全 文 ：第 25卷　第 2期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　4月
Vo .l 25　No. 2　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH April, 　2005
基金项目:国家自然科学基金项目(30170619);教育部 “高等学校骨干教师资助计划 ”(1821);上海市教委科研项目(04DB17)
第一作者简介:黄华(1979— ),男 ,硕士研究生 ,从事植物学和外来杂草生态学研究工作。
*　通讯作者 Au th or for correspondence　E-m ail:guoshu iliang@ 163. com
收稿日期:2004 - 11 - 10
外来入侵植物加拿大一枝黄花居群间遗传差异分析
黄　华 1　郭水良 1, 2*
(1. 浙江师范大学化学与生命科学学院 , 金华　321004)
(2. 上海师范大学生命科学与环境科学学院 , 上海　200234)
摘　要　采用三种不同的方法提取外来入侵植物加拿大一枝黄花总 DNA ,并应用 RAPD技术分
析了浙沪地区 4个加拿大一枝黄花居群间的遗传分化 。结果表明:(1)2×CTAB法提取的 DNA
具有较好的完整性 ,能较好地去除蛋白质 、酚类和多糖杂质 ,是比较适合加拿大一枝黄花总 DNA
提取的方法;(2)加拿大一枝黄花的遗传多态性非常高 , 13个引物在 4个居群中共检测到 102条
扩增片段 ,多态带 84条 ,多态率达到 82. 35%;特有带 41条 ,占 40. 20%。居群之间的多态性分别
是上海嘉定 (73. 13%)>嘉兴乍浦 (68. 97%)>杭州 (68. 42%)>金华 (57. 14%);(3)13个引物
检测的平均纯合度(J)为 0. 38 ,平均杂合度(H)为0. 62;(4)Ne i基因相似系数 、聚类分析和主成分
分析表明 ,加拿大一枝黄花不同居群间的遗传差异程度较大 ,居群间的遗传分化与地理位置存在
对应关系;(5)加拿大一枝黄花的入侵居群的适应性进化与杂草特性紧密相关。
关键词　外来入侵植物;加拿大一枝黄花;总 DNA提取;RAPD;遗传多样性
Analysis of population genetic differences of the invasive plant
Solidago canadensis
HUANG Hua
1　GUO Shu i-Liang1, 2*
(1. Co llege of Chem istry and L ife Science, Zhejiang No rm al University, Jinhua　321004)
(2. Co llege of L ife and Env ironmenta l Science s, Shanghai Norm a lUniversity, Shanghai　200234)
Abstract　Invasive plant have caused se rious harm to crop p roduc tion, orchards, lawns, na tura l envi-
ronments and biod iversity in Ch ina. Solidago canadensis, a perennial plan t orig inating from North Amer-
ica, was introduced in to C hina in the 1970s. S tud ies on the genetic diversity o f invasive p lant are of
prac tical significance in the predication of their potential distribution areas and their hab itats. Three
me thods we re adopted to ex tract genom ic DNA from the invasive p lant Solidago canadensis. Popula tion
gene tic d iffe rence s of Solidago canadensis from Shanghai and Zhe jiang prov ince w ere analysised using
random amplified polymorphic DNA (RAPD). The results show ed:(1) the me thod of 2 ×CTAB had
be tte r effects than tha t of the improved high-saltme thod and the SDS method to extrac t genom ic DNA
from Solidago canadensis. The DNA samp les extracted by the 2 ×CTAB me thod had better integ rality
and low e r conten t o f pro te in, pheno l and polysaccharide;(2)G enetic po lymo rph ism ofSolidago cana-
densis popula tions w as h igh. Amp lification of 13 random primers revealed 102 amplified fragments of
w hich 84 (82. 35%) we re po lymorph ic and 41 (40. 20%) unique. polymorphic pe rcen tage among 4
popu lations fo llow ed as Shangha i(SH )(73. 13%) > Jiax ing (JX)(68. 97%) >Hangzhou (HZ )
(68. 42%)>Jinhua(JH )(57. 14%);(3) The average homozygo sity(J ) (0. 38) and average he t-
erozygosity(H) (0. 62)were computed;(4) Based on the presence /absence bands, Ne i’ s genotypes-
sim ilary, c luste r and principa l components analysis(PCA)we re analyzed. The results show ed tha th igh-
er genetic diversity existed w ith in Solidago canadensis populations, and the popula tion gene tic d ifferen ti-
ation had corresponding re lation w ith the geog raphical position;(5)The adaptive evo lu tion o fSolidago
canadensis popu lation w as closely linked w ith the charac te ristic of the w eeds.
Key words　 invasive p lant;Solidago canadensis;tota lDNA ex traction;RAPD;genetic diversity
植物外来种入侵威胁着全球的生态环境 、生物
多样性和经济发展 ,我国的外来植物入侵问题也日
益严重 [ 1, 2] 。对外来植物入侵的研究 ,已经成为生
物多样性保护和生态系统恢复研究领域的一个热
点问题 [ 3] 。
外来入侵种加拿大一枝黄花 (Solidago cana-
densis L. )是原产北美洲的菊科一枝黄花属植物 ,
最早作为庭园花卉引种栽培于我国上海 、南京等
地 ,现在已经在我国东部地区归化逸生 [ 4] 。加拿
大一枝黄花以种子和根状茎繁殖 ,繁殖能力强;竞
争力强 ,生长迅速 ,抑制其他植物的生长 ,单优势种
群面积可达几十至百余亩;从山坡林地到沼泽地带
均可生长 ,对生态环境已经造成一定的危害。郭水
良等调查表明 ,加拿大一枝黄花分布于沪宁线 、沪
杭线 、浙赣线沿线地区及浙江台州 、宁波 、丽水等地
区 ,生于城镇庭园 、郊野 、荒地 、河岸 、高速公路和铁
路沿线等处 [ 5] 。
关于入侵种适应性进化的遗传学基础研究 ,对
于认识外来入侵种的适应性机制有重要意义[ 6, 7] 。
物种在不同环境和地理区域中的居群遗传分化可
能是其适应不同环境的方式之一 [ 8] 。外来物种相
对于原产地的基因变异可能预示了这个物种侵占
新的领地的进化潜力 ,遗传多样性显著的外来物种
在新的地区的潜在分布区域可能会大得多 [ 9] 。本
研究以采自不同地区的野外逸生加拿大一枝黄花
为材料 ,采用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术 ,
明确我国华东地区加拿大一枝黄花不同居群的遗
传多样性 ,了解加拿大一枝黄花杂草特性与遗传变
异之间的对应关系 ,以及环境因素对遗传多样性的
影响 ,为进一步分析其进化潜力和重点预防及消除
危害提供重要资料。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
分别采集浙江杭州东郊 、嘉兴乍浦 、金华市郊 、
上海嘉定城北的逸生加拿大一枝黄花居群 。每个
地区设置 2 ～ 3个约 20m ×20 m范围的样方 ,在每
个样方内随机选取 15 ～ 20株植物 ,取其顶端幼嫩
的叶子 , 分别标记装袋 ,带回实验室洗静后置于
- 75℃超低温冰箱中备用。从每个居群中随机选
择 15个样品 ,分别提取总 DNA。加拿大一枝黄花
的居群资料见表 1。
表 1　加拿大一枝黄花 4个居群环境
Table 1　The env ironm ent of four popu lations of Solidago canadensis
居群 Popu lation 生境 H ab its 伴生植物 Companion species
金华市郊 JH 浙江师大南侧的抛荒农田田埂。 Ridges b etw een discad
farm fields on the sou th of Zh ejiang Norm al Univers ity .
北美车前(P lantago a sia tica)、一年蓬(Conyza annum us)、小飞
蓬(Conyza canadensis)、通泉草(Mazus japon icu s)、空心莲子草
(Alterna thera ph iloxeroides)、狗牙根(Cynodon da cty lon)等。
嘉兴乍浦 JX
乍浦镇东南侧靠海边的山坡 , 路边 ,马尾松疏林下。 On
H illside、 road side and under the w ood s of Pinusm assoniana
b es ide the seashore in the sou theas t of Zhapu town.
一年蓬(Conyza annumus)、小飞蓬(Conyza canadensis)、白茅
(Impera ta cylindrica)等
上海嘉定 SH 嘉定城里的路两侧。 Bo th s ides of the some road in Jiad-
ing tow n,
一年蓬(Conyza annum us)、空心莲子草 (A lterna thera ph iloxe-
roides)等
杭州东郊 HZ
杭州火车东站南侧的抛荒建筑工地。 The d iscard Con-
structional field on the sou th of EastH angzhou railw ay sta-
tion.
毛茛(R anun cu lu s japonicus)、一年蓬 (Conyza annum us)、北美
独行菜(Lepid ium virginicum)、空心莲子草(A lterna th era ph ilox-
eroides)等。
198 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
1. 2　总 DNA提取
分别用改良高盐法 , SDS法及 2×CTAB法提
取 。改良高盐法 ,对邹喻苹等 (1994)的高盐法进
行了改进[ 8] 。 SDS法 , 参考王景雪等 [ 10] ,略有改
动 。 2×CTAB法 ,参照 C lark等 (1998)的方法 [ 11] ,
实际步骤如下:(1)取0. 2 ～ 0. 3 g叶子液氮研磨 ,将
粉末移入 1. 5 mL离心管中 , 加 500 μL预热的 2 ×
CTAB (100 mmo l /L Tris-HC l pH 8. 0, 1. 4mo l /L
N aC l, 50mmol /L EDTA pH 8. 0, 2%CTAB , 3%β-
巯基乙醇 )和 100μL PVP ,充分混匀 。 (2)65℃水
浴 40m in,不时轻颠混匀。待冷至室温 ,加入等体
积氯仿 /异戊醇 ,轻颠混匀 ,然后4℃ 5 000 r /m in离
心 5m in,取上清加入等体积氯仿 /异戊醇第二次抽
提 。 (3)取上清 ,加 4 μL浓度为 50 μg /mL的 Rnase
A贮液 , 37℃保温 1 h。 (4)加入0. 7体积的异丙醇 ,
仔细混匀 , 4℃静置 2 h后 10 000 r /m in离心 10 m in
去上清 , 加入 700 μL 76%乙醇和 50 μL 3mo l /L
N aAc ( pH 5. 0 ), 冰 上 静 置 20 m in。 ( 5 )
12 000 r /m in离心 10m in取沉淀 ,用 70%乙醇洗涤
两次 ,空气干燥15m in后 ,加 100 μL TE(10 mmo l /L
Tris-HC l pH 8. 0, 1mmol /L EDTA pH 8. 0)溶解
DNA , - 20℃保存备用。
1. 3　基因组 DNA浓度和纯度检测
用 Pharmacia B io tech U ltrospec 4000系统测定
紫外光吸收以确定提取的总 DNA浓度和纯度 ,样
品浓度 (ng /μL) =OD260 /0. 02 ×稀释倍数;1. 0%
含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳 ,观察判断 DNA完
整性。
1. 4　引物筛选及 RAPD反应条件优化
本实验所用 70个 10碱基随机寡核苷酸引物
和 PCR Bu ffe r、dNTPs及 Taq酶均为上海生工生物
工程公司产品。任取一个模板 ,对所有引物做筛
选 ,从中选出扩增条带清晰 、重复性好的引物用于
正式扩增。
RAPD-PCR在 Thermo Hybaid公司生产的 P ×
2型 PCR扩增仪上进行。 PCR运行程序如下:
94. 0℃预变性 5 m in, 然后每个循环 94. 0℃变性
1 m in , 36. 0℃退火 1m in, 72. 0℃延伸 1m in 40s,共
45个循环 , 最后于 72. 0℃继续延伸 5m in。 25 μL
反应体系组成如下:10×PCR Buffer 2. 5μL;MgC l2
(25mmo l /L) 2μL;Taq DNA 聚合酶 (5 U /μL)
0. 2μL; dNTPs ( 10 mmo l /L ) 1μL; 引 物
(10 ng /μL)2μL;模板 DNA(50 ng /μL)1μL;超
纯水 16. 3μL,石蜡油 20 μL封液 。在此基础上分
别设置 Mg2+、引物 、Taq酶及 dNTPs浓度梯度 ,进
行 PCR扩增 ,至少重复 3次 ,比较扩增效果。
1. 5　RAPD-PCR及检测
选取 13个引物按照最佳反应条件对四个居群
的加拿大一枝黄花基因组进行 PCR扩增。扩增产
物以 λDNA /E coRI+H ind Ⅲ (上海生工 )作为分子
量标准 , 在 1. 4%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶
(5V /cm)中电泳分离 。最后在电泳凝胶成像系统
上观察多态性并记录 、拍照。
1. 6　数据统计分析
1. 6. 1　RAPD原始数据矩阵
PCR扩增反应进行至少 2次重复 ,按凝胶同一
水平位置上可重复 DNA带的有无进行统计 ,有带
(包括强带和弱带)的记为 “1”,无带的记为 “0”。
1. 6. 2　多态位点比率
在某一特定位点上 ,若扩增片断出现的频率小
于0. 99,则此位点称为多态位点。多态位点比率
(PPS)即在检测位点中多态位点所占的比例:PPS
=N i N/ 。其中 , N i表示第 i个居群的多态位点个
数 , N表示总的位点数。
1. 6. 3　平均纯合度和平均杂合度
一个位点的纯合度和杂合度分别定义为 J =
∑ X i2 ,H =1 -∑ X i 2。X i 表示第 i等位基因的频
率。平均纯合度 (J)和平均杂合度(H)则是全部位
点测定值的平均数 [ 12] 。
1. 6. 4　基因相似系数 (genotypessim ilary)和遗传
距离
根据 N ei和 Li(1978)提出的基因相似系数
(F )和 遗 传 距 离 (D )计 算 公 式:F =
2Nxy /(N x+Ny),D =1 -F。式中:N xy为 X 和 Y
扩增的共享片断数;Nx和 Ny为 X 和 Y 扩增的总
带数 [ 13] 。
1. 6. 5　聚类分析与主成分分析
应用 SPSS10. 0统计软件 ,采用基于 Jaccard系
数矩阵的组间连接法 (Be tw een-groups linkage) ,对
RAPD表型数据矩阵进行聚类分析。
2　结果与分析
2. 1　三种总 DNA提取方法的比较
SDS法提取时 ,所得上清较为粘稠 ,虽经氯仿
反复抽提 ,仍很难除去;DNA沉淀较难溶于 TE缓
冲液 。改良高盐法电泳检测有拖带 ,点样孔处有多
糖 ,干扰扩增 ,使扩增片段较为模糊。 2×CTAB法
得到的 DNA具有较好的完整性 ,带型较为清晰 、整
1992期 黄华等:外来入侵植物加拿大一枝黄花居群间遗传差异分析
齐 ,而高盐法和 SDS法的 DNA均有不同程度的降
解 ,拖带现象也比较明显 (见图 1)。三种 DNA提
取方法产物质量比较见表 2。结果表明 , 2×CTAB
法获得 DNA的产量较高 ,蛋白质 、多糖等杂质较
少 , DNA的纯度较高;加入巯基乙醇和 PVP等抗氧
化剂后 ,提取液颜色较绿 , DNA沉淀为白色或略带
颜色;若不加抗氧化剂 ,则保温后提取液呈黄褐色 ,
DNA沉淀为褐色或浅褐色 ,电泳检测杂质较多 ,
OD比值低。由此可见 , 2×CTAB法是比较理想的
提取加拿大一枝黄花总 DNA的方法。据此 ,采用
2×CTAB法提取的 DNA用于 PCR反应 ,所得 4个
居群的 DNA吸收值及浓度见表 3。
表 2　三种提取方法的 DNA产物质量比较
Table 2　Compare of the DNA quality extrac ted
by th ree me thods
改良高盐法
Im proved h igh-slat
method
SDS法
SDS
m ethod
2×CTAB法
2×CTAB
m ethod
DNA产量
DNA produ ction(ng /m g) 235. 8 208. 0 367. 6
OD 260 /OD 230 1. 537 1. 013 2. 162
OD 260 /OD 280 1. 614 1. 533 1. 980
表 3　加拿大一枝黄花四个居群的 DNA吸收值及浓度(用 2×CTAB法)
Tab le 3　The ultravio let absorb va lue and the concentra tion o fSolidago canadensisDNA (ex trac ted by 2×CTAB me thod)
居群 Popu lat ion A 230 A 260 A 280 A 260 /A 230 A 260 /A 280 浓度 Concen tration(ng /μL)
金华 JH 0. 351 0. 754 0. 380 2. 151 1. 984 754
嘉兴 JX 0. 233 0. 472 0. 246 2. 026 1. 919 472
上海 SH 0. 373 0. 851 0. 418 2. 282 2. 051 851
杭州 HZ 0. 287 0. 599 0. 305 2. 087 1. 964 599
图 1　用三种方法提取的植物总 DNA电泳图谱
1.改良高盐法;2. SDS法;3. 2×CTAB法
F ig. 1　Elec trophores photograph o f
DNA ex tracted by three m ethods
1. Imp roved high-s latm ethod;2. SDS m ethod;3. 2×CTAB m ethod
2. 2　RAPD反应条件的优化
M g
2 +浓度 2 ～ 3 mmo l /L之间可以得到扩增带 ,
但 2mmol /L时带型更整齐 ,清晰 ,无拖带现象 (图
2A)。引物浓度较低 (0. 3 ～ 0. 6 μg /mL)时 ,扩增
带数量较少且不清晰 , 0. 8 μg /mL的引物浓度能扩
增出比较理想的带型 (图 2B)。 25 μL反应体积
中 , 0. 5 U的酶量使扩增不充分 ,条带少;酶量 2 ～
2. 5 U,条带较亮 ,数量也有所增加 ,但带型有失真 ,
图 2　M g2+浓度和引物浓度对 RAPD反应的影响
(M arker:λDNA /E coRI+H indⅢ )
F ig. 2　Effe ct ofM g2+ and prim e r concentration on
RAPD amp lification
1 ～ 4. 0. 5, 1. 0, 2. 0, 3. 0 mm o l /L;
a ～ e:0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6, 0. 8 ng /μL
拖带现象也明显;1 ～ 1. 5 U酶量效果较好 ,条带清
晰可辨(图 3A)。 dNTPs浓度在 0. 2 ～ 0. 4mmo l /L
之间均能得到较好的扩增 ,其中0. 4 mmo l /L效果最
佳(图 3B)。
2. 3　RAPD扩增带的多态性
1)4个居群 13个引物扩增带的带型数据　筛
选出的 13条引物在 4个加拿大一枝黄花居群的
200 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
图 3　Taq酶用量和 dNTPs浓度对 RAPD反应的影响
(M arker:λDNA /E coRI+H indⅢ )
F ig. 3　E ffec t o f Taq DNA po lym erase and dNTPs
concen trition on RAPD am plifica tion
～ 5:0. 5, 1, 1. 5, 2, 2. 5U;a ～ e:0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 8, 1. 2mmo l /L
DNA模板中共检测到 102个扩增片段 ,单态性带
18条 ,多态性带 84条 , 多态位点百分率 (PPS)
82. 35%。最少的在引物 S323中得到 3条带 ,最多
的在引物 S333中得到 11条带 ,平均每个引物产生
了约 8条带;13个引物所扩增的 4个居群 RAPD
位点数及多态位点百分数见表 3。扩增带的大小
在 564 ～ 5 148 bp之间 , 其中大多集中在 564 ～
3 530 bp。引物 S339及 S340的扩增结果见图 4。
2)居群间的基因平均纯合度和杂合度　每个
引物检测出来居群间的基因平均纯合度不同 ,范围
图 4　加拿大一枝黄花四个居群的 RAPD带型
a.引物 S339, b.引物 S340 (M ark er:λDNA /E coRI+H indⅢ )
F ig. 4　RAPD profiles o f 4 populations o fSolidago canadensis
a. p rimer S339, b. p rim er S340
在0. 17 ～ 0. 57之间;13个引物检测的平均纯合度
(J)为0. 38,平均杂合度 (H )为 0. 62(表 3)。实验
结果说明 ,加拿大一枝黄花的基因多样性较大 。
3)不同居群的多态性带和特有带　不同居群
加拿大一枝黄花 DNA模板对引物的扩增结果表现
不一致 ,如金华居群的扩增条带数比上海嘉定居群
的扩增条带数少 25条 。居群之间的多态性比例分
别为上海嘉定(73. 13%)>嘉兴乍浦 (68. 97%)>
杭州 (68. 42%)>金华 (57. 14%)(表 4)。 4个居
群间两两比较 ,嘉兴—杭州 ,嘉兴 —上海之间单态
表 4　RAPD所用的引物 、扩增结果及平均纯合度和平均杂合度
Table 4　P rim ers used for RAPD and amp lified bands, average hom ozygosity and average heterozygosity
引物
Prim ers
碱基序列
Sequen ce
(5′→3′)
扩增出带数
Number of
am plif ied band s
多态位点数
Number of
m onomorph ic sites
多态位点百分率(%)
Percen tage of
po lym orph ic sites
平均纯合度 J
Average
hom ozygosity
平均杂合度 H
Average
heterozygosity
S307 GAGCGAGGCT 6 5 83. 33 0. 33 0. 67
S313 ACGGGAGCAA 7 5 71. 43 0. 57 0. 43
S320 CCCAGCTAGA 4 3 75. 00 0. 47 0. 53
S323 CAGCACCGCA 3 3 100 0. 46 0. 54
S324 AGGCTGTGCT 10 7 70. 00 0. 46 0. 54
S331 CTCAGTCGCA 7 6 85. 71 0. 25 0. 75
S333 GACTAAGCCC 11 8 72. 73 0. 43 0. 57
S337 CCTTCCCACT 10 10 100. 00 0. 30 0. 7
S338 AGGGTCTGTG 9 6 66. 67 0. 56 0. 44
S339 GTGCGAGCAA 8 7 87. 50 0. 37 0. 63
S340 ACTTTGGCGG 7 5 71. 43 0. 53 0. 47
S344 CCGAACACGG 10 10 100. 00 0. 17 0. 83
S360 AAGCGGCCTC 10 9 90. 00 0. 24 0. 76
总计 Total 102 84
平均值 Average 7. 85 6. 46 82. 35 0. 38 0. 62
2012期 黄华等:外来入侵植物加拿大一枝黄花居群间遗传差异分析
表 5　加拿大一枝黄花 4个居群 RAPD特有带
Table 5　RAPD peculiar bands of S. canadensis from 4 populations
居群
Popu lation
总带数
Total band s
多态性带数
M onom orphic bands
多态性百分率(%)
Percen tage of polym orph ic sites
特有带
Peculiar b ands
特有带百分率(%)
Percen tage of pecu liar bands
金华 JH 42 24 57. 14 3 7. 14
嘉兴 JX 58 40 68. 97 7 12. 07
上海 SH 67 49 73. 13 18 26. 87
杭州 HZ 57 39 68. 42 13 22. 81
表 6　各居群间单态片断数 、片段总数及多态性比例(%)
Tab le 6　The numbe rs o f the sha red fragments and the tota l num be rs
o f fragm en ts, po lymo rphic pe rcen tage am ong 4 popula tions
居群
Popu lation
金华 JH 嘉兴 JX 上海 SH 杭州 HZ
金华 JH 0 55. 07 63. 75 62. 50
嘉兴 JX 31 /100 0 52. 94 52. 56
上海 SH 29 /109 40 /125 0 57. 47
杭州 HZ 27 /99 37 /115 37 /124 0
图 5　基于 Jaccard数据矩阵,应用组间连接法法聚类构建的
4个加拿大一枝黄花种群的遗传树系图
F ig. 5　Gene tic dend rogram by using be tw een-g roups linkage
a lgo rithm to cluster Jaccard coeffic ien tm atrix
性带数较多 ,多态性比例较低 (表 5)。根据 13个
引物在 4个加拿大一枝黄花居群 DNA的扩增带 ,
其中特有带 41条 ,占总带数的 40. 20%。每个居群
的特有带百分率见表 4。
2. 4　基因相似系数矩阵和聚类分析 、主成分分析
居群间的 RAPD片段共享度(即遗传相似度)
能够在一定程度上反应居群间 DNA的差异。根据
N ei和 Li(1979)的基因相似系数公式 ,得出加拿大
一枝黄花四个居群之间的N ei基因相似系数矩阵
表 7　四个居群之间的 Ne i遗传相似系数和遗传距离
Table 7　Geno typessim ila ry and gene tic distance
am ong 4 popula tions
居群
Popu lat ion
金华 JH 嘉兴 JX 上海 SH 杭州 HZ
金华 JH 1 /0
嘉兴 JX 0. 620 /0. 380 1 /0
上海 SH 0. 532 /0. 468 0. 640 /0. 360 1 /0
杭州 HZ 0. 557 /0. 443 0. 644 /0. 356 0. 597 /0. 403 1 /0
图 6　基于 RAPD表型数据的 4个加拿大一枝黄花
种群遗传分化 PCA三维排序图
F ig. 6　PCA th ree-dim ensiona l ord ination of p lo t of
4 popula tions based on the RAPD pheno type data
(F),由 N ei基因相似系数可以得到遗传距离矩阵
(D =1 -F),见表 6。结果显示 ,遗传相似系数介于
0. 532 ～ 0. 644之间 ,遗传距离最大的是 0. 468(金华
和上海居群),最小的是 0. 356(嘉兴和杭州居群 )。
图 5显示 , 4个居群间存在一定的遗传分化 ,大
体可分为 2个分支:嘉兴乍浦 、杭州和上海嘉定的
加拿大一枝黄花居群的遗传距离相对较近 ,形成一
个分支;金华的加拿大一枝黄花居群独立构成另一
202 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
分支。基于 RAPD分析得到的表型数据 ,对 4个居
群的加拿大一枝黄花遗传分化进行主成分分析
(PCA)排序得到图 6。嘉兴 、杭州 、上海三地都处于
长江三角洲地区 ,地理位置靠得很近 ,遗传距离相
差不大 ,在聚类树系图上的位置也比较接近;而金
华处于浙中地区金衢盆地 ,因此与前三者相比 ,遗
传差异就比较大 。 PCA三维图也反映出了 4个居
群在遗传上有明显的分化 ,并且与聚类分析的结果
一致。从采样地点的主要区别来看 ,居群间的相对
地理距离是影响加拿大一枝黄花居群遗传分化的
主要原因 ,这也是与生物地理学相符的。
3　讨论
3. 1　基因组总 DNA提取
加拿大一枝黄花细胞中有较高含量的酚类 、多
糖类等物质 ,提取时极易褐变 。多糖类物质浓度高
时 ,常使 DNA提取物呈胶状 ,同时还影响分光光度
法对核酸的定量分析;酚类物质会影响 DNA聚合
酶等活性[ 11] 。本文通过实验比较改良高盐法 、SDS
法和 2×CTAB法 ,认为 2 ×CTAB法比较适合菊科
外来种加拿大一枝黄花等多糖和酚类含量较高的
植物材料的总 DNA提取。此法对于新鲜材料或经
脱水处理的材料均适用 ,所得模板 DNA平均长度
大于 20Kb;在提取液中加入了巯基乙醇和 2%
PVP,使褐化现象得到了解决;Adams (1993)认为
RNA的存在并不影响 RAPD ,而蛋白质存在却有强
烈的抑制作用[ 14] ,改良高盐法和 SDS法所提 DNA
的 A 260 /A 280分别为 1. 614和 1. 533,蛋白质残存较
多 。纯度较高的 DNA ,其 A 260 /A 230应在 2. 0以上 ,
A 260 /A 280应在 1. 8 ～ 2. 0之间 [ 8] ,本文采用的 2 ×
CTAB法提取的 DNA A260 /A230为 2. 026 ～ 2. 282,
A 260 /A 280为 1. 919 ～ 2. 051(表 2),说明所提的 DNA
中蛋白质 、酚类 、多糖等杂质去除得比较干净 ,提取
时残留的氯仿 、乙醇等已基本除去。本实验中的 2
×CTAB法直接用氯仿 /异戊醇进行抽提 ,同时避免
了传统的 CTAB法由于苯酚去除不干净而影响扩
增效果 。
3. 2　一枝黄花的 DNA多态性和平均杂合度
DNA多态性和平均杂合度都是遗传多样性的
一种度量方式。 Ne i[ 12]认为 ,前人关于多态位点比
例的定义有些武断 ,平均杂合度比多态位点比例更
适合于测定基因的变异。多态位点在统计时 ,扩增
片断出现的频率小于 0. 99即可 ,但是平均杂合度还
考虑在 i等位基因的具体频率 ,这就是两者出现差
异的原因 。事实上 ,在居群或样方数更多的时候 ,
这种差异可能会越大 ,这时用平均杂合度来衡量基
因的变异程度更为可取 。 Nei在 1973年将其提出
的平均纯合度 (J)改称为 “基因一致性” ,称平均杂
合度(H)为 “基因多样性 ”。本文中 13个引物检测
的 4 个 加拿大 一枝 黄花居 群 DNA 多态性
(82. 35%)、基因一致性 (0. 38)和基因多样性
(0. 62)都说明其遗传分化程度较高 。
3. 3　4个居群遗传分化程度与生物地理学的对应
关系
聚类图和主成分分析图上可以直观地判断嘉
兴和杭州 、上海的加拿大一枝黄花居群间的遗传差
异相对较小 ,与金华的居群遗传差异较大 ,这个结
论与生物地理学是一致的。金华与嘉兴 、杭州 、上
海三地相隔较远 ,但是这四个地方均通过沪杭线 、
浙赣线等铁路相连 ,加拿大一枝黄花目前的分布地
主要为铁路沿线地区 ,因此 ,浙沪地区加拿大一枝
黄花居群极有可能是一个连续的大居群。
从各居群两两之间的 RAPD多态性比例和遗
传距离矩阵来看 ,嘉兴和上海 ,嘉兴和杭州的加拿
大一枝黄花居群之间的多态性比例最低 ,遗传距离
最近;同时 ,上海和杭州之间的居群遗传差异又要
稍大一些 。其原因很可能是原本分布于长江三角
洲的一个大居群 ,由于上海和杭州均为大城市 ,交
通 、人流 、经济等均比嘉兴要发达得多 ,在外界众多
因素的干扰下外来植物适应性进化的速度要比环
境相对封闭的地方快得多 。同时 ,也由于上海和杭
州城市发展程度的差异 ,致使上海和杭州之间的居
群差异要比嘉兴与这两地的差异大一些。
3. 4　加拿大一枝黄花种群遗传差异与杂草特性的
对应关系
外来杂草在遗传上的适应性进化能使之更适
应和充分利用当地的环境条件 ,最终在竞争中占据
主导地位而得以扩散 。外来入侵种的适应性进化
主要通过遗传漂变 (gene tic drift)、加性遗传变异
(add itive gene tic variance)、杂交 (hybridiza tion)、基
因交换(genetic tradeoff)、少数基因行为 ( the action
o f sma ll numbe r of gene)以及基因组重排 (genom ic
rearrangemen t)等实现 [ 15] 。遗传漂变要在种群中达
到遗传均一性而固定下来 ,前提是这个种群不能太
大 ,而且突变的新等位基因是无害的[ 16] 。加拿大
一枝黄花因为种子数量可以达到 2万多粒 /株 ,而
且根据实验室培养发现其发芽率在 30% ～ 40%左
右 ,地下根茎横向扩展的无性繁殖力较强 ,在野外
2032期 黄华等:外来入侵植物加拿大一枝黄花居群间遗传差异分析
易形成相对独立的种群 ,因此 ,加拿大一枝黄花在
适当的机会中产生遗传漂变是可能的 。加拿大一
枝黄花由于花色鲜艳 ,数量繁多 ,为其虫媒传粉的
昆虫种类很多 ,这为其种内及和本地杂草的种间基
因交流提供了条件 ,从而在一定程度上改变其遗传
组成。已有报道表明 ,加拿大一枝黄花能够与假蓍
紫菀(Aa ter ptarm icoides)杂交[ 17] 。由于加拿大一枝
黄花的繁殖特性和沿交通线的分布特点 ,浙沪地区
加拿大一枝黄花种群有可能是一个连续的大种群 ,
但是 Silvertown[ 16]认为 ,通过距离分隔 ( iso lation by
distance)也可以使原本空间上连续的种群产生遗
传结构 。杂草化的植物一般都具有较宽的生理生
态耐受性或可塑性 ,来自环境变化的选择压力使其
不断地驯化 (acclim ation)和适应 (adaptation),从而
导致结构和功能上可遗传的改变 。加拿大一枝黄
花对土壤质地 、酸碱度 、盐浓度以及环境温度等均
有较大的耐受力 [ 5] 。因此 ,加拿大一枝黄花和其他
杂草一样比木本植物和非杂草植物具有更高的遗
传分化程度 。
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