种源);Ⅱ小兴安
岭 、张广才岭 、完达山种源区 ,(包括乌伊岭 、凉水 、帽
儿山 、小北湖 、东方红种源);Ⅲ长白山种源区 ,(包括
清源 、桓仁 、草河口 、辉南 、露水河 、汪清种源);Ⅳ六
盘山 、祁连山种源区 ,(包括宁夏 、青海 、甘肃种源);
Ⅴ新疆种源区 ,(包括天山西部种源)。
参　考　文　献
1.郑万均.中国树木志.北京:中国林业出版社 , 1983
2.陶静 , 詹亚光 ,姜静.白桦组培再生系统的研究.东北林业
大学学报 , 1998 , 26(5)6 ～ 9
3.姜静 ,杨传平 , 刘桂丰.白桦苗期种源试验的研究.东北林
业大学学报 , 1999 , 27(6)1～ 3
4.刘桂丰 , 杨传平 ,刘关君.白桦不同种源种子形态特征及
发芽率.东北林业大学学报 , 1999 , 27(4)1 ～ 4
5.邹喻苹 ,蔡美琳 , 王晓东.古代“太子莲”及现代红花中国
莲种质资源的 RAPD分析.植物学报 , 1998 , 40(2)163 ～
168
6.尹佟明 ,黄敏仁 , 王明庥.利用 RAPD 标记和单株树大配
子体构建马尾松的分子标记连锁图谱.植物学报 , 1997 ,
39(7):607 ～ 612
7.Vignir S , Kesara A.DNA fingerpriting of Populus tri-
chocarpa clones using RAPD markers.New Fo rests , 1995 ,
10(3):197 ～ 206
8.Icario F , Vendramin GG et al.Allozyme , chlo roplast DNA
and RAPD markers for determining genetic relationships be-
tw een Abies alba and relic population o f Abies nebrodensis.
Theor App1 Genet , 1995 , 90:1012 ～ 1018
9.王明庥.林木育种学概论.北京:中国林业出版社 , 1988
130 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷