全 文 ：植物保护学报 !"#$%&"()&%*)$"*+,*-"%! ./01! 2."2#$ 1:3 412: 678$ 0/90:3/.;<=,%>-=?@ABCA=./019/29//D
基金项目$ 国家葡萄产业技术体系建设专项"TFZ[K:/KA,K:#
!通讯作者"F#*B"$("$,"$+GH"%I+%,+#! JKL&-$ S(I"%MN0E:=,"L
收稿日期$ ./02 4/3 4/3
酵母 )#-R 基因介导对葡萄 L病毒的抗性
任O芳O董雅凤!O张尊平O范旭东O胡国君O周O俊
"中国农业科学院果树研究所! 国家落叶果树脱毒中心! 辽宁 兴城 0.10//#
摘要! 为明确广谱性抗病毒基因+酵母,&4R 基因对葡萄W病毒$O.&,%B/3%B/.#*5!RgW&的抗性效
果!通过农杆菌介导的遗传转化!将 ,&4R 基因导入西方烟 :5W!对转基因植株进行 )TZ鉴定及
["#*B+$% A"*分析!通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量 ZYK)TZ检测植株体内病毒含
量!并对转基因植株抗病性进行初步鉴定" 结果表明!目的基因 ,&4R 成功导入并整合至西方烟
:5W基因组!共获得 0/ 个转基因株系" 不同株系的Y0 代烟草中阳性植株比例为 0E95e 5^.95e!
表明目的基因可成功遗传到子代" 接种病毒后转基因植株普遍延迟发病!但后期症状与非转基因
对照相似!其中仅 0 个转基因株系 WE 具有不表现典型症状等抗性反应" 接种植株病毒含量检测
中!所有转基因植株均检测到病毒存在!但表现为抗病的WE 株系中病毒含量显著低于非转基因对
照!表明该转基因植株虽不能完全抵抗RgW侵染!但对RgW具有耐病性"
关键词! 酵母,&4R 基因# 遗传转化# 葡萄W病毒# 抗性
!"#+#,$*&",. 6+#).5(2.5(+1$7-"(+$,"(24
8-*(9&$#--*#+%4-.$)&%,.)#-: A"*"
Z+% \&%MO6"%Mc&(+%M!O_B&%M_#%H-%MO\&% Q#I"%MOX# R#"<#%O_B"# !#%
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12#,%$&,$ Y"I+*+$L-%+*B+$+G-G*&%,++(+,*"(&A$"&IKGH+,*$#L&%*-V-$&M+%+" +42/>)*&442&.9(4%*
,)9A%,&4R# *"O.&,%B/3%B/.#*5"RgW#! *B+,&4R M+%+@&G-%*$"I#,+I -%*"F/4)$/&3& )44/-%3$&"/*:5W
V-&?0.)A&4$%./#9$#9%<&4/%3*KL+I-&*+I *$&%G("$L&*-"%=YB+*$&%GM+%-,H&%*G@+$+&%&S?+I AS)TZ&%I
["#*B+$% A"*=YB+$+G-G*&%,+"(*$&%GM+%-,H&%*G@&GH$+-L-%&$-S+V&#&*+I ASGSLH*"L"AG+$V&*-"% &%I
V-$#G,"%,+%*$&*-"% &%&SG-G-% -%",#&*+I *$&%GM+%-,H&%*GAS$+&K*-L+h#&%*-*&*-V+ZYK)TZ=YB+$+G#*G
GB"@+I *B&**B+*&$M+*M+%+@&GG#,,+GG(#S-%*$"I#,+I &%I -%*+M$&*+I -%*"*B+*"A&,,"M+%"L+! &%I *+%
*$&%GM+%-,-%+G@+$+"A*&-%+I=0E95e45.95e Y0 H&%*G-% I-(+$+%**$&%GM+%-,-%+G@+$+H"G-*-V+AS
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G-L-&$@-*B *B&*"(*B+%"%K*$&%GM+%-,,"%*$"-% *B+&*+$G*&M+=7%S"%+*$&%GM+%-,-%+"WE# GB"@+I
$+G-G*&%,+@-*B"#**SH-,&GSLH*"LG=RgW,"#I A+I+*+,*+I -% &-%",#&*+I *$&%GM+%-,H&%*G! A#**B+
V-$#G,"%,+%*$&*-"% -% *$&%GM+%-,-%+WE @&GG-M%-(-,&%*S"@+$*B&% *B&*"(%"%K*$&%GM+%-,,"%*$"G=YB+
$+G#*G-%I-,&*+I *B&**B+*$&%GM+%-,*"A&,,"WE GB"@+I &*"+$&%*$+G-G*&%,+*"RgW&*B"#MB -*,"#I %"*
+%*-$+S$+G-G*RgW-%(+,*-"%=
3"4 5.%(#$ +42/>)*&442&.9(4%*,)9A%,&4R M+%+ *$&%G("$L&*-"% O.&,%B/3%B/.#*5 V-$#GK$+G-G*&%,+
OO当前!国内外已发现 E: 种病毒可侵染葡萄S/$/*
B/3/<%.& P="a&$*+-!./0.#!葡萄病毒病在全世界均
普遍发生!给葡萄生产带来很大危害 "任芳等!
./02#) 培育抗病品种是防控葡萄病毒病的有效途
径!近年来分子生物学和基因工程技术的发展为培
育抗病毒品种提供了一种有效的新途径) 目前葡萄
抗病毒基因工程已成功导入的目的基因主要为葡萄
病毒的外壳蛋白","&*H$"*+-%!T)#基因和移动蛋白
"L"V+L+%*H$"*+-%!a)#基因等病毒源基因!并获得
了抗病毒植株"g&&*+*&=!.//ER&LA-%"+*&=!
./0/任芳等!./0:#) 但是利用病毒源基因导入获
得的抗性具有特异性!只能对与目的基因同源的病
毒起作用!而葡萄上病毒种类繁多且常常复合侵染!
使得这种抗病毒策略在应用上受到很大限制)
粟酒裂殖酵母 +42/>)*&442&.9(4%*,)9A%的 ,&4R
基因表达产物具有降解 IGZbF的作用!可降解多种
病毒及类病毒 IGZbF!其作用靶位点只针对ZbF双
链!对序列无特殊要求!因此提高了抗病毒广谱性
"李黎等!.//3#) 已有研究将,&4R 基因转化到烟草
"李黎等!.//3#(马铃薯" [&%"+*&=!0DD5#(菊花
"7M&@&+*&=!.//1#(小麦"燕飞等!.//E#等植物获
得抗黄瓜花叶病毒"1#4#9A%.9)*&/4B/.#*!Tag#(
烟草花叶病毒"H)A&44)9)*&/4B/.#*!Yag#(马铃薯
c病毒"!)$&$)B/.#*T!)gc#(马铃薯纺锤块茎类病
毒"!)$&$)*,/3-"%$#A%.B/.)/-!)[YgI#(番茄斑萎病
毒"H)9&$)*,)$%- @/"$B/.#*!Y[]g#及大麦黄矮病毒
"5&."%((%")@-@&.的转基因植株!并表现出相应的抗病毒效果!可见其
在植物病毒广谱抗性上具有很好的应用潜力)
葡萄病毒属S/$/B/.#*是近年新确定的一个病毒
属!葡萄W病毒"O.&,%B/3%B/.#*5!RgW#是该属的重
要成员!引起葡萄栓皮病!在草本寄主烟草上症状表
现明显!但目前对该病毒的转基因抗性研究较少
"W"G,-&+*&=!0DD:a"G>"V-*?+*&=!.//3R"G?,?S%K
G>-!./0/#) 长期以来葡萄抗病毒转基因研究多针
对一种病毒的特异抗性!寻找相对广谱抗性基因的
同时抵抗多种病毒的复合侵染是葡萄抗病毒研究中
的重点和难点) 本研究选取,&4R 作为目的基因!通
过建立良好的遗传转化体系获得转基因植株!基于
转基因烟草生长周期短(RgW病毒发病快的特点!
旨在鉴定并评价 ,&4R 基因介导转基因植株对 RgW
的抗性!从而初步判断,&4R 基因在抗葡萄病毒研究
中的应用潜力!以期为寻找广谱抗性基因(促进葡萄
抗病毒遗传辅助育种奠定基础)
6 材料与方法
686 材料
供试质粒和菌株$根癌农杆菌 ?0.)A&4$%./#9$#7
9%<&4/%3*菌株 PWF22/2 以及用于农杆菌转化的植
物表达载体 HW80.07,&4R"登录号FcED13..#由中国
农业科学院植物保护研究所李世访研究员馈赠)
供试植物和毒源$植物转化受体西方烟 F/4)$/7
&3& )44/-%3$&"/*:5W种子及组培苗由本实验室保存!
经JP8[F和ZYK)TZ检测携带 RgW的 :5W组培苗
为摩擦接种毒源)
试剂$EK苄氨基腺嘌呤"EKA+%?S&L-%"H#$-%+!EK
WF#(萘乙酸"%&HB*B&+%+&,+*-,&,-I!bFF#(吲哚丁
酸"-%I"+A#*S$-,&,-I!8WF#(卡那霉素" >&%&LS,-%!
fL#(头孢霉素",+("*&C-L+G"I-#L!T+(#等激素和抗
生素购自美国 [-ML&公司H&M6bF聚合酶(限制性
内切酶购自日本 Y&f&Z&公司XSA"%IYaKbl尼龙
膜购自瑞典 FL+$GB&L)B&L&,-&公司!K:. )KITY)
购自北京福瑞生物工程公司实时荧光定量检测试
剂盒)$"A+\F[Yh)TZf-*a&G*+$a-C购自美国fFK
)FW-"GSG*+L公司)
培养基$分化培养基$a[ l:9/ LM;PEKWFl
/9. LM;PbFFl0// "L";P乙酰丁香酮选择培养
基$a[ l:9/ LM;PEKWFl/9. LM;PbFFl1/ LM;P
fLl.1/ LM;PT+(生根培养基$0;.a[ l/91 LM;P
8WFl.1 LM;PfLl01/ LM;PT+()
仪器$[0/// )TZ仪!美国 W-"KZ&I 公司FHB&K
L&M+$J)凝胶成像仪!美国 FHB&8%%"*+,B 公司
5D//XY实时荧光定量)TZ仪!美国FW8公司)
687 方法
68786 农杆菌介导的烟草遗传转化
采用叶盘法进行转化!将含质粒 HW80.0K,&4R
的根癌农杆菌 PWF22/2 振荡培养至 76E//值为 /9E
左右时低速离心!沉淀用 a[ 液体培养基重悬作为
侵染源) 将 :5W烟草无菌苗叶片剪成 /91 0^9/
,L. 的小块!在上述菌悬液中浸泡 0/ L-%!无菌滤纸
吸干多余菌液!接种于分化培养基上 .5p暗培养 :
I后!转至含 fL和 T+(的选择培养基于 ".1 x
.#p(0E B光照;3 B 黑暗条件下培养!每月继代培
养 0 次) 当诱导产生的不定芽长至 0 .^ ,L时!切
下转到生根培养基诱导生根直至获得完整植株)
68787 转基因植株的)TZ检测
根据R+%W&%>登录的 ,&4R 基因序列设计合成
,&4R 基因扩增引物$上游引物 )\0 "1mKTTRRFYTK
D:12 期 任O芳等$ 酵母,&4R 基因介导对葡萄W病毒的抗性
TTRRRTFYFYRRRFTRRYYYFFRFRK:m!含酶切位
点5&9N#(K9&#和 F-%##下游引物 )Z:"1mK
FFRFRTYTYYFFTRRRTFFFTYYFRFRYK:m!含酶切
位点 +&4##) 将获得的再生植株组培扩繁!一部分
植株采用十六烷基三甲基溴化铵法"B+C&I+,S*$-L+K
*BS&LL"%-#LA$"L-I+!TYFW#少量提取烟草基因组
6bF作为)TZ模板另一部分生根较好的植株移栽
到土壤中生长繁殖!以获得 Y/代转基因植株!Y/代
植株种子成熟后收获保存!次年播种获得 Y0 代植
株!随机选取 Y0 代烟草幼苗提取基因组 6bF!用引
物对)\0;)Z: 进行 )TZ检测) )TZ反应条件为$
D1p预变性 2 L-%!D2p 21 G!11p 21 G!5.p 0 L-%!
:/ 个循环后 5.p 延伸 5 L-%) )TZ产物经 0e琼脂
糖凝胶电泳检测)
68789 转基因植株的 ["#*B+$% A"*检测
以质粒 HW80.0K,&4R 为模板!根据植物表达载
体序列设计包含 ,&4R 基因和部分载体片段的引物
对 )\0;YZ: ")\0 序列同 09.9.!YZ: 序列为 1mK
RFYRYRTYRTFFRRTRFYYFFRYYRRK:m#!)TZ扩
增后电泳纯化回收产物作为探针) 选取 )TZ检测
为阳性的转基因植株移栽至土壤中!随机选取生
长健壮的 : 个转基因株系采用改良 TYFW法大量
提取基因组 6bF"彭军等!./0.#!以非转基因植
株为阴性对照!U4)Z#酶切后产物浓缩回收用于
电泳转膜!每个样品取 E/ "M进行电泳转膜!以
!K:.)KITY)标记探针进行 ["#*B+$% A"*检测)
6878; 转基因植株抗病性的初步鉴定
将阳性转基因植株炼苗 0 周后移栽到土壤中!
在植株 E 叶期左右!取感染RgW的试管苗毒源摩擦
接种转基因烟草!以非转基因烟草为对照"分别设
置接种和未接种植株对照#!观察转基因植株及对
照植株症状表现!每处理 : 次重复) 为进一步明确
接种植株体内的病毒含量情况!在接种后 0 个月采
集植株叶片!用实时荧光定量 ZYK)TZ法检测植株
中的病毒含量) 根据 RgW结合蛋白基因序列设计
荧光定量检测引物和探针$d\"1mKFTFYFTYY"F;
R#FTTYFRYFYYR"F;R#FFYTFRRRFK:m#!dZ"1mK
YFRTTT"T;Y;F#RFFRFFKFTTTTK:m#!探针"1mK
\FaKYTYFYTFRTFFFTFTRTKaRWK:m#)
689 数据分析
试验数据采用 [)[[ 0D9/ 软件进行分析!应用
6#%,&%氏新复极差法进行差异显著性检验)
7 结果与分析
786 转 )#-: 基因植株的获得及D@!检测
遗传转化后在fL和 T+(筛选下共获得再生烟
草 .3 株!)TZ扩增结果表明其中 0/ 株均扩增到约
0 .// AH的目的条带!阴性对照和其余植株未扩增
到目的条带"图 0#!说明在这 0/ 个再生株系中,&4R
基因成功转入) 0/ 个转基因株系共 53 株 Y0 代烟
草植株)TZ检测中!阳性比率为 0E95e 5^.95e!
表明外源基因可成功遗传到子代植株)
图 6 转 )#-: 基因烟草ME代植株D@!检测部分电泳结果
\-M=0 )&$*-&$+G#*G"()TZ-I+%*-(-,&*-"% "(*$&%GM+%-,*"A&,,"Y/ H&%*G
a$ 6P./// 0 .^/$ 转基因再生植株 b$ 非转基因植株 )$ ,&4R 质粒阳性对照) a$ 6P./// L&$>+$ 0 4./$ *$&%GK
M+%-,$+M+%+$&*-"% H&%*G b$ %"%K*$&%GM+%-,H&%* )$ H"G-*-V+,"%*$""(,&4R H&GL-I=
O
787 转 )#-: 基因植株的N.:,"%*2B.,检测
["#*B+$% A"*杂交结果表明!非转基因对照未产
生杂交带!转基因植株均产生特异性杂交信号带!说
明目的基因已成功整合到寄主基因组!插入拷贝数
为 0 .^ 个"图 .#)
789 转 )#-: 基因植株对葡萄L病毒的抗性鉴定
未接种的非转基因对照植株一直生长健康!无
症状) 用感染 RgW的烟草组培苗汁液摩擦接种 01
I后!接种的非转基因烟草对照新叶褪绿(黄化!转
基因植株无症状"图 :KF#0 个月后接种对照植株
/21 植O物O保O护O学O报 2. 卷
图 7 转 )#-: 基因烟草N.:,"%*2B.,检测结果
\-M=. ["#*B+$% A"*&%&SG-G"(*$&%GM+%-,*"A&,,"
a$ &KN/3I I-M+G*6bFL&$>+$ b$ 非转基因对
照 0 :^$ 转基因烟草) a$ &KN/3I I-M+G*+I 6bF
L&$>+$ b$ %"%K*$&%GM+%-,H&%* 0K:$ *$&%GM+%-,*"A&,,"=
O
症状进一步加重!并伴随叶片畸形(皱缩!转基因植
株中 WE 株系未表现典型症状!但叶片比未接种的
非转基因健康植株略小!其余转基因植株均出现叶
片褪绿症状"图 :KW#. 个月后除 WE 株系外的其它
转基因植株与非转基因接种对照植株症状相近!叶
片严重褪绿(皱缩(植株畸形不生长!WE 株系叶片虽
明显小于未接种的非转基因健康植株!但没有褪绿
斑等症状!且可正常生长"图 :KT#接种后期 WE 株
系可继续生长!最终开花结果完成整个生长周期!其
余转基因和非转基因接种植株均维持发病症状且几
乎停止生长) 表明本研究所获得的转基因烟草接种
RgW后普遍具有延迟发病的作用!但后期仅转基因
株系WE 未表现明显症状)
RgW摩擦接种 0 个月后!所有接种病毒的转基
因和非转基因烟草内均检测到RgW的存在!但非转
基因植株中病毒含量均较高!具有抗性反应的 WE
株系中病毒含量显著低于其它植株!其病毒拷贝数
仅占非转基因对照的 5e 0^3e) 其次转基因 W:
株系中病毒含量也较低!转基因株系 W1 中病毒含
量与非转基因对照相近"表 0#)
9 讨论
研究表明,&4R 基因对烟草"李黎等!.//3#(马
铃薯"[&%"+*&=!0DD5#(小麦"燕飞等!.//E#等多
种作物病毒或类病毒具有抗性作用!是一种具有潜
力的广谱性抗病毒基因!目前在果树上的研究还很
少) 葡萄感染病毒种类繁多且常伴随多种病毒复合
侵染!培育广谱抗性的抗病品种是葡萄抗病毒基因
工程的一个重要方向) 本实验室长期进行葡萄病毒
OOO
图 9 转 )#-:基因烟草摩擦接种KOL
半个月"F##0 个月"W#及 . 个月"T#后症状
\-M=: [SLH*"L"(*$&%GM+%-,*"A&,,"B&("F#!
"%+"W# &%I *@"L"%*BG"T# &(*+$-%",#&*-"%
WE$ 接种RgW的转基因株系WE W:$ 接种 RgW的
转基因株系W: b$ 接种RgW的非转基因植株 b8$ 未
接种RgW的健康植株) WE$ Y$&%GM+%-,G*$&-% WE -%",#&K
*+I @-*B RgW W:$ *$&%GM+%-,G*$&-% W: -%",#&*+I @-*B
RgW b$ %"%K*$&%GM+%-,H&%*-%",#&*+I @-*B RgW b8$
B+&*BSH&%*G@-*B"#*-%",#&*-"%=O
表 6 实时荧光定量!MHD@!检测转 )#-: 基因
植株中的病毒含量
Y&A+0 g-$#G,"%,+%*$&*-"% I+*+,*-"% -% *$&%GM+%-,H&%*GAS
$+&K*-L+h#&%*-*&*-V+ZYK)TZ
样本名称
[&LH+%&L+
每"P中平均拷贝数
a+&% ,"H-+GH+$"P
T*
W: ".933 x/90/# u0/1 A .:903 x/9/1 A
W1 "595: x/9E/# u0/1 I .09E1 x/90. I
WE "09/. x/9:/# u0/1 & .2932 x/922 &
b0 "3925 x/920# u0/1 I .091/ x/9/5 I
b. "02920 x0921# u0/1 + ./952 x/90E +
b: "19E/ x/9:E# u0/1 , ..901 x/90/ ,
OOW:(W1和WE$转基因株系b0(b.和b:$非转基因对照) 表
中数据为平均数x标准差) 同列数据后不同字母表示经6#%,&%
氏新复极差法检验在 !y/9/1 水平差异显著) W:! W1 &%I WE$
Y$&%GM+%-,G*$&-%G b0! b. &%I b:$ %"%K*$&%GM+%-,H&%*G=6&*&&$+
L+&%x[6=6-(+$+%*+*+$G-% *B+G&L+,"#L% -%I-,&*+G-M%-(-,&%*
I-(+$+%,+&*!y/9/1 +V+AS6#%,&%-G%+@L#*-H+$&%M+*+G*=
0212 期 任O芳等$ 酵母,&4R 基因介导对葡萄W病毒的抗性
研究!获得了葡萄 F病毒"O.&,%B/3%B/.#*?! RgF#
"任芳等!./0.#(RgW"X# +*&=!./02#(沙地葡萄茎
痘相关病毒"O.&,%B/3%.#,%*$./**$%9,/$/30 &*)4/&$%-
B/.#*!RZ[)&g#"朱红娟等!./02#等多个葡萄病毒分
离物!并保存了 RgW等葡萄病毒单毒源!有利于转
基因植株抗性的快速评价) 本研究将 ,&4R 基因导
入西方烟 :5W!共获得 0/ 个转基因株系!其中 0 个
株系WE 对RgW表现抗性反应!该株系接种RgW病
毒后不表现典型病害症状且能正常生长完成整个生
长周期!其体内可检测到病毒存在但含量显著低于
其它接种RgW转基因植株和非转基因对照!因此认
为该转基因株系对RgW具有耐病性)
但与其它葡萄病毒源基因诱导的抗性相比!本
研究中转基因植株抗性效果较弱!如分别转入葡萄
扇叶病毒"O.&,%B/3%<&3 "%&&=!.///#(RgF"Z&I-&%K[&I++*&=!.///#或葡萄卷
叶伴随病毒K. "O.&,%B/3%"%&<.)"&*)4/&$%- B/.#*7.!
RPZ&gK.#"P-%M+*&=!.//3#等病毒1!基因的烟草
均对同源病毒表现出很强抗性!甚至部分植株可抵
抗病毒侵染!而本研究中所获得的,&4R 转基因烟草
不能完全抵抗病毒侵染!仅表现出耐病性!分析原因
可能为$一方面,&4R 基因本身对葡萄病毒的抗性诱
导效果还未明确!其在木本果树上是否能像其它大
田作物上表现出同等的抗性效果还未可知另一方
面本研究目前所获得转基因株系较少!外源基因在
植株的插入位点不同或基因表达水平差异等也有可
能影响抗性效果!因此还有必要进一步筛选更多转
基因植株进行抗性验证)
此外转基因植株的抗性水平还与其 ZbF积累
量具有相关性!转 O8G&S7. 1!基因植株的病毒抗
性始终与导入基因的ZbF低水平转录相一致"P-%M
+*&=!.//3#徐丽等"./0/#转入 )gc复制酶基因
片段的抗病植株中 ZbF积累量也明显低于感病植
株) 这些研究结果表明转基因植株抗性与目的片段
转录产物的积累量呈负相关!而本试验中植株体内
的ZbF积累情况及蛋白表达水平等是否影响抗性
表现也有待于进一步研究) 由于 ,&4R 基因理论上
具有广谱病毒抗性!因此!有必要对 RgW以外的其
它葡萄病毒进行转基因抗性研究!并将该基因转入
葡萄!以明确其在葡萄上的实际抗病毒效果)
参 考 文 献 "Z+(+$+%,+G#
W"G,-&6! [&V-%"g! a-%&($&F! b&LA&[! J-,-"g! T&G*+&%"
aF! R"%G&V+G6! a&$*+-R)=0DD:=)$"H+$*-+G"(&(-&L+%K
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R&LA-%"R! )+$"%+8! T&$&F! TB-*&$&]! W",,&,,-)! a&$-%"%-
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&%,+M+%+G$ &%&SG-G"(V&$-&A++CH$+GG-"% "(*$&%GM+%+! G-ZK
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aP! a-%&($&F! [&V-%"g! [&I&$+-)! a&$*+-R)! I&
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X"$*-,#B#$&+! 1.3$ :/1 4:00
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Pb:: BSA$-I M$&H+V-%+G=g-$#GR+%+G! 20".#$ .5: 4.30
X# R!! 6"%Mc\! _B&%M_)! \&% Q6! Z+% \! _B# X!=./02=6+K
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$责任编辑%李美娟&
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