全 文 ：第 2 3卷 第 2 期
V o l
.
2 N 3 o
.
2
植 物 研 究
B L UL ET N I OF B OT AN IC AL R E S E AR CH
20 3年
AP r i l
,
4 月
2 0 0 3
发根农杆菌介导几丁质酶基因和
p 一 1
,
3 一葡聚糖酶基因转化烟草的研究 ’
张彦妮 ` 曲 敏 2 徐香玲 , ’ * 李新玲 3
( 1
. 东北林业大学园林学院 ,哈尔滨 巧的叨
( 2
. 黑龙江省旅游学校 ,哈尔滨 15X() 86 )
( 3
. 哈尔滨师范大学生物系 ,哈尔滨 150 50
摘 要 用冻融法和三亲交配法将具有几丁质酶基因 、 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因和卡那霉素杭
性标记基因的质粒 p BGL C 导入具有 iR 质粒的发根农杆菌中。 用叶盘法转化烟草的三个品种 ,
经 K a n 杭性筛选获得 126 株再生植株 ,对 1 19 株再生植株分别 以启动子 C a MV 35 S 、 儿丁质酶基
因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因的引物进行 P CR 检侧 , 其中几丁质酶基因呈阳性的植株有 72 株 ,
p 一 1
,
3 一 葡聚糖酶基因呈阳性的有 47 株 , 具有几丁质酶基因和 日一 l , 3 一 葡聚糖酶基因的植株
有 36 株 。 对转化的 24 株转基因经 P C R 一 S o u ht e m 杂交 , 结果均呈阳性 。 实验结果表明 , 外源
基因的转化频率与植物品种 、 外源基因片段的大小有关 ,几丁质酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基
因分别或共同整合到植物基因组中。
关键词 发根农杆菌 ;烟草 ;叶盘法 ;几丁质酶基因 ; p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因
T H E S T U D Y O N A G R O B A C T E R I双材
双丑伦O G E N E S M E D L A T E D C H l rf 引呵A S E A N p
p 一 1
,
3 一 G L U C A N A S E T R A N S F O RM A IT O N F O R T O B A C C O
z H A N G Y a n 一 N i , QU M i n Z X U ix an g 一 u n扩“ 1 X i n 一 u n g ,
( 1
.
C o ll e g e 成 L厄n ds e aP e , NO rt h e as t F o r e st U in v o iyt , Habr in 15 (协帕 )
( 2
.
oT u ir
s
m cS ho l Of eH ilon 百i a n g P vor i n e e , H a ht i n 15X() 8 6 )
( 3
.
eD PaI’t me nt of B i ol o gy , H abr in N o mr al U n i ve 招 iyt , Habr in 15X() 80 )
A b s t r a c t hT
e p l a s m id p B GL C w h i
e h e o n s t a i n e d e h i t in a s e 罗 n e a n d p 一 l , 3 一 gl u e a n a s e 罗 n e an d
N TP
一 11 g e n e ( er s i s atn is
n g kan
a m y e i n ) w
a s
atr
n s fo mr
e d i n ot Ag or b
acet
ir u m hr 招O g e o w iht or
t 一 i n -
d u e i n g p las m i d b y
u s i飞 fer e z e 一 ht aw m e ht o d a n d itr v a er n at l e or s s i n g m e ht o d . Ch i it n a s e 罗 n e an d p
一 l , 3 一 gl u e a n a se g e n e w e er p l a e e d u n d e r ht e c o n tor l o f ht e C a u l i fl o w e r M o s a ie V iur s 3 5 5 Po mo et
r
a n d i n 加记 u e e d i n ot ht r e e v iar e t ie s o f ot b a e e o b y A g or ba e et ir u m kr g o g e esn m e d i a t e d l e af 一 P la t e d atr n s
-
fo n 力 a t i o n m e ht ed
.
12 6 邝g e n e ar t e d Plan t s w e er s e l e e t e d b y aK n a m y e i n
.
Am o n g t h e m
,
1 19 P lan st hva
e
b e e n t e s t e d b y 355
, e h i ti n a s e g e n e a n d p
一 l , 3 一 g l u e an a s e g e n e p ir me
r se p a ar tly ht or
u
hg p CR
e l e e
-
t哪 h o er s i s a s s盯 , Of w h i e h 7 2 P la n t s s h o w e d e h i ti n a s e g e n e p o s i it v e , 4 7 日一 l , 3 一 gl u e a an s e 罗 n e
· 第一作者简介 : 张彦妮 ( 197 4 e ) ,女 ,在读博士 , 主要从事植物基因工程及花卉育种方面的研究。
收稿日期 : 20 2 一 12 ~ 30
* * 通讯作者。
2 期 张彦妮等 :发根农杆菌介导几丁质酶基因和 p一 1, 3 一 葡聚糖酶基因转化烟草的研究
p o s t iv e an d 3 6 P o s t i v e p l a n t s e o n ta i n i n g b o t h e h i ti n a s e g e n e a n d p 一 l
,
3 一 g l u e a n a s e 罗 n e . hT e tarn s
-
fe ir n g fer q
u e n e y of fo er i , g e n e h a s er l a ti o n w i th p la n t v a ir e yt a n d th e l e n hgt
o f fo er i , g e n e
.
Ch i t i
-
n
as
e g e n e s e e m e d t o i n h e ir t e a s i e r ht a n p 一 l
,
3 一 gl u e a n a s e g e n e
·
24 p l
a n t s a
mon
g P C R p o s i ti
v e
p l a n ts h a v e b e e n e a币 e d o u t b y PC R 一 S o u ht e m . hT e r e s u l t w a s th a t th e y s h o w e d p o s i ti v e . hT e s tu dy
i n d i e a t e d e h i ti n a s e g e n e a n d p
一 l , 3 一 gl u e a n a s e g e n e er s p e e t i v e ly o r ot g e ht e r i n tr ed u e in g a n d e o i n t e
-
gar
ti n g i n t o p l a n t g e n e n o m e
K e y wo
r ds A g or ba e r e ir u m kr g o g e esn
; tob a e e o : le a f 一 m e d i a te d m e ht o d : e h i it n a s e g e n e ; p 一 l
,
3 -
g l u e a n a s e g e n e
植物真菌病害一直是农业生产的大敌 , 近年
来 , 随着分子生物学的发展和完善 ,利用植物转基
因技术方法 ,培育抗真菌病作物品种已成为可能 。
几丁质酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因因其可
催化绝大多数真菌细胞壁的主要成分几丁质和 p
一 1 , 3 一 葡聚糖水解 , 而在开展作物抗真菌病基因
工程中有着广泛的应用 。 同时 ,抑菌实验表明几
丁质酶特别是在 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶的协同作用
下可增强抑制真菌的生长 。 烟草是一种重要的经
济作物 , 但真菌病害的侵染严重地影响了烟叶的
产量和质量 。 每年 ,世界上因真菌病害的发生而
导致烟草经济效益损失严重 ,其中赤星病是烟草
的主要真菌病害 ,具有间歇性和爆发性的特点 ,在
世界各烟草产区均有发生 ,是烟叶生产上威胁最
大的病害 。 本文以 iR 质粒为介导 ,将几丁质酶基
因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因导人烟草 , 以提高烟
草的抗真菌病害特性 ,改良烟草品种 ,拓宽烟草种
质资源 , 同时为研究相关的理论奠定一定的基础 。
材料
1
.
1 植物材料烟草品种 3K 26 、 R G l l 、 3K 58 , 由黑
龙江省牡丹江烟草研究所提供 。
1
.
2 质粒和菌种
具有抗性标记 N盯 一 n 基因 、 几丁质酶基因
和 p 一 1 一 3 葡聚糖酶基因的质粒 p B LG C 由中科
院遗传研究所提供 , 发根农杆菌 p IR 4A b ( lR o o)
由日本筑波大学遗传子研究中心镰田博先生惠
赠 。 E . e o l iD H S 和 H B 10 1 ( p RKZ O1 3 ) 由哈尔滨师
范大学遗传实验室提供 。
柳刀互 」 田男
BL 氏 。 B蔽, R简T 竺
~不竺竺月
H
J
Q
PBGL C
甘 1 .N0 3 才卜卜
U T 孙 BR
图 l 日一 l , 3 一 葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体 p BI GC
F ig
.
] hT e
e o
nt ur e t e d e hart Of do
u b l e p l an t
e x p er s s in g e而 e r of p 一 l , 3 一 gl u e an as e 罗 n e
的构建图谱
叨d e h i t in a s e ge n e
2 转化方法
用三亲交配法和冻融法将 p B L GC 质粒 (具有
几丁质酶基因和 p 一 1 一 3 葡聚糖酶基因及卡那
霉素抗性标记基因 ) 转人发根农杆 菌 pRI Ah4
( R 10的 )中 。 组织培养获得烟草无菌苗 , 用叶盘
法转化烟草 。
3 检测方法
3
.
1 转化子的检测
将转化的农杆菌和未转化的农杆菌接种于加
有 S Om岁 L 卡那霉素和 SOm酬 L 链霉素的 Y E B 固
体培养基上 ,观察菌落生长情况 。 然后对初步认
为是转化子 的菌落采用碱裂解法提取质粒 D NA
并进行 P C R 扩增 (设有阴性对照和阳性对照 ) 。
植 物 研 究 2 3卷
启动子 CaMV 35 S的引物 :
引物 l : 5’ G CAT G GT G GA A G G CA A G CA G 3’
引物 2 : 5’ T C GA GA GGT G AC AA G GT CA G 3’
以几丁质酶基因的引物进行 P CR扩增 :
引物 l : 5’ G CAT G GT GG A A G GC AA G CA G 3’
引物 2 : 5’ T C G A GA G GT G A CA A GT G C AG 3’
以 一 1、 3葡聚糖酶基因的引物进行 P CR扩
增 :
引物 l : 5’ GC G GAT C CG A C CT A G G CT GCT AT -
CA CA CT GC 3
’
引物 2 : 5’ CGGT CG A CCT CA CT A CT C A C手
T AC G AG A 3
’
反应体系 : H 2 0 2 0 .2 5林 L
10bx
u
e f
r 2
.
5林 L
引物 0 1.2 5协 L (0 . 5林 mol )
引物 2 0 .2 5林 L (0 . 5林 mol )
d NPT 0
.
5林 L (0
.
Z m m ol )
T a q2 E
.
S U
模板 1卜 L
反应总体积 2 5林 L
反应条件 : 4 9℃预变性 s mn i
9 5℃变性 0 3 5
8 5℃ 一 62℃复性 l m in
72 ℃延伸 l m in
4 3个循环后延伸 s mn i
P R c扩增产物用 0 .8 %琼脂糖凝胶电泳检
测 。
3
.
2 转基因植株的检测
将转化的叶片和未感染的对照叶片分别放在
加有 l o m以 L卡那霉素和 s o m酬 L梭节青霉素
诱导芽的 M S培养基上 ,诱导愈伤组织 , 经分化培
养和生根培养得到再生植株 。 用 CTA B 法小量提
取转基 因植株 的植物总 DN A 。 以转基因植株
DN A 为模板 ,分别以启动子 C a MV 35 S 、 几丁质酶
基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因两端的序列为引
物进行 P C R 扩增 。 然后对转基因植株进行 P CR
一
oS
u ht e m 杂交检测 。
PC R 扩增的反应条件及反应体系同前 。
4 实验结果
4
.
1 转化子的检测
用冻融法与三亲交配法转化发根农杆菌 ,转
化 2 天后 ,在含有 K a n 的 Y E B 固体培养基上有单
菌落出现 , 对照平板上无菌落出现 。 初步证明
BP LGC 质粒导人发根农杆菌中 。 冻融法转化频
率高于三亲交配法 。 因此 ,在进行质粒转化时 ,应
首先考虑冻融法 。 另外在进行质粒转化的过程
中 ,感受态细胞的制备是转化成败的关键 。 从转
化的发根农杆菌中提取质粒 DN A ,进行琼脂糖凝
胶电泳检测 ,结果转化子 D N A 的大小与阳性对照
质粒 D N A 的大小一致 , 均为 17kb 。 说明质粒
DN A 导人发根农杆菌中。 用启动子 aC M V 35S 、 几
丁质酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因的引物分
别对转化质粒 D N A 进行扩增 , CP R 扩增产物进行
琼脂糖凝胶电泳检测 , 结果扩增产物的大小与 目
的基因的大小一致 , 分别约为 0 . 6 kb , 0 . 9 9 kb , 1 .
I kb
, 结果证明发杆农杆菌是转化的发根农杆菌 。
4
.
2 转基因植株的检测
4
.
2
.
1 不定芽的 k an 抗性筛选
感染的烟草叶片培养 1 周后 , 叶片膨大 、 变
硬 , 2 周后 ,在叶片边缘或其他受伤部位出现小突
起的愈伤组织 , 3 一 4 周后 ,从愈伤组织中诱发出
一些芽及少数毛状根 ,而未经农杆菌侵染的叶片 ,
没有愈伤组织形成 , 逐渐由绿变黄 、 变白 ,最后枯
死 (转化结果见图 2 ) 。 经实验认为 , 用 l o m岁 L
的 K an 浓度筛选抗性芽是有效的 , so % 以上的诱
导芽可在生根培养基上生根 ,这些根粗壮 ,而对照
植株的再生根细而多 , 可能是由于 iR 质粒 T -
DNA 上的生长素基因整合到植物基因组后导致
植物的内源激素发生变化而引起的。
4
.
2
.
Z iR 质粒转化再生植株特征
绝大部分再生植株生长健壮 ,大部分植株开
花少 , 结实率低 。 其中有两株在外形上发生了明
显的变化 ,植株矮化 , 叶片皱缩 ,顶端优势减弱 ,节
间缩短 , 花粉大多败育 ,结实率低 。 这些特征是
iR 质粒转化植株的形态特征 。 其原因可能与 iR
质粒的 T : 一 DN A 上的 or 认 , olr B ,以 C 基因位点有
关 。 另有 4 株转基因植株在外形上虽无太大变
化 ,但对蚜虫有明显的抗性 。 这与以前的报道相
同川 。 在温室中大部分转化植株在不同程度上
受蚜虫危害 ,而这几株植株却未受影响 , 它们用几
丁质酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因的引物进
行 PCR 检测均现阳性 ,抗虫活性的增加可能是几
丁质酶基因或者是几丁质酶基因和 p 一 l , 3 一 葡
聚糖酶基因协同作用的结果 。 转化结果见表 1。
2 期 张彦妮等 : 发根农杆菌介导几丁质酶基因和 p一 1, 3 一 葡聚糖酶基因转化烟草的研究 2 0 1
图 Z a 用于转化的叶片 ; b 对照叶片在培养 3 一 4 周后 ;c 转化叶片在培养 3 一 4 周后 。
Fi g
.
Z
a , 玩 af us e d t o b e antr
s fo mr
e d ; b
,
C o n tor n e d l e af hw i
e h has b e e n e ul t u er d fo r th er e o r fo u r w e e k s ;
e ,
T
r a n s fo nr l e d le af w h i e h h a s b e e n e d t uer d fo
r th r e e o r fo u r we
e
k
s
.
表 1 烟草三个品种的转化
T
a bl e 1 t r a l l s fo mr
a t i o n fo r t h r e e v a d e t ie s of t ob
a e e o
烟草品种
V面 e t i e s o f
tob ac e o
感染叶盘数 (片 )
N u m b e sr of
infe
e tde l e af ( p ice
e s
)
抗性芽数 (个 )
N u m l犯邝 of
功 s i s t i n g bu l t s
平均数 (个 /片 )
Ave ar g
七 n u
mb esr
再生植株成活数 (株 )
N u m b e巧 Of er g e n er at i n g
p l a n t s li v i n g
成活率 (% )
L i v i n g art i
o
一j42n石一、6ù1110廿飞ù门J403659
`
10605“581043K 2 6
K 3 5 8
R G l l
注 :表中的抗性芽是感染叶片在诱导出芽后 ,又经过 3 一 4 次继代总共获得的数量 。
Not e : R es i s atn t
s h o t s 毗 tho s e hw i e h 卯h i v de n u m b e rs Of bu l t s 旅 e r In feC te d l e af h a d b e n e u l tu dre ofr th re e 叮 of u r t i m e s
4
.
3 转基因植株的 P C R 检测 以启动子 C a M V 35S 引物进行 PC R 检测 ,呈阳性的
4
.
3
.
1 转基因植株当代 (几 代 ) 的 P C R 检测 初步认为是转基因植株 。 然后对阳性植株分别用
提取转基因植株 T 。 代叶片总 DN A 进行 PCR 扩 几丁质酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因的引物
增 。 植物基因组中不存在启动子 C a MV 35S , 故先 进行 P CR 扩增 , P CR 检测结果见表 2 和图 3 。
表 2 对再生植株进行 P C R 扩增的检测
T
a
b l
e
2 P C R
e
l
e e t or Ph o er s i s a s s ay
o n
er ge
n e r at e d p l a n t s
引物 irP m er
3 5 5 C h i 日一 1 , 3 一 gl u Ch i 、 日一 l , 3 一 gl u
性·”种比ve阳ivotP胜侣ve阳iotP,
曰川é人工eù洲目岁交.U险总民烟 草
品种
V a石合
it es J
加 1规。 〕
呀】议 le of R侣 i it ve
t es tde
阳性植株转
化率 (% )
l b明 s of n l分
it gn ar t 10 of
1洲阳 l it ve
禅山 l t s
of t es t
-
司
阳性
R玲 i t 一
I V e
阳性植株转
化率 (% )
1认山 s丘爪 1川 ~
in g 俪 o J
1洲侣 iit ve
动朋匕
阳性植株转
化率 (% )
r
l袖诵〕 n l对 ~
ign 曲 o J
l x赶 I nVe
户出 l ts
检 测
总数
l b t{e
J t巴 t -
司
of t昌 t -
司
阳性植株转
化率 (% )
1袖 1sf( 拍 1对 -
ign 俪。 J
l x巧 i石ve
禅an st
删撇协
毗创撇
3K 2 6 5 0 37 7 4
.
0 47 2 9
3K 5 8 3 3 2 5 7 5
.
8 3 3 2 0
6 1
,
7
60
.
6
2 3
.
4 14
.
9
:
n,4
凡j月呀
7t、ùO连.内j, ,
R G I 1 3 6 29 8 0
.
6 36 2 3 6 3
.
8 3 6 2 0
4 8
.
5
5 5
.
6
l 3
16
一
.6
`
1
. .1ū了2ù4内、é
阳性植株 总
数
OT t l
e o f P os i
石v e 了1u n J祀岛
2 3卷
获得再生植株 126株 ,对 1 19 株再生植株进
行 了 PC R 扩增 。 由上表可 以看 出 ,转化频率高低
与基因型有关 , 不同品种转化频率不同。 P CR 检
测结果可以初步证明几丁质酶基因和 p 一 1 , 3 -
葡聚糖酶基因分别或共同导人并整合到植物基因
组中 。 实验结果发现 ,几丁质酶基因和 p 一 1 , 3 -
葡聚糖酶基因在整合与表达上存在差异 。 检测为
阳性的转化植株大多数只导人几丁质酶基 因或 p
一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因 ,仅有少数植株同时含有两
个基因 。
4
.
4 转基因植株的 PC R 一 S ou t he m 杂交检测在
P C R 一 oS ut he m 杂交中 , 先进行质粒 DN A 的回收
和探针的标记 。
4
.
4
.
1 质粒 DN A 的回收和探针的标记几丁质酶
基因探针的标记是以几丁质酶基因两端的互补序
列为引物 , 以质粒 D N A 为模板进行 P C R 扩增 ,将
扩增产物进行琼脂糖凝胶 电泳 , 扩增产物带为 0 .
9 9 k b 左右 , 与 目的基因几丁质酶基因的大小一
致 。 然后对扩增产物回收 , 回收片段的大小与目
的基因片段的大小相同 ,说明回收片段为目的基
因片段 。 最后用随机引物法和地高辛标记探针 。
p
一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因探针的标记方法同上 。
4
.
4
.
2 转基因植株 0T 代的 P CR 一 S ou tha m 杂交
检测
每个品种随机选取 8 株阳性植株进行 P CR -
So u t h e m 杂交 。 结果表明 , 被检测样品与阳性对
照均显示出较强的杂交信号 , 而阴性对照和空白
对照则无杂交信号 , 充分说明 P CR 的检测结果是
正确的 , 因此进一步从 D N A 水平上证实 ,几丁质
酶基因和 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因分别或共同导
人并整合到植物基因组中。
图 3 d , e 分别以 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因和几丁质酶基因为引物的 P C R 检测结果 ;
f
,
g 分别以 p 一 I , 3 一 葡聚糖酶基因和几丁质酶基因为引物的 P CR 一 Sou t ha nr 检测结果
Fi g
.
3 d
, e
T h
e i r l s p e e t in g er s ul t Of p C R u s e d b y th e p ir m e r of C h it in a s e 罗n e a n d
p 一 l
,
3
一
gl
u e a n as e g e n e er s p e e t iv el y ; f
,
9 hT
e
h y b ir d iz a t i o n er s u lt of P CR 一 S o u t h e nr o n P CR p o s i t iv e p la n t s u s e d
th
e Por be of C hi t i
n as e ge
n e a n d p 一 1
,
3 一 斟u e a n a s e 罗n e er s p e e t i v e ly
5 讨论与建议
5
.
1 植物基因转化体系的确立是植物遗传转化
成功的关键
植物转基因技术比常规育种更能有效地创造
和改良植物新品种 , 因其可以打破物种界限 , 扩大
基因来源 , 周期短 ,见效快 , 但仍存在一些限制因
素 , 其中转化频率低是主要限制因素 。 提高转化
效率建立高效的基因转化系统非常重要 。 作者认
为获得高频转化体系主要与以下几个因素有关 。
5
.
1
.
1 外植体的选择
几乎所有研究结果都表明 , 即使同一菌种在
不、 向植物或在不同接种部位 ,其转化结果都有差
异 。 对许多植物来说 ,叶子可以提供大量具有全
能性的细胞 ,这些细胞具有再生成完整植株的能
力 。 在合适的培养基上 ,叶盘边缘受伤部位对农
杆菌感染很敏感 , 同时也是细胞快速分裂和诱导
幼苗再生的位点 , 这就导致了转化的有效性和叶
盘边缘细胞的再生 , 因此选取外植体时首先考虑
选用叶片作为外植体 (尽量选取幼年型 、 增殖能
力强的作为外植体 ) 。
5
.
1
.
2 激素的选择及其浓度
目前几乎所有实用的转化系统要想在基因转
移 、筛选和转化体再生上达到较高的频率 ,都离不
开组织培养技术 。 在组培中最重要的是激素及其
浓度的选择 。 激素浓度不同得到的结果不同 。 另
外 ,胚性愈伤的诱导 和培养在获得高频植物转化
过程中占有重要的地位 。
5
.
1
.
3 K a n 浓度的选择
关于选择培养基中卡那霉素 ( K an )的浓度并
2期 张彦妮等 :发根农杆菌介导几丁质酶基因和 日一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因转化烟草的研究
无固定值 。 大多数文献中对感染后的外植体和产
生的不定芽的选择均采用同一浓度水平的 Kan
浓度进行抗性筛选 〔’ ,3j 。 有人认为叶盘和农杆菌
共培养后先放到普通培养基上培养几天 ,是获得
高频率转化的关键要素 , 原因是单个转化细胞不
能抵抗选择压力 , 经过非选择培养基预培养的叶
盘周缘细胞串可以比单个转化细胞更能忍受 Kan
的选择压力 。 这种说法虽有一定道理 , 但农杆菌
的生长速度较快 ,若不加 Kan , 就会很快长出农杆
菌 ,最终会加重以后 的除菌工作 。 作者认为 Kan
浓度应以低 、高 、低的浓度程序加到培养基中比较
合理 , 即共培养后 ,在含有 25 m酬 L 的 aK n 诱导培
养基上生长三天 , 然后再继代到加有 l o m留 L 的
培养基上 ,等从再生芽诱导生根的过程中 Kan 浓
度选用 25 m扩 L 。 虽然对照 叶片在 l o m酬 L 的
K a n 浓度的培养基上愈伤组织和抗性芽全被抑制
了 ,但最后 出现的再生植株中仍有逃逸现象发生 。
其原因可能是 : 1 . 外植体的再生部位与选择培养
基未充分接触 , K a n 对其不起作用 ; 2 . 转化细胞对
非转化细胞的滋养作用 ; 3 . 转移的 T 一 DN A 未整
合 , 只是瞬时表达 。
5
.
2 提高抗性芽生根频率的措施
抗性芽诱导生根时在其基部易出现褐化现
象 , 有时出现玻璃化现象 ,这两种现象均影响抗性
芽生根频率 。 因此要尽量减少出现玻璃化和褐化
现象的因素。 在实验过程中要避免培养瓶内水分
的残留 ,并降低培养室内的温度及培养基的含水
量 ,缩短相邻两次继代间隔时间 ,可减少这两种现
象的发生 。
5
.
3 关于整合频率的问题
几丁质酶基因比 p 一 1 , 3 一 葡聚糖酶基因更
容易整合到植物基因组中 ,其原因可能是 :
( l) 两个基因大小不同造成整合频率不同 ,
小片段 比 大片段 的基 因更 容易 整合 。 这 与
s t o g e r
.
E 等的看法一致 〔` l 。
( 2 )携带有两个基因的 T 一 D N A 片段较大 ,
在转化的过程中可能断裂 、 降解导致单基因的整
碑△口 0
( 3) 由于质粒上含有两个 35 启动子和两
N O S 终止子 ,这样容易发生同源重组导致外源基
因失活 。
( 4 )在继代过程 中两个基因发生分离而丢
失 。
近来研究也表明 ,农杆菌介导将导致载体序
列插人达 70 % 以上 仁’ 〕 , 因此在构建载体时应尽量
使质粒载体小 ,这样有利于转化 。 X i a n g D o n g F u
等报道用简单的质粒载体结构 (线形 D NA 或最
短结构 )转化水稻将产生低拷贝的转基 因植株 ,
这些转基因不但不会出现沉默现象 , 而且也不影
响转化频率 〔6 1 。 因此以后在构建载体时尽量选
取易转化的载体 ,而且使载体片段短小 , 同时选取
适当的高效启动子进行转化以提高目的基因的转
化频率 。
参 考 文 献
1
.
Di
n g X
,
oG p al ak ir
s h n an B
,
Jho
n s o n L B
, e r 以 . In s e e t r e s is t -
a n e e Of tar n s g e n i e t o bac
e o e x Per
s s i n g a n in s e e t e h it i
n as e
ge
n e
.
rT an
s
ge
n i e R e s e acr h
,
199 8
,
7
: 7 7
一
84
2
. 李学宝 , 亚麻下胚轴离体培养和转化的研究 . 武汉植物
学研究 , 19 5 , 1 3 ( 4 ) : 3料 一 34 5
3
.
E P
e
er
z 一 M o l p h e 一 B al e h , No e h o a 一 A l ej o
.
R
e g e n e ar t io n o f
t r a n s ge n i e p lant
s Of M e x ie a n iL n e fr o m 棺 or b、 t e ir u m hr 如-
邵nes 一 t r a n s fo mr ed t i s s ue s . lP an t C e l R e P , 19 98 , 17 : 5 9 1
~
5 96
4
.
S t
o g e r E
,
W il i
a m s S
,
K
e e n D
, e r a l
.
M ol ce
u
lar e h a acr
t e ir s
-
t i e s Of t r a n s g e n ie w h e at a n d th e e f fe e t o n tar n s g e n e e x Per s
-
s
i
o n
.
Tar n s g e n ie R e s
,
1 99 8
,
7 : 46 3
一 4 7 1
5
.
K o n o n o v M E
,
B as s u n e r B
,
eC l
v in 5 B
.
I n t e gar t i o n of T -
DN A b in a斗 v e e t o r b ac k bo n e s e甲 e n e e s i n t o th e t o b a e e o
ge
n o m e : E v i d e n e e fo r m吐 t i p l e e o m p le x P a t t e sr of i n t e 歹a -
t i
o n
.
lP a n t J
,
19 7
,
1 1
:
94 5 一 9 5 7
6
.
X i an g D
o n g F
u ,
eL T an D
u e , S taef
n ia F
o n t a n a , e t a l
.
L i
n e a r
tar
n s
ge
n e e o n tur e t s l a e k i n g v e e ot r b ac k b
o n e s e q u e n e e s
ge
n e ar t
e lo w 一 e o Py 一 n u m be r t r an s ge n ie P la n t s iw th s i m p l e
in t e g r a t io n p a t t e m s
.
T
r a n s
ge
n i e Res e毗h , 2 0X() , 9 : 1 1 一 19 ·