全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（３）： ４５２ － ４５８ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０３􀆰 ０１４
基金项目：海南大学社会服务专项基金（ＨＤＳＦ２０１３０５），国家现代农业（橡胶树）产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃０３４⁃ＧＷ８），国家自然科学基金
（３１１６０３５９）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｍｉａｏ＠ ｈａｉｎｕ． ｅｄｕ． ｃｎ， ｚｈｅｎｇｆｕｃｏｎｇ＠ １２６． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － １１ － １０
解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 抑菌活性成分的分析
王皓楠　 靳鹏飞　 刘文波　 林春花　 缪卫国∗　 郑服丛∗
（海南大学环境与植物保护学院， 海口 ５７０２２８）
摘要： 为明确解淀粉芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＡＢ⁃６ 菌株的抑菌活性物质，采用平板对
峙法检测其对 １７ 种植物病原真菌的拮抗能力，通过硫酸铵沉淀法、酸沉淀法、有机溶剂萃取法提取
ＨＡＢ⁃６ 菌株的活性物质，并检测其稳定性。 结果表明：解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株对 １７ 种植物病
原真菌均具有良好的抑菌活性，抑制率可达 ４５􀆰 ４８％ ～ ７２􀆰 ２０％ ；不同提取方法中仅正丁醇粗提物
有抑菌活性，在 ５ ｍｇ ／ ｍＬ浓度下抑菌圈直径达 ２１􀆰 ４９ ｍｍ；正丁醇粗提物经紫外线照射 １２０ ｍｉｎ后，
抑菌活性为对照的 ７８％ ，而经 １００℃高温处理后抑菌活性仍为对照的 ９１％ ，表明 ＨＡＢ⁃６ 菌株的活
性物质具有较好的热稳定性；但不耐强酸强碱，其适宜的 ｐＨ为 ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０。 正丁醇粗提物可抑制芒
果炭疽病菌孢子萌发和菌丝生长，能有效抑制芒果炭疽病菌对芒果果实的侵染。 表明 ＨＡＢ⁃６ 菌株
抑菌谱广，其正丁醇提取物具较强的抑菌活性和较好的稳定性，具有良好的开发应用前景。
关键词： 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６； 抑菌活性； 稳定性； 正丁醇粗提物
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＡＢ⁃６
Ｗａｎｇ Ｈａｏｎａｎ　 Ｊｉｎ Ｐｅｎｇｆｅｉ　 Ｌｉｕ Ｗｅｎｂｏ　 Ｌｉｎ Ｃｈｕｎｈｕａ　 Ｍｉａｏ Ｗｅｉｇｕｏ∗ 　 Ｚｈｅｎｇ Ｆｕｃｏｎｇ∗
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８， Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ
ＨＡＢ⁃６， ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６ ａｇａｉｎｓｔ １７ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｐｌａｔｅ ｄｕａｌ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６， ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｐｏｔｅｎｔ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ
４５􀆰 ４８％ ｔｏ ７２􀆰 ２０％ ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｏｎｌｙ ｔｈｅ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ （５ ｍｇ ／ ｍＬ） ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｓｔｒｏｎｇ
ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｉｔｈ ａ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｏｆ ２１􀆰 ４９ ｍｍ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅｔａｉｎｅｄ ８７％ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ａ １２０ ｍｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ＵＶ， ａｎｄ ９１％ ｏｆ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｔ １００℃ ．
Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｅｎｄｕｒｅ ｅｘｔｒｅｍｅ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ； ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐＨ
ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ５􀆰 ０ ｔｏ ９􀆰 ０． Ｔｈｅ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｈａｅ， ｔｈｅｒｅｂｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｆｒｏｍ
ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｍａｎｇｏ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ａ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ
ａｌｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ， ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＨＡＢ⁃６； ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ
　 　 枯草芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 广泛存在于自然
界，是研究较为深入的优良生防菌，对多种植物病害
有良好的防治效果，对人畜无明显伤害，能够产生多
种抗菌活性物质，包括由非核糖体途径合成的非核
体糖肽类抗生素及由核糖体途径合成的细菌素、酶
类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等（Ｔａｍｅｈｉｒｏ
ｅｔ ａｌ． ， ２００２；高学文等， ２００３； Ｏｎｇｅｎａ ＆ Ｊａｃｑｕｅｓ，
２００８）。 枯草芽胞杆菌产生的抗菌物质主要通过溶
解细胞壁或细胞膜，造成原生质泄露，菌丝断裂或畸
形，同时也抑制孢子萌发（南楠等，２０１２）。 枯草芽
胞杆菌近缘种群包括短小芽胞杆菌 Ｂ． ｐｕｍｉｌｕｓ、地
衣芽胞杆菌 Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、解淀粉芽胞杆菌 Ｂ．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ和萎缩芽胞杆菌 Ｂ． ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ（曹
凤鸣等，２０１４）。 解淀粉芽胞杆菌在自身生长过程
中也可以产生一系列的代谢产物，具有抑制真菌和
细菌的活性（权春善等，２００６），可通过产生小分子
量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物质抑制多种
植物病原菌，在防治植物病害中发挥了重要作用，因
而成为具有生物农药开发潜力的微生物（ Ｂａｉｓ ｅｔ
ａｌ． ，２００４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ，２００７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。
芽胞杆菌通过不同的机制抑制病原真菌，如抑
制孢子萌发，菌丝异常肿胀或溶解等 （ Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ
ａｌ． ，２００７）。 然而，生防菌制剂抑菌作用与菌剂使用
时的温度、湿度、ｐＨ 值等因素密切相关（檀根甲等，
２００８）。 由于芽胞杆菌在生防中的重要作用，对其
活性成分的研究已成为国内外的热点，如檀根甲等
（２００８）研究发现枯草芽胞杆菌 ＢＳ８０⁃６ 菌株产生抗
菌素，对苹果果实炭疽病的防治效果最好，菌丝生长
抑制率高达 ８０􀆰 １４％ ；杨琪瑶等（２００２）通过热稳定
性试验发现，枯草芽胞杆菌 Ｂ００６ 菌株甲醇粗提物
经热处理后仍然保持较高的抑菌活性；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．
（２００７）研究表明，从枯草芽胞杆菌 Ｂ⁃９１６ 菌株中分
离到的抗菌蛋白，对油菜菌核病菌 Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏ⁃
ｔｉｏｒｕｍ等多种病原真菌具有明显的抑制作用，代谢
产物可使水稻纹枯病菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ 菌丝分隔
增多变短，菌丝扭曲、肿大、破裂； Ａｒｒｅｂｏｌａ ｅｔ ａｌ．
（２０１０ ） 从水果表面分离出解淀粉芽孢杆菌
ＰＰＣＢ００４ 菌株，发现其对 ７ 种病原真菌均具有抑菌
活性，其抑菌物质为伊草枯菌素 Ａ，对水果采后的病
原真菌有很强的抑菌作用；王彩霞等（２０１２）发现微
嗜酸寡氧单胞菌 Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄａｍｉｎｉｐｈｉｌａ ＢＪ１
菌株对 ８ 种病原真菌有显著的抑菌作用，能降低分
生孢子的萌发率，致使菌丝畸形、分枝增多。
解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株是本实验室从豇
豆中分离得到的内生生防菌，明确其在生物防治过
程中产生抗菌物质的种类，对于生防机理的理解和
提高田间应用的防效具有重要意义。 本试验对
ＨＡＢ⁃６ 菌株的抑菌谱、活性物质、稳定性及抑菌机
制等进行初步研究，以期为进一步分离确定抑菌活
性物质和明确抑菌机理奠定基础。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株由本实
验室保存。 供试病原真菌 １７ 种，包括橡胶树炭疽病
菌 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＨｂＣｇ⁃１、ＨｂＣｇ⁃２、Ｈｂ⁃
Ｃｇ⁃３、ＨｂＣｇ⁃４、ＨｂＣｇ⁃５ 菌株，香蕉枯萎病菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ ＦＯＣ ４⁃１ 和 ＦＯＣ ４⁃２ 菌株，橡
胶树棒孢霉落叶病菌 Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ ＨｂＣｃ⁃１
和 ＨｂＣｃ⁃２ 菌株，芒果炭疽病菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ
ＭｇＣｇ⁃１、绿橙炭疽病菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＣｓＣｇ⁃１、香
蕉炭疽病菌 Ｃ． ｍｕｓａｅ ＭｓＣｇ⁃１、槟榔炭疽病菌 Ｃ．
ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＳａＣｇ⁃１、鱼尾葵炭疽病菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏ⁃
ｒｉｏｉｄｅｓ ＣＧＣ⁃１、黄瓜炭疽病菌 Ｃ． ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ ＣＯＣ⁃１、苦
瓜炭疽病菌 Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＣＯＢ⁃１、脐橙炭疽病菌
Ｃ． ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＣｓＣｇ⁃２ 菌株，均由本实验室分离保
存。 其中芒果炭疽病菌 ＭｇＣｇ⁃１ 菌株作为 ＨＡＢ⁃６ 菌
株抑菌活性测定的主要靶标菌。
培养基：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培养基：胰蛋白
胨 １０ ｇ、酵母粉 ５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ，５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ调 ｐＨ
至 ７􀆰 ０，去离子水定容至 １ Ｌ；马铃薯葡萄糖琼脂
（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基： 马铃薯 ２００ ｇ、
葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ，去离子水定容至 １ Ｌ。
仪器：ＬＡＢＯＲＯＴＡ⁃４０００ 旋转蒸发仪，德国 Ｈｅｉｄｏｌ⁃
ｐｈ公司；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１显微镜，日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＨＡＢ⁃６ 菌株拮抗植物病原真菌的抑菌谱
采用张荣胜等（２０１３）的平板对峙法测定 ＨＡＢ⁃
６ 菌株对供试病原真菌的拮抗作用，在 ＰＤＡ 平板中
央接种植物病原真菌菌饼，在距离菌饼 ２􀆰 ５ ｃｍ处接
种 ＨＡＢ⁃６ 菌株，每个培养皿接种 ４ 次，以只接种植
物病原真菌的平板作为对照，将培养皿倒置于 ２８℃
下培养至对照组菌落占整个培养皿的 ２ ／ ３ 时，用十
字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。 抑制率 ＝
（对照组病原菌抑菌圈直径 －处理组病原菌抑菌圈
直径） ／对照组病原菌抑菌圈直径 × １００％ 。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＨＡＢ⁃６ 菌株活性物质的提取及活性测定
将 ＨＡＢ⁃６ 菌株接种于 ＬＢ 培养基，以 １８０ ｒ ／ ｍｉｎ
３５４３ 期 王皓楠等： 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 抑菌活性成分的分析
于 ２８℃条件下培养 ４８ ｈ。 ＨＡＢ⁃６ 菌株发酵液于
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，去除菌体得离心上清液。
硫酸铵饱和沉淀法：ＨＡＢ⁃６ 菌株发酵离心上清
液，边搅拌边加入硫酸铵至饱和，４℃静置过夜，离心
收集沉淀，用 Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ｐＨ ６􀆰 ８）溶解沉淀，为蛋白粗
提物（杨琦瑶等，２０１２）。
酸沉淀法：参考高学文等（２００３）方法，将ＨＡＢ⁃６
菌株发酵离心上清液用 ６ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＨＣｌ 调 ｐＨ 至
２􀆰 ０，４℃静置过夜，离心收集沉淀，用甲醇溶解沉淀，
为脂肽类物质粗提物。
有机溶剂萃取法：ＨＡＢ⁃６ 菌株发酵离心上清
液，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取 ３ 遍，将
得到的有机相分别减压蒸干，用甲醇溶解萃取物。
参考杨琦瑶等（２０１２）方法，将经硫酸铵饱和沉
淀法、酸沉淀法、有机溶剂萃取法提取的 ＨＡＢ⁃６ 菌
株发酵液提取物溶解于少量甲醇溶液，将浓度调至
５ ｍｇ ／ ｍＬ，通过 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔滤膜过滤。 取各处理
液 １５ μＬ，即每个滤纸片上样品量为 ０􀆰 ０７５ ｍｇ，加入
距病原菌菌落边缘 ３ ｃｍ 处的滤纸片上，以原液、甲
醇为对照。 每处理重复 ３ 次。 ２８℃培养 ５ ｄ 后测量
抑菌圈直径。
１􀆰 ２􀆰 ３ ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物稳定性测定
紫外线稳定性：将 ＨＡＢ⁃６ 菌株活性粗提物放在
功率 ２０ Ｗ紫外灯下垂直距离 ４０ ｃｍ 处，分别照射
３０、６０、９０、１２０ ｍｉｎ 后，对照为不经紫外线照射的活
性粗提物，用滤纸片法测定活性变化。
ｐＨ稳定性：用 ＮａＯＨ 和 ＨＣｌ 分别将 ＨＡＢ⁃６ 菌
株正丁醇粗提物的 ｐＨ 值调为 ２、３、４、５、６、７、８、９、
１０，用滤纸片法测定活性变化。
热稳定性：将 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物分别在
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００℃温度下处理 ２０ ｍｉｎ 后，
冷却至室温，并以室温处理的为对照，用滤纸片法测
定活性变化。
将各处理组样品经 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔滤膜过滤，取
各处理液 １５ μＬ，即每个滤纸片上样品量为 ０􀆰 ０７５
ｍｇ，加入距病原菌菌落边缘 ３ ｃｍ 处的滤纸片上，
２８℃培养 ５ ｄ，测量抑菌圈直径（南楠等，２０１２）
１􀆰 ２􀆰 ４ ＨＡＢ⁃６菌株正丁醇粗提物对病原真菌的影响
采用对峙培养法测定，在平板中央接种病原真
菌菌饼，加入 １５ μＬ ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物在距
离菌饼 ２􀆰 ５ ｃｍ处的滤纸片上，以只接菌饼不加样品
的为对照组。 在洗净晾干的载玻片中央滴 １ 滴清
水，分别挑取对照组和处理组抑菌带边缘的菌丝放
入清水中将其分散均匀，制成真菌临时玻片，置于光
学显微镜下观察植物病原真菌的菌丝形态。
１􀆰 ２􀆰 ５ 芒果果实保护试验
挑取新鲜青绿色的芒果果实，用灭菌水清洗表
皮，无菌接种针轻轻刺破表皮，用棉花将 ＨＡＢ⁃６ 菌
株正丁醇粗提物涂抹在刺破的芒果表皮上，接入新
鲜的芒果炭疽病菌菌饼，以涂抹灭菌水和只接菌饼
的芒果作对照，放入保湿盒中，２５ ± １℃下恒温放置，
３ ｄ后观察芒果感病情况，以确定 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁
醇粗提物对芒果炭疽病的防治效果。
１􀆰 ３ 数据分析
试验数据采用 ＳＰＳＳ １９􀆰 ０ 软件进行统计分析，
应用 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＨＡＢ⁃６ 菌株拮抗植物病原真菌的抑菌谱
ＨＡＢ⁃６ 菌株对 １７ 种供试植物病原真菌均具有
拮抗作用，培养 ５ ｄ 后所有病原真菌均出现明显的
抑菌圈，表明其对所有供试病原真菌的生长均具有
抑制作用（图 １）。 对抑菌圈直径测定计算后，抑制
率可达 ４５􀆰 ４８％ ～７２􀆰 ２０％ ；其中 ＨＡＢ⁃６ 菌株对脐橙
炭疽病菌的抑制率最高，达到 ７２􀆰 ２０％ ，对香蕉枯萎
病菌的抑制率最低，为 ４５􀆰 ４８％ （图 ２）。
２􀆰 ２ ＨＡＢ⁃６ 菌株活性成分的初步提取
采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 ＨＡＢ⁃６ 菌
株发酵上清液，结果显示仅正丁醇萃取物有抑菌活
性，抑菌圈直径大小为 ２１􀆰 ４９ ｍｍ，而石油醚、乙酸乙
酯萃取物以及萃取后的发酵上清液均没有抑菌活
性，用酸沉淀法提取的脂肽类物质和用饱和硫酸铵
沉淀法提取的蛋白均没有抑菌活性（图 ３）。
２􀆰 ３ ＨＡＢ⁃６ 菌株活性成分的稳定性
２􀆰 ３􀆰 １ 紫外线稳定性
经不同时间段紫外线照射，５ ｍｇ ／ ｍＬ 的 ＨＡＢ⁃６
菌株正丁醇提取物抑菌活性发生一定变化，各处理
间差异基本显著，未经紫外线照射的正丁醇粗提物，
抑菌圈直径达 １９􀆰 ８７ ｍｍ；处理 ３０ ｍｉｎ，抑菌活性最
强，抑菌圈直径达 １６􀆰 ９７ ｍｍ， 至 １２０ ｍｉｎ时，抑菌圈
直径达 １５􀆰 ４１ ｍｍ，为对照的 ７８％ 。 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁
醇粗提物的抑菌圈直径始终保持在 １５ ｍｍ 以上（图
４），说明正丁醇粗提物对紫外线的照射有一定耐
受性。
２􀆰 ３􀆰 ２ ｐＨ稳定性
５ ｍｇ ／ ｍＬ的 ＨＡＢ⁃６ 正丁醇粗提物 ｐＨ 在 ５􀆰 ０ ～
９􀆰 ０ 时，抑菌圈直径较大，ｐＨ ５􀆰 ０ 时最大，为 １８􀆰 ７５
ｍｍ，但在强酸和强碱处理下抑菌活性均呈下降趋
４５４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 １ 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株菌体抑菌谱试验
Ｆｉｇ． １ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ
１： ＨｂＣｇ⁃１； ２： ＨｂＣｇ⁃２； ３： ＨｂＣｇ⁃３； ４： ＨｂＣｇ⁃４； ５： ＨｂＣｇ⁃５； ６： ＭｇＣｇ⁃１； ７： ＣｓＣｇ⁃１； ８： ＭｓＣｇ⁃１； ９： ＳａＣｇ⁃１； １０： ＣＧＣ⁃１；
１１： ＣＯＣ⁃１； １２： ＣＯＢ⁃１； １３： ＦＯＣ ４⁃１； １４： ＦＯＣ ４⁃２； １５： ＨｂＣｃ⁃１； １６： ＨｂＣｃ⁃２； １７： ＣｓＣｇ⁃２．
　
势，即 ｐＨ为 ２􀆰 ０ ～ ４􀆰 ０ 时，抑菌活性下降，抑菌圈直
径下降了 ２４􀆰 ７％ ，但仍为对照的 ７５％以上；ｐＨ 为
１２􀆰 ０ 时抑菌活性也明显减弱，抑菌圈直径最小，为
９􀆰 ６８ ｍｍ，仅为对照的 ５２􀆰 １％ （图 ４）。 表明该抑菌
活性物质不耐强酸强碱，适宜 ｐＨ为 ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０。
２􀆰 ３􀆰 ３ 热稳定性
５ ｍｇ ／ ｍＬ 的 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物经不同
温度处理 ２０ ｍｉｎ 后，随着温度的升高，抑菌活性降
低，但各处理间差异不显著，抑菌圈直径均在 １８ ｍｍ
以上，加热至 １００℃，抑菌圈直径为 １８􀆰 ３４ ｍｍ，是室
温条件下的 ９１％ （图 ４）。 说明正丁醇粗提物有较
强的耐热性。
２􀆰 ４ ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物对菌丝生长的影响
对照组病菌菌丝生长正常，粗细均匀，有正常生
长的分生孢子（图 ５⁃Ａ），而处理组未发现分生孢子，
病菌菌丝受到 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物的抑制，菌
丝稀疏，呈现畸形扭曲，局部膨大变粗，菌丝细小，局
部断裂（图 ５⁃Ｂ）。 说明 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物
能够抑制芒果炭疽病菌分生孢子的产生，影响菌丝
生长，造成菌丝形态发生变化，从而达到抑菌效果。
５５４３ 期 王皓楠等： 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 抑菌活性成分的分析
图 ２ 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株对供试
病原真菌的抑制率
Ｆｉｇ． ２ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｅｓｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
图中数据为平均数 ± 标准差。 不同字母表示经
Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。
Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ
ｔｅｓｔ． １： ＨｂＣｇ⁃１； ２： ＨｂＣｇ⁃２； ３： ＨｂＣｇ⁃３； ４： ＨｂＣｇ⁃４； ５：
ＨｂＣｇ⁃５； ６： ＭｇＣｇ⁃１； ７： ＣｓＣｇ⁃１； ８： ＭｓＣｇ⁃１； ９： ＳａＣｇ⁃１；
１０： ＣＧＣ⁃１； １１： ＣＯＣ⁃１； １２： ＣＯＢ⁃１； １３： ＦＯＣ ４⁃１； １４：
ＦＯＣ ４⁃２； １５： ＨｂＣｃ⁃１； １６： ＨｂＣｃ⁃２； １７： ＣｓＣｇ⁃２．
　
图 ４ 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物的稳定性
Ｆｉｇ． ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＵＶ ｒａｄｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｒｏｍ ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ
图中数据为平均数 ±标准差。 不同字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ±
ＳＤ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ． 　
２􀆰 ５ 对芒果果实的保护能力
在新鲜的青绿色芒果（图 ６⁃Ａ）上接入芒果炭疽
病菌菌饼，３ ｄ后可以看到，无菌水对照组的芒果被
炭疽病菌侵染，菌丝生长迅速，果实腐烂且呈黄色
（图 ６⁃Ｂ）；而涂抹了 ５ ｍｇ ／ ｍＬ的 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇
粗提物的芒果，接种菌饼处感病轻，芒果炭疽病菌基
本停止生长（图 ６⁃Ｃ）。 说明 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗
提物能够有效抑制芒果炭疽病的生长和侵染。
３ 讨论
本研究将 ＨＡＢ⁃６ 菌株与 １７ 种植物病原真菌对
峙培养，结果表明 ＨＡＢ⁃６ 菌株对供试植物病原真菌
图 ３ 不同 ＨＡＢ⁃６ 菌株发酵液提取物的活性检测
Ｆｉｇ． ３ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ
１： ＨＡＢ⁃６ 菌株萃取后发酵上清液； ２： 正丁醇粗提
物； ３： 石油醚粗提物； ４： 乙酸乙酯粗提物； ５： 脂肽类
物质粗提物； ６： 硫酸铵沉淀粗提物。 １： ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｆｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ２： ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ
ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ； ３： ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ； ４： ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ； ５： ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ； ６： ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ
ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．
　
均有很好的抑菌活性。 通过有机溶剂萃取法、酸沉
淀法、硫酸铵沉淀等方法，初步提取了 ＨＡＢ⁃６ 菌株
发酵液中的抑菌活性成分，经萃取后的 ＨＡＢ⁃６ 菌株
发酵上清液没有抑菌活性，只有正丁醇粗提物显示
抑菌活性，说明抑菌物质全部存在于正丁醇萃取物
中，结合稳定性的研究结果，推测抑菌物质为小分子
芳香族类化合物，但抑菌活性物质的分离和结构确
定还有待进一步研究。
不同芽胞杆菌菌株产生的抑菌物质存在较大差
异。 Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （２０１２）发现芽胞杆菌 Ａ５Ｆ 菌株发
酵液具有良好的热稳定性，在较广的 ｐＨ 范围内抑
菌作用不受影响；汪澈等（２００５）研究表明枯草芽胞
杆菌 Ｂ９６０１⁃Ｙ２ 菌株抑菌蛋白不耐高温，１２０℃热处
理 ３０ ｍｉｎ后活性全部丧失；翟茹环等（２００７）报道枯
草芽胞杆菌 Ｇ８ 菌株抑菌蛋白对酸稳定，在 ｐＨ 为 １
６５４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ５ 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物对芒果炭疽病菌菌丝的影响
Ｆｉｇ． ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｒｏｍ ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ
Ａ： 正常菌丝形态； Ｂ： 正丁醇粗提物处理后的菌丝形态。 Ａ： Ｎｏｒｍａｌ ｍｙｃｅｌｉａｌ； Ｂ： ｔｒｅａｔｅｄ ｍｙｃｅｌｉａ．
　
图 ６ ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物对芒果果实的保护作用
Ｆｉｇ． ６ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｎ⁃ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｒｏｍ ＨＡＢ⁃６ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｏ ｆｒｕｉｔｓ
Ａ： 处理前芒果果实； Ｂ： 对照； Ｃ： 正丁醇粗提物处理果实。 Ａ： Ｐｒｅ⁃ｔｒｅａｔｅｄ ｍａｎｇｏ； Ｂ： ＣＫ； Ｃ： ｔｒｅａｔｅｄ ｍａｎｇｏ．
　
时仍保持 ６９􀆰 ２％的活性；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００８）发现枯
草芽胞杆菌 Ｂ⁃ＦＳ０６ 菌株的抑菌蛋白对热稳定，枯草
芽胞杆菌 ＢＡＢ⁃１ 菌株活性物质对 ｐＨ 不敏感（钱长
娣等，２００９）。 本研究稳定性试验结果显示，ＨＡＢ⁃６
菌株正丁醇粗提物耐热性良好，对紫外线照射有良
好的耐性，这些特性可适用于田间强日照条件下储
存及应用。 尽管 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物不耐强
酸强碱，但在 ｐＨ ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 范围内具有较好的抑菌
活性。
ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物的浓度为 ５ ｍｇ ／ ｍＬ
时，即每个测试组样品量为 ０􀆰 ０７５ ｍｇ，抑菌圈直径
达到 ２１􀆰 ４９ ｍｍ，证明正丁醇粗提物在较低的浓度下
具有极强的抑制植物病原真菌的能力，且主要通过
抑制芒果炭疽病菌孢子的产生和菌丝的生长，从而
达到抑制病原菌的作用。 枯草芽胞杆菌防治植物真
菌病害的主要机理是其能够对真菌分生孢子萌发过
程造成影响，抑制芽管生长使其膨大，甚至产生空
洞，胞内物质外泄，从而使病原菌丧失对植物的侵染
能力（钱长娣等，２００９）。 类似的报道如解淀粉芽胞
杆菌 ＦＺＢ４２ 菌株，通过改变黄单胞菌的细胞壁和细
胞结构，抑制其生长。 高学文等（２００３）研究发现，
枯草芽胞杆菌 Ｂ２ 菌株产生的多烯类化合物有抑制
真菌孢子萌发的作用。 Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２００７）从枯草芽胞
杆菌分离到的抗真菌蛋白能强烈抑制稻瘟病菌
Ｐｈｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ、立枯丝核菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌｕｎｉ 和
灰霉菌 Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ等重要病原真菌的菌丝生长。
本试验中 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物涂抹芒果后，可
抑制芒果炭疽病菌对芒果的侵染。
因此，通过对 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提物稳定性
试验和抑菌试验研究，表明 ＨＡＢ⁃６ 菌株正丁醇粗提
物具有很强的抑菌活性且相对较稳定，有利于生防
产品的开发应用及存贮。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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７５４３ 期 王皓楠等： 解淀粉芽胞杆菌 ＨＡＢ⁃６ 抑菌活性成分的分析
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（责任编辑：李美娟）
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