全 文 ：土壤中南方根结线虫的实时荧光
孕悦砸检测和定量
宋志强摇 王摇 暄鄢摇 林摇 宇摇 迟元凯摇 鞠玉亮摇 李红梅
渊南京农业大学植物保护学院袁 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室袁 南京 圆员园园怨缘冤
摘要院 为了准确测定土壤中南方根结线虫 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬 的群体密度袁根据序列特异性扩增
区标记设计了南方根结线虫特异性引物和 栽葬择酝葬灶 探针袁分别建立了卵和 圆 龄幼虫的实时荧光
孕悦砸定量检测体系袁并将该检测体系与显微镜计数法进行了比较遥 结果表明袁引物 酝蚤鄄云 辕 砸 及探针
酝蚤鄄责则燥遭藻对南方根结线虫具有高度特异性袁建立的标准曲线循环阈值与卵和 圆 龄幼虫数量的对数
值之间具有良好的线性关系袁相关系数分别为 园援 怨苑苑员 和 园援 怨愿缘猿袁扩增效率均为 怨园豫 袁检测灵敏度
为 员园 原员个卵及 员园 原猿条 圆 龄幼虫曰对 员园 个田间土壤样本的检测显示袁实时荧光 孕悦砸定量检测与显微
镜计数法测定的南方根结线虫卵和 圆 龄幼虫数量呈显著正相关袁且两种方法对 圆 龄幼虫的测定结
果无显著差异遥
关键词院 南方根结线虫曰 圆 龄幼虫曰 卵曰 实时荧光 孕悦砸曰 栽葬择酝葬灶探针
阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 择怎葬灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬
蚤灶 泽燥蚤造 泽葬皂责造藻 怎泽蚤灶早 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸
杂燥灶早 在澡蚤择蚤葬灶早摇 宰葬灶早 载怎葬灶鄢摇 蕴蚤灶 再怎摇 悦澡蚤 再怎葬灶噪葬蚤摇 允怎 再怎造蚤葬灶早摇 蕴蚤 匀燥灶早皂藻蚤
渊运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 酝燥灶蚤贼燥则蚤灶早 葬灶凿 酝葬灶葬早藻皂藻灶贼 燥枣 阅蚤泽藻葬泽藻 葬灶凿 陨灶泽藻糟贼泽袁 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 悦燥造造藻早藻 燥枣
孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 晕葬灶躁蚤灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 晕葬灶躁蚤灶早 圆员园园怨缘袁 允蚤葬灶早泽怎 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 葬糟糟怎则葬贼藻造赠 蚤凿藻灶贼蚤枣赠 葬灶凿 择怎葬灶贼蚤枣赠 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬 蚤灶 泽燥蚤造袁 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸
葬泽泽葬赠泽 枣燥则 泽藻糟燥灶凿鄄泽贼葬早藻 躁怎增藻灶蚤造藻泽 渊 允圆冤 葬灶凿 藻早早泽 憎藻则藻 凿藻增藻造燥责藻凿援 栽澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 责则蚤皂藻则泽 酝蚤鄄云 辕 砸 葬灶凿
栽葬择酝葬灶 责则燥遭藻 酝蚤鄄责则燥遭藻 憎藻则藻 凿藻泽蚤早灶藻凿 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 杂悦粤砸 皂葬则噪藻则 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬援 悦燥则则藻鄄
造葬贼蚤燥灶 憎葬泽 葬灶葬造赠扎藻凿 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 灶藻皂葬贼燥凿藻 灶怎皂遭藻则泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿 遭赠 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 藻泽贼蚤皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 贼则葬凿蚤贼蚤燥灶葬造
皂蚤糟则燥泽糟燥责藻 糟燥怎灶贼蚤灶早援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 责则蚤皂藻则泽 葬灶凿 责则燥遭藻 憎藻则藻 澡蚤早澡造赠 泽责藻糟蚤枣蚤糟 贼燥 酝援 蚤灶糟燥早灶蚤鄄
贼葬援 栽澡藻 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 泽贼葬灶凿葬则凿 糟怎则增藻泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡藻 泽贼则燥灶早 造蚤灶藻葬则 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 糟赠糟造藻 贼澡则藻泽澡燥造凿 葬灶凿
贼澡藻 造燥早葬则蚤贼澡皂蚤糟 增葬造怎藻泽 枣则燥皂 贼澡藻 灶怎皂遭藻则 燥枣 藻早早泽 葬灶凿 允圆泽援 栽澡藻 糟燥则则藻造葬贼蚤燥灶 糟燥藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 蚤灶 贼澡藻 藻择怎葬贼蚤燥灶 枣则燥皂
藻早早泽 葬灶凿 允圆泽 憎藻则藻 园援 怨苑苑员 葬灶凿 园援 怨愿缘猿袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟蚤藻泽 燥枣 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸
葬泽泽葬赠 枣燥则 遭燥贼澡 憎藻则藻 怨园豫 袁 葬灶凿 贼澡藻 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 憎藻则藻 员园 原员 藻早早 葬灶凿 员园 原猿 允圆袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣
员园 枣蚤藻造凿 泽葬皂责造藻泽 则藻增藻葬造藻凿 贼澡藻则藻 憎葬泽 葬 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥则则藻造葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 灶怎皂遭藻则泽 燥枣 藻早早泽 葬灶凿 允圆泽 燥枣
酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬 蚤灶 泽燥蚤造 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 皂藻贼澡燥凿泽 燥枣 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 藻泽贼蚤皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 皂蚤糟则燥泽糟燥责藻 糟燥怎灶贼蚤灶早袁 葬灶凿
贼澡藻则藻 憎葬泽 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 蚤灶 藻泽贼蚤皂葬贼蚤灶早 贼澡藻 灶怎皂遭藻则 燥枣 允圆泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬曰 泽藻糟燥灶凿鄄泽贼葬早藻 躁怎增藻灶蚤造藻曰 藻早早曰 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸曰 栽葬择酝葬灶 责则燥遭藻
基金项目院 国家公益性行业渊农业冤科研专项渊圆园员员园猿园员愿冤袁国家自然科学基金渊猿园怨园园怨猿怨冤
作者简介院 宋志强袁男袁员怨愿缘年生袁硕士研究生袁研究方向为植物病原线虫学袁 耘鄄皂葬蚤造院 泽扎澡择赃圆远愿猿缘愿愿岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤 袁 耘鄄皂葬蚤造院 曾怎葬灶憎葬灶早岳 灶躁葬怎援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员猿 原 园圆 原 园远
第 源园 卷摇 第 猿 期
圆园员猿 年摇 远 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 猿
允怎灶藻 摇 圆园员猿
摇 摇 根结线虫渊 则燥燥贼鄄噪灶燥贼 灶藻皂葬贼燥凿藻袁砸运晕冤是一类植
物根系专性内寄生线虫袁每年因其危害造成全球农
作物减产约 缘豫 咱员暂 遥 目前世界上已报道的根结线虫
达 怨愿 种袁我国记载的种类有 源园 种咱圆暂 袁其中最常见种
为南方根结线虫 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬尧花生根结线
虫 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 葬则藻灶葬则蚤葬尧爪哇根结线虫 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻
躁葬增葬灶蚤糟葬和北方根结线虫酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 澡葬责造葬遥 南方根
结线虫寄主范围广尧发病面积大袁是世界范围内引起
根结线虫病的主要病原咱猿暂 遥 根结线虫以 圆 龄幼虫或
卵在土壤中度过不良环境条件袁成为根结线虫病重
要的初侵染源遥 土壤中根结线虫 圆 龄幼虫或卵的初
始群体密度与作物的受害程度关系密切咱源暂 袁南方根
结线虫仅为 员 条 圆 龄幼虫 辕 糟皂猿 土咱缘暂或 园援 员 个卵 辕 早
土时咱远暂 袁就可对寄主作物造成危害遥 因此袁在作物
播种或移栽前明确田间线虫群体密度袁依据不同的
群体密度从而制定相应的防治策略袁对降低该病害
的危害损失具有重要意义遥
土壤中根结线虫群体密度的测定袁通常是利用
浅盘分离或蔗糖漂浮离心等方法将土壤样本中的全
部线虫分离出来袁再依据形态学特征在显微镜下对
其中的根结线虫进行鉴定和计数遥 由于土壤中经常
存在大量的腐生线虫及植物寄生线虫袁运用这种传
统方法测定土壤中根结线虫的群体密度需要具备专
业的技能和丰富的经验袁因此往往难以推广和应用遥
近年来分子生物学技术发展迅速袁酝蚤灶 等咱苑暂和 郧燥贼燥
等咱愿暂先后报道了通过直接提取发病田间土壤样品
的总 阅晕粤袁利用实时荧光 孕悦砸技术对其中的根结线
虫 圆 龄幼虫进行了定量检测袁尽管该方法比传统的
形态学计数更为便捷袁但由于直接提取土壤总 阅晕粤
无法区分其中的 圆 龄幼虫和卵袁最终测定的线虫数
量往往误差较大袁无法客观反映土壤中线虫的群体
密度袁因而无法准确评估其可能对作物造成的潜在
危害程度遥 为此袁本研究将传统的线虫分离方法与
实时荧光 孕悦砸技术相结合袁通过先将土壤中的卵与
线虫分离袁再利用设计的南方根结线虫特异性引物
和 栽葬择酝葬灶探针对卵及混合线虫样本进行检测和定
量袁从而建立更加精确的土壤中南方根结线虫定量
检测体系袁以期为准确测定田间根结线虫群体密度
和制定有效的防治策略提供技术支撑遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试虫源和作物院供试根结线虫 缘 个种共 员员 个
群体的来源和寄主植物见表 员遥 供试番茄品种院江
蔬 员源 号袁江苏省农业科学院蔬菜花卉研究所遥 所有
根结线虫种群先以单卵块接种法进行纯化袁经会阴
花纹形态特征和同工酶谱特征鉴定咱怨暂后袁接种在感
病番茄品种江蔬 员源 号上于温室中扩繁遥 测试的混
合线虫群体样本分离自徐州沛县的小麦 原玉米常年
轮作农田土壤袁经形态特征鉴定袁混合线虫样品包括
禾谷孢囊线虫 匀藻贼藻则燥凿藻则葬 葬增藻灶葬藻袁落选短体线虫 孕则葬鄄
贼赠造藻灶糟澡怎泽 灶藻早造藻糟贼怎泽袁索恩短体线虫 孕则葬贼赠造藻灶糟澡怎泽 贼澡燥则鄄
灶藻蚤袁矮化线虫 栽赠造藻灶糟澡燥则澡赠灶糟澡怎泽 泽责援 袁真滑刃线虫 粤责澡鄄
藻造藻灶糟澡怎泽 泽责援和丝尾垫刃线虫 云蚤造藻灶糟澡怎泽 泽责援等袁不含有
根结线虫遥 用于田间土壤中南方根结线虫的检测和
定量的 员园 个土壤样本均采自江苏省淮安市淮阴区
丁集娘庄蔬菜大棚袁其南方根结线虫病发生严重遥
试剂及仪器院孕悦砸 试剂尧孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择栽酝 渊孕则燥遭藻
择孕悦砸冤尧阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴 圆园园园尧蛋白酶 运 及琼脂糖均
购自宝生物工程渊大连冤有限公司曰粤月陨 孕砸陨杂酝襆 苑缘园园
实时定量 孕悦砸仪袁美国 粤责责造蚤藻凿 月蚤燥泽赠泽贼藻皂泽公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 线虫的分离及 阅晕粤提取
番茄幼苗接种根结线虫约 缘园 凿 后袁挑取根系上
的新鲜卵块袁加入灭菌水于 圆缘 益温箱中孵化获得 圆
龄幼虫袁同时用次氯酸钠分离法咱员园暂获得根结线虫
的卵遥
阅晕粤的提取参照王江岭等咱员员暂的方法并稍作修
改袁将线虫或卵放入含有 源园 滋蕴 凿凿匀圆韵和 缘 滋蕴 员园 伊
耘曾 栽葬择 遭怎枣枣藻则 的 圆园园 滋蕴 孕悦砸 管中袁液氮中冷冻 员
皂蚤灶后袁置于 怨缘 益下 圆 皂蚤灶袁重复 猿 次曰向 孕悦砸 管中
加入 缘 滋蕴 员 皂早 辕 皂蕴蛋白酶 运袁远缘 益温育 员 澡袁置于 怨缘
益下 员园 皂蚤灶后备用遥
员援 圆援 圆 引物和 栽葬择酝葬灶探针的设计及检测
根据已报道南方根结线虫序列特异性扩增区
标记的 阅晕粤 序列咱员圆暂 袁利用 孕则蚤皂藻则 孕则藻皂蚤藻则 缘援 园 和
孕则蚤皂藻则 耘曾责则藻泽泽 增猿援 园 软件设计实时荧光 孕悦砸引物对
酝蚤鄄云 渊 缘忆鄄郧粤栽粤栽悦郧郧粤粤郧郧粤悦悦悦栽郧栽栽鄄猿忆冤 和 酝蚤鄄砸
渊缘忆鄄粤郧粤郧栽郧悦悦粤粤栽悦栽郧郧粤粤粤粤郧鄄猿忆冤袁预期扩增片
段大小为 员猿怨 遭责曰栽葬择酝葬灶 探针 酝蚤鄄责则燥遭藻渊缘忆鄄悦悦粤郧鄄
郧粤悦郧郧粤郧粤粤郧栽粤栽郧栽栽悦悦栽悦郧鄄猿忆冤袁 探 针 缘忆 端 以
云粤酝作荧光标记袁猿忆端以 栽粤酝砸粤 作标记遥 引物和
探针由宝生物工程渊大连冤有限公司合成遥
摇 摇 以南方根结线虫尧花生根结线虫尧爪哇根结线
虫尧北方根结线虫和西班牙根结线虫的 缘 个种共 员员
个群体渊表 员冤及土壤中无根结线虫的混合线虫种群
远缘圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
表 员 根结线虫种群来源尧寄主及同工酶表型
栽葬遭造藻 员 韵则蚤早蚤灶袁 澡燥泽贼 葬灶凿 蚤泽燥扎赠皂藻 责澡藻灶燥贼赠责藻泽 燥枣 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 泽责藻糟蚤藻泽 葬灶凿 责燥责怎造葬贼蚤燥灶泽
种类摇
杂责藻糟蚤藻泽摇
群体摇
孕燥责怎造葬贼蚤燥灶摇
来源摇 摇
韵则蚤早蚤灶摇 摇
寄主摇 摇
匀燥泽贼摇 摇
同工酶表型 陨泽燥扎赠皂藻 责澡藻灶燥贼赠责藻
苹果酸脱氢酶
酝葬造葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻
酯酶
耘泽贼藻则葬泽藻
南方根结线虫 酝陨允杂猿 江苏南京 晕葬灶躁蚤灶早袁 允蚤葬灶早泽怎 番茄 栽燥皂葬贼燥 晕员 陨员
酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬 酝陨杂阅圆 山东巨野 允怎赠藻袁 杂澡葬灶凿燥灶早 茄子 耘早早责造葬灶贼 晕员 陨员
酝陨在允员 浙江杭州 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早 番茄 栽燥皂葬贼燥 晕员 陨员
酝陨粤匀员 安徽砀山 阅葬灶早泽澡葬灶袁 粤灶澡怎蚤 茄子 耘早早责造葬灶贼 晕员 陨员
花生根结线虫 酝粤允杂员 江苏徐州 载怎扎澡燥怎袁 允蚤葬灶早泽怎 番茄 栽燥皂葬贼燥 晕员 粤圆
酝援 葬则藻灶葬则蚤葬 酝粤杂阅员 山东安丘 粤灶择蚤怎袁 杂澡葬灶凿燥灶早 生姜 郧蚤灶早藻则 晕员 粤圆
爪哇根结线虫 酝允郧载员 广西南宁 晕葬灶灶蚤灶早袁 郧怎葬灶早曾蚤 香蕉 月葬灶葬灶葬 晕员 允猿
酝援 躁葬增葬灶蚤糟葬 酝允云允员 福建福州 云怎扎澡燥怎袁 云怎躁蚤葬灶 烟草 栽燥遭葬糟糟燥 晕员 允猿
北方根结线虫 酝匀杂阅员 山东荷泽 匀藻扎藻袁 杂澡葬灶凿燥灶早 牡丹 孕葬藻燥灶蚤葬 泽怎枣枣则怎贼蚤糟燥泽葬 匀员 匀员
酝援 澡葬责造葬 酝匀杂阅圆 山东 杂澡葬灶凿燥灶早 花生 孕藻葬灶怎贼 匀员 匀员
西班牙根结线 酝杂匀晕员 海南儋州 阅葬灶扎澡燥怎袁 匀葬蚤灶葬灶 番木瓜 孕泽蚤凿蚤怎皂 早怎葬躁葬增葬 晕员 杂圆鄄酝员
酝援 澡蚤泽责葬灶蚤糟葬
的 阅晕粤渊约 缘 灶早 辕 滋蕴冤作为模板袁并用 凿凿匀圆韵 作为无
模板对照袁进行实时荧光 孕悦砸袁检测引物及 栽葬择酝葬灶
探针的特异性遥
将分别含有 员园园 条 圆 龄幼虫或 员园园 个卵的 缘园
滋蕴 阅晕粤溶液进行 员园 倍梯度稀释袁并换算成 圆 龄幼
虫数量或卵量袁分别为 圆尧员尧员园 原员尧员园 原圆尧员园 原猿和 员园 原源
条渊个冤圆 龄幼虫或卵袁然后将各个浓度 阅晕粤作为模
板袁进行 圆 龄幼虫和卵的实时荧光 孕悦砸 灵敏度
检测遥
员园 滋蕴 实时荧光 孕悦砸 反应体系院阅晕粤 模板 员
滋蕴尧圆援 缘 滋皂燥造 辕 蕴 正反向引物各 园援 愿 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴
栽葬择酝葬灶探针 园援 圆 滋蕴尧圆 伊 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择 缘 滋蕴尧缘园 伊
砸韵载 砸藻枣藻则藻灶糟藻 阅赠藻域 园援 圆 滋蕴袁补足 凿凿匀圆韵至 员园 滋蕴遥
扩增程序院怨缘 益 猿园 泽曰怨缘 益 缘 泽袁缘圆 益 猿员 泽袁苑圆 益猿园 泽袁
缘园 个循环遥
员援 圆援 猿 实时荧光 孕悦砸标准曲线的建立
显微镜下分别挑取员 尧缘 尧员园 尧缘园 尧员园园 尧缘园园和
员 园园园 条 圆 龄幼虫及 员尧缘尧员园尧缘园尧员园园尧缘园园 和 员 园园园 个
卵袁提取 阅晕粤 作为 圆 龄幼虫或卵的标准品袁将其作
为模板进行实时荧光 孕悦砸 反应袁每个标准品重复 猿
次袁得到各自的循环阈值渊 贼澡则藻泽澡燥造凿 糟赠糟造藻袁悦贼冤袁通过
悦贼值与南方根结线虫 圆 龄幼虫或卵数量的对数值
之间存在的线性关系袁建立南方根结线虫 圆 龄幼虫
和卵的标准曲线遥
员援 圆援 源 土样中南方根结线虫的检测和定量
取根结线虫病田土壤 员园园 早袁参考 月赠则凿 等咱员猿暂方
法收集土壤中的卵袁再采用蔗糖漂浮离心法咱员源暂获得
土样中不同种线虫的混合样本袁将获得的混合线虫
样本及卵悬浮液均分成两份样品袁其中一份样品在
显微镜下计数袁另一份样品则提取 阅晕粤袁进行实时
荧光 孕悦砸袁通过建立的南方根结线虫 圆 龄幼虫或卵
的标准曲线对土壤中的南方根结线虫进行检测和定
量袁每样本重复 猿 次遥
员援 猿 数据统计分析
运用 杂粤杂 怨援 员 统计分析软件进行数据处理分
析袁采用直线回归及双样本 贼 检验方法对显微镜计
数法和实时荧光 孕悦砸法检测 员园 份病田土样中南方
根结线虫数量的结果进行线性回归和差异显著性
分析遥
圆 结果与分析
圆援 员 引物和 栽葬择酝葬灶探针的特异性及灵敏度
特异性检测结果表明袁只有南方根结线虫 源 个
群体酝陨允杂猿尧酝陨杂阅圆尧酝陨在允员 和酝陨粤匀员 的 阅晕粤样本能
检测到荧光信号的增强袁呈现明显的阳性扩增反应袁
而其它 苑 种根结线虫群体尧混合线虫样本及对照荧
光信号均没有增强渊图 员冤袁表明 酝蚤鄄云 和 酝蚤鄄砸 引物
对和 栽葬择酝葬灶 探针对南方根结线虫特异性强袁能够
将南方根结线虫与其它根结线虫及土壤中常见线虫
区分开遥
摇 摇 实时荧光 孕悦砸反应扩增灵敏度检测结果显示袁
随着 圆 龄幼虫及卵数量的减少袁对应的 悦贼值在逐渐
苑缘圆猿 期 宋志强等院土壤中南方根结线虫的实时荧光 孕悦砸检测和定量
图 员 引物和探针的实时荧光 孕悦砸特异性检测
云蚤早援 员 杂责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 燥枣 责则蚤皂藻则泽 葬灶凿 责则燥遭藻 遭赠 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸
摇 摇 注院员 耀 源院南方根结线虫群体 酝陨允杂猿尧酝陨杂阅圆尧酝陨在允员 及 酝陨粤匀员曰缘 耀 员员院花生根结线虫群体 酝粤允杂员 及 酝粤杂阅员尧爪哇根结线虫群体
酝允郧载员和 酝允云允员尧北方根结线虫群体 酝匀杂阅员和 酝匀杂阅圆尧西班牙根结线虫群体 酝杂匀晕员曰员圆院土壤中无根结线虫的混合线虫群体曰员猿院无模
板对照遥 晕燥贼藻院 员 原 源院 孕燥责怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 酝援 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬 酝陨允杂猿袁 酝陨杂阅圆袁 酝陨在允员袁 葬灶凿 酝陨粤匀员曰 缘 原员员院 责燥责怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 酝援 葬则藻灶葬则蚤葬 酝粤允杂员 葬灶凿 酝粤杂阅员袁
酝援 躁葬增葬灶蚤糟葬 酝允郧载员 葬灶凿 酝允云允员袁 酝援 澡葬责造葬 酝匀杂阅员 葬灶凿 酝匀杂阅圆袁 葬灶凿 酝援 澡蚤泽责葬灶蚤糟葬 酝杂匀晕员袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠曰 员圆院 皂蚤曾藻凿 灶藻皂葬贼燥凿藻 责燥责怎造葬贼蚤燥灶泽 憎蚤贼澡鄄
燥怎贼 砸运晕曰 员猿院 灶燥 贼藻皂责造葬贼藻 糟燥灶贼则燥造援
增大袁当 阅晕粤 模板量小于 员园 原猿条 圆 龄幼虫或 员园 原员
个卵时袁实时荧光 孕悦砸 扩增曲线的荧光值低于阈
值袁检测不到荧光信号袁表明该体系检测的灵敏度为
员园 原猿条 圆 龄幼虫或 员园 原员个卵渊图 圆冤遥
图 圆 南方根结线虫 圆 龄幼虫和卵的实时荧光 孕悦砸灵敏度检测
云蚤早援 圆 杂藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 枣燥则 泽藻糟燥灶凿鄄泽贼葬早藻 躁怎增藻灶蚤造藻泽 葬灶凿 藻早早泽 燥枣 酝藻造燥蚤早燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬
摇 摇 注院员 耀 远分别为 圆尧员尧员园 原员尧员园 原圆尧员园 原猿和 员园 原源条 圆龄幼虫或卵曰苑院无模板对照遥 晕燥贼藻院 员 原 远院 圆袁 员袁 员园 原员袁 员园 原圆袁 员园 原猿袁 葬灶凿 员园 原源 允圆 燥则
藻早早泽袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠曰 苑院 灶燥 贼藻皂责造葬贼藻 糟燥灶贼则燥造援
圆援 圆 实时荧光 孕悦砸标准曲线的建立
悦贼值与南方根结线虫圆龄幼虫量或卵量的
对数 值 之 间 呈 负 相 关 性 袁标 准 曲 线 方 程为
赠 越 原猿援 缘怨缘曾 垣猿远援 园员袁相关系数 砸圆 为 园援 怨愿缘猿袁扩增效
率 耘为 怨园豫 曰卵的标准曲线方程为 赠 越 原 猿援 缘愿猿曾 垣
猿愿援 苑猿袁砸圆 为 园援 怨苑苑员袁耘为 怨园豫 渊图 猿冤袁表明建立的 圆
龄幼虫和卵的实时荧光 孕悦砸标准曲线线性好尧扩增
效率高遥
圆援 猿 土样中南方根结线虫 圆 龄幼虫和卵的检测
圆龄幼虫的线性回归方程为 赠 越 员援 猿源员曾 原 苑援 愿愿愿
渊砸圆 越 园援 怨员远缘袁孕 约 园援 园员冤袁与显微镜计数法之间存在
极显著相关性袁贼检验 孕 越园援 圆园猿 跃 园援 园缘袁说明建立的
实时荧光 孕悦砸 定量检测体系测定的土壤中南方根
结线虫 圆 龄幼虫的群体密度与显微镜计数之间差异
不显著曰而卵的线性回归方程为 赠 越 员援 愿圆园曾 垣 圆援 圆员远
渊砸圆 越 园援 愿圆园怨袁孕 约园援 园员冤渊图 源冤袁与显微镜计数法之
间也存在着极显著相关性袁但实时荧光 孕悦砸方法检
测南方根结线虫卵的数量比显微镜计数方法约多 员
倍袁贼检验 孕 越 园援 园员猿 约 园援 园缘袁两者之间差异显著遥
猿 讨论
准确测定土壤中根结线虫的群体密度袁对于正
确预测和评估根结线虫病害的发生严重程度具有重
要的指导意义遥 近年来随着分子生物学技术的快速
愿缘圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
图 猿 南方根结线虫 圆 龄幼虫和卵的实时荧光 孕悦砸标准曲线
云蚤早援 猿 杂贼葬灶凿葬则凿 糟怎则增藻 燥枣 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 枣燥则 泽藻糟燥灶凿鄄泽贼葬早藻 躁怎增藻灶蚤造藻泽 葬灶凿 藻早早泽 燥枣 酝藻造燥蚤凿燥早赠灶藻 蚤灶糟燥早灶蚤贼葬
图 源 实时荧光 孕悦砸定量检测法与显微镜计数法之间的相关性
云蚤早援 源 悦燥则则藻造葬贼蚤燥灶 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 藻泽贼蚤皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 皂蚤糟则燥泽糟燥责藻 糟燥怎灶贼蚤灶早 枣燥则 贼澡藻 灶怎皂遭藻则泽 燥枣
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发展袁实时荧光 孕悦砸 技术已广泛应用于植物细菌尧
病毒等的检测和定量研究中咱员缘 原 员远暂 袁在土壤植物病原
线虫的定量检测方面也得到了运用袁如大豆孢囊线
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等遥 目前大多数研究均通过直接提取土壤样本总
阅晕粤袁再运用实时荧光 孕悦砸对植物寄生线虫进行检
测和定量袁与传统的形态学观察计数法相比袁实时荧
光 孕悦砸检测效率更高袁但该方法同时也存在以下不
足院第一袁直接提取土壤总 阅晕粤 无法区分线虫的幼
虫和卵袁实时荧光 孕悦砸 过程中受土样中卵 阅晕粤 的
干扰袁最终测定得到的幼虫数量常与实际虫量相差
较大曰第二袁由于方法和试剂的局限袁每次可检测的
土壤样品体积有限袁同时抽提纯化过程中易造成
阅晕粤损失袁难以检测线虫群体密度较低的样本曰第
三袁土壤质地与组成等理化因素不仅会影响 阅晕粤的
提取效率袁而且土样中化学物质及盐离子可能抑制
孕悦砸反应袁造成定量检测结果不准确遥
利用实时荧光 孕悦砸 对植物寄生线虫进行定量
检测时袁往往可能低估或高估土壤中线虫的数
量咱苑 原 愿暂 袁本研究对样本 阅晕粤 的提取方式进行了调
整袁先将土壤样品中的卵与线虫进行分离袁再根据所
建立的标准方程分别对卵和混合线虫样本中的南方
根结线虫 圆 龄幼虫进行实时荧光 孕悦砸定量检测袁排
除了卵对 圆 龄幼虫 阅晕粤 量的影响袁圆 龄幼虫的实时
荧光 孕悦砸定量检测结果与显微镜计数法之间没有
显著性差异袁能够更准确地测定土壤中线虫的群体
密度遥 卵的实时荧光 孕悦砸 定量检测虽然与显微镜
计数结果之间存在极显著相关性袁但检测结果存在
一定差异袁其原因可能是由于采用显微镜计数时对
卵的收集与分离不够彻底袁或计数时存在人为误差
等袁而实时荧光 孕悦砸 检测损失较少且灵敏度较高袁
导致结果有一定的差异遥 本研究建立的南方根结线
虫定量检测体系袁通过结合传统的卵和线虫分离方
法袁不仅适用于微量土壤样本袁也可用于大量土壤样
本的检测遥同时由于对分离到的线虫和卵采用液氮
怨缘圆猿 期 宋志强等院土壤中南方根结线虫的实时荧光 孕悦砸检测和定量
反复冻融法快速提取 阅晕粤袁既节省时间袁又减少了
土壤 阅晕粤 提取试剂盒对线虫核酸的损失及土样中
盐离子对 孕悦砸扩增的影响袁极大地提高了检测效率
和结果的准确性遥
近年来随着分子生物学技术的快速发展袁实时
荧光定量 孕悦砸尧环介导等温扩增渊 造燥燥责 皂藻凿蚤葬贼藻凿 蚤泽燥鄄
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定中表现出了极大的优势袁与此同时不同技术在实
际运用过程中均存在一定的局限性袁因此袁有待于进
一步将上述技术进行改进和结合袁从而在生产实践
中有效地推广和应用遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
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