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Distribution of apple skin scar viroid in seeds of Malus robusta Rehd. and viroid elimination by NaOH treatment

苹果锈果类病毒在八棱海棠种子中的分布及氢氧化钠脱毒效果分析



全 文 :第 源员 卷摇 第 猿 期
圆园员源 年 远 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 猿
允怎灶藻 摇 圆园员源

基金项目院 国家苹果产业技术体系项目渊悦粤砸杂鄄圆愿冤
作者简介院 郭超袁女袁员怨愿愿年生袁硕士研究生袁研究方向为苹果病毒传播途径袁 耘鄄皂葬蚤造院 早怎燥糟澡葬燥怨怨远远员苑愿怨苑岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 泽澡葬燥躁扎澡岳 圆员糟灶援 糟燥皂袁 躁蚤葬灶泽澡藻葬责责造藻岳 员远猿援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 园怨 原 员圆
苹果锈果类病毒在八棱海棠种子中的
分布及氢氧化钠脱毒效果分析
郭摇 超摇 邵建柱鄢摇 乔雪华摇 孙建设鄢
渊河北农业大学园艺学院袁 保定 园苑员园园园冤
摘要院 为明确苹果锈果类病毒在八棱海棠果实和种子中的分布特征尧种传率以及药剂脱除效果袁以
带毒母株上的八棱海棠果实和种子为试材袁运用 砸栽鄄孕悦砸 技术分析了八棱海棠果实不同部位锈果
类病毒的带毒率尧实生后代的带毒情况以及氢氧化钠脱除病毒的效果遥 结果表明袁八棱海棠果皮尧
果肉尧种子以及种胚均不同程度携带苹果锈果类病毒袁其带毒率分别为 怨远援 园豫 尧怨远援 园豫 尧缘圆援 园豫和
源援 园豫 曰该病毒可经种子传递给后代袁种传率为 员圆援 员豫 曰经 圆豫氢氧化钠溶液浸种 员园尧员缘尧圆园 皂蚤灶袁种
子的病毒检出率均为 园袁但后代实生苗的带毒率分别为 圆援 缘豫 尧员援 猿豫和 园遥 表明苹果锈果类病毒可
侵染种子不同部位并经种子传递给后代袁氢氧化钠浸种是脱除该病毒的有效方法遥
关键词院 苹果锈果类病毒曰 八棱海棠曰 种子曰 分布曰 脱毒
阅蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 燥枣 葬责责造藻 泽噪蚤灶 泽糟葬则 增蚤则燥蚤凿 蚤灶 泽藻藻凿泽 燥枣 酝葬造怎泽 则燥遭怎泽贼葬 砸藻澡凿援
葬灶凿 增蚤则燥蚤凿 藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶 遭赠 晕葬韵匀 贼则藻葬贼皂藻灶贼
郧怎燥 悦澡葬燥摇 杂澡葬燥 允蚤葬灶扎澡怎鄢摇 匝蚤葬燥 载怎藻澡怎葬摇 杂怎灶 允蚤葬灶泽澡藻鄢
渊悦燥造造藻早藻 燥枣 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则藻袁 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 匀藻遭藻蚤袁 月葬燥凿蚤灶早 园苑员园园园袁 匀藻遭藻蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽燥 凿藻贼藻则皂蚤灶藻 贼澡藻 凿蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 燥枣 葬责责造藻 泽噪蚤灶 泽糟葬则 增蚤则燥蚤凿 渊粤杂杂灾凿冤 蚤灶 枣则怎蚤贼泽 葬灶凿 泽藻藻凿泽 燥枣 酝葬造怎泽
则燥遭怎泽贼葬 砸藻澡凿援 袁 贼澡藻 责藻则糟藻灶贼葬早藻 燥枣 泽藻藻凿 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶 葬灶凿 贼澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 圆豫 晕葬韵匀 燥灶 贼澡藻 增蚤则怎泽 藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶袁
贼澡藻 砸栽鄄孕悦砸 泽赠泽贼藻皂 憎藻则藻 怎泽藻凿 贼燥 凿藻贼藻糟贼 粤杂杂灾凿 蚤灶 贼澡藻 枣则怎蚤贼泽袁 泽藻藻凿泽 葬灶凿 泽藻藻凿造蚤灶早泽 燥枣 酝援 则燥遭怎泽贼葬援 栽澡藻
则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 责藻藻造袁 枣造藻泽澡袁 泽藻藻凿 葬灶凿 泽藻藻凿 藻皂遭则赠燥 憎藻则藻 蚤灶枣藻糟贼藻凿 遭赠 粤杂杂灾凿袁 葬灶凿 贼澡藻 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶
则葬贼藻泽 憎藻则藻 怨远郾 园豫 袁 怨远郾 园豫 袁 缘圆郾 园豫 葬灶凿 源郾 园豫 袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 责藻则糟藻灶贼葬早藻 燥枣 泽藻藻凿 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶 憎葬泽
员圆郾 员豫 援 粤杂杂灾凿 蚤灶 泽藻藻凿泽 泽燥葬噪藻凿 蚤灶 圆豫 晕葬韵匀 泽燥造怎贼蚤燥灶 枣燥则 员园袁 员缘 葬灶凿 圆园 皂蚤灶 憎葬泽 藻枣枣藻糟贼蚤增藻造赠 藻造蚤皂蚤灶葬贼藻凿
葬灶凿 贼澡藻 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻泽 燥枣 贼澡藻 泽藻藻凿造蚤灶早泽 憎藻则藻 圆郾 缘豫 袁 员郾 猿豫 葬灶凿 园袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 则藻泽藻葬则糟澡 糟燥灶枣蚤则皂藻凿
贼澡葬贼 粤杂杂灾凿 糟燥怎造凿 蚤灶枣藻糟贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责葬则贼泽 燥枣 贼澡藻 泽藻藻凿泽 燥枣 酝援 则燥遭怎泽贼葬 葬灶凿 泽责则藻葬凿 贼燥 贼澡藻 灶藻曾贼 早藻灶藻则葬贼蚤燥灶援
杂燥葬噪蚤灶早 贼澡藻 泽藻藻凿泽 蚤灶 贼澡藻 泽燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 圆豫 晕葬韵匀 枣燥则 圆园 皂蚤灶 糟燥怎造凿 遭藻 葬灶 藻枣枣藻糟贼蚤增藻 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 则藻皂燥增蚤灶早 贼澡藻
增蚤则燥蚤凿援
运藻赠 憎燥则凿泽院 粤杂杂灾凿曰 酝葬造怎泽 则燥遭怎泽贼葬 砸藻澡凿援 曰 泽藻藻凿曰 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤燥灶曰 藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶
摇 摇 苹果花脸病是由苹果锈果类病毒渊 葬责责造藻 泽噪蚤灶
泽糟葬则 增蚤则燥蚤凿袁粤杂杂灾凿冤引起的一种苹果病毒病袁可造成
果实变扁尧花脸尧畸形和裂果咱员暂 遥 近年来袁苹果花脸
病的发生呈上升趋势袁个别果园发病率超过 缘园豫 袁
给苹果生产造成严重的经济损失咱圆暂 遥 针对这一现
状袁研究者提出培育无病毒苗木是防治花脸病的根
本措施咱猿 原 源暂 遥 目前我国普遍应用的无病毒苗木繁育
方式袁是以种子播种获得的实生苗作基砧袁其上嫁接
脱毒的矮化中间砧和品种遥 这种无毒苗生产方式的
前提就是由种子繁殖的实生苗不携带病毒咱缘 原 远暂 袁但
孟素琴等咱苑暂在实际生产中发现实生苗表现病毒病
症状遥 苹果锈果类病毒能否侵染砧木种子并传给实
生后代袁至今未见报道遥
八棱海棠适应性强袁耐盐碱袁是我国北方苹果主
产区应用最广泛的苹果砧木之一咱愿暂 遥 本研究以具
明显花脸症状并经检测确认携带 粤杂杂灾凿 的成龄八
棱海棠树为试材袁运用 砸栽鄄孕悦砸技术对其果实尧种子
不同部位及其实生苗进行检测袁以期明确该病毒在
八棱海棠果实及种子中的分布特征及种传率曰同时
采用氢氧化钠溶液对种子进行浸种处理袁以期明确
脱除 粤杂杂灾凿的适宜方法袁为花脸病的防控和无病毒
实生砧木苗的培育提供科学依据遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试植物院八棱海棠种子采自我国八棱海棠主
产地河北省怀来县袁选择田间发病症状明显并经
砸栽鄄孕悦砸检测确定携带 粤杂杂灾凿 的八棱海棠成龄树袁
采集其果实带回实验室备用遥
试剂院 砸晕粤蚤泽燥鄄皂葬贼藻 枣燥则 孕造葬灶贼 栽蚤泽泽怎藻 和 砸晕粤蚤泽燥
孕造怎泽购自宝生物工程渊大连冤有限公司曰砸晕粤责造葬灶贼 植
物总 砸晕粤 提取试剂购自天根生化科技有限公司曰
耘葬泽赠杂则蚤责贼 云蚤则泽贼鄄杂贼则葬灶凿 糟阅晕粤 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 杂怎责藻则皂蚤曾 购自
北京全式金生物技术有限公司曰圆 伊 耘泽 栽葬择 酝葬泽贼藻则鄄
酝蚤曾购自北京康为世纪生物科技有限公司曰氢氧化
钠袁纯度不低于 怨远援 园豫 袁购自天津市天力化学试剂
有限公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 八棱海棠果实及种子的病毒检测前处理
随机选取 员园园 枚八棱海棠果实袁清水冲洗干净袁
用小刀将果皮尧果肉和种子分开袁分别用锡箔纸包
好袁编号渊皮尧肉尧种子对应冤袁再用液氮速冻袁 原 源园 益
保存备用遥 再取 员园园 粒种子袁清水浸泡袁待吸涨后袁
用镊子轻轻剥离种皮和种胚袁用蒸馏水将种胚冲洗
干净后袁晾干备用遥
员援 圆援 圆 八棱海棠种子氢氧化钠脱毒处理
随机选取饱满的八棱海棠种子 源园园 粒袁清水浸
泡 源 澡袁然后用 圆豫氢氧化钠溶液浸泡袁浸种时间设
员园尧员缘尧圆园 皂蚤灶共 猿 个处理袁以清水浸泡种子做对照袁
每个处理 员园园 粒种子曰浸泡完毕后用清水反复冲洗袁
晾干袁进行病毒检测遥
员援 圆援 猿 八棱海棠实生苗培养
将清水浸泡和 圆豫氢氧化钠处理 员园尧员缘尧圆园 皂蚤灶
的种子袁在 圆 耀 源 益冷库层积处理 远园 凿袁然后在温室
进行营养钵育苗袁待实生苗长到 员园 糟皂左右时袁逐一
取样渊叶片冤袁进行病毒检测遥
员援 圆援 源 样品总 砸晕粤的提取及 粤杂杂灾凿的 砸栽鄄孕悦砸检测
八棱海棠果实的果皮尧果肉采用 砸晕粤责造葬灶贼植物
总 砸晕粤 提取试剂进行提取袁种子尧种胚以及后代实
生苗采用 砸晕粤蚤泽燥鄄皂葬贼藻 枣燥则 孕造葬灶贼 栽蚤泽泽怎藻 和 砸晕粤蚤泽燥
孕造怎泽试剂进行总 砸晕粤的提取遥
八棱海棠果实不同部位及实生苗病毒检测参照
陈红霞等咱怨暂方法遥 测定以田间经 砸栽鄄孕悦砸 检测确定
携带 粤杂杂灾凿成龄苹果树的枝皮组织为阳性对照袁进
口无毒苹果苗的枝皮组织为阴性对照袁并计算带毒
率和脱毒效率袁带毒率 越 渊检出病毒样本数 辕检测样
本总数冤 伊 员园园豫 曰脱毒效率 越 渊员 原 处理后的带毒
率 辕对照带毒率冤 伊 员园园豫 遥
圆 结果与分析
圆援 员 八棱海棠果实不同部位 粤杂杂灾凿的分布
如图 员 所示袁砸栽鄄孕悦砸 扩增结果显示阳性对照
得到了大小 猿猿园 遭责的 粤杂杂灾凿条带袁且目的条带清晰
明亮曰阴性对照和空白对照无特异条带曰试材也有
粤杂杂灾凿的表达曰因此检测体系准确可靠遥
病毒检测结果表明袁于病株上采集的八棱海棠
果实的不同部位均不同程度携带 粤杂杂灾凿袁其中果皮尧
果肉尧种子以及种胚的带毒率分别为 怨远郾 园豫 尧
怨远郾 园豫 尧缘圆郾 园豫和 源郾 园豫 遥 果实中果皮和果肉同时
携带 粤杂杂灾凿占所检果实样品的 怨圆郾 园豫 曰而仅果皮或
仅果肉携带 粤杂杂灾凿各占所检样品的 源豫 遥
随机选取 员圆 枚果皮和果肉同时携带 粤杂杂灾凿 的
果实袁对其各自所含种子进行病毒检测遥 结果显示袁
同一果实在果皮和果肉均带毒的情况下袁其包含的
若干粒种子之间带毒情况各异遥 其中袁缘 枚果实表
现为种子全部带毒袁占所检果实样品的 源员郾 苑豫 曰远 枚
果实的种子部分带毒袁占样品的 缘园郾 园豫 曰仅有 员 枚
果实袁其所含的种子无病毒检出袁占所检果实样品的
愿郾 猿豫 渊表 员冤遥
圆援 圆 八棱海棠种子传毒率检测
带毒母株上采集的种子经播种获得的 员员远 株实
生苗中袁有 员源 株携带 粤杂杂灾凿袁其带毒率即种子传毒
率达 员圆郾 员豫 袁较种子带毒率 缘圆郾 园豫明显降低袁但高
于种胚带毒率 源郾 园豫 遥
猿源猿猿 期 郭摇 超等院 苹果锈果类病毒在八棱海棠种子中的分布及氢氧化钠脱毒效果分析
图 员 八棱海棠果实不同部位 粤杂杂灾凿的 砸栽鄄孕悦砸扩增结果
云蚤早援 员 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 粤杂杂灾凿 蚤灶 枣则怎蚤贼泽 燥枣 酝葬造怎泽 则燥遭怎泽贼葬 遭赠 砸栽鄄孕悦砸
摇 摇 员 耀 圆院种胚曰猿 耀 源院种子曰缘 耀 远院果皮曰苑 耀 愿院果肉曰怨院阳性对照曰员园院阴性对照曰员员院空白对照曰酝院阅晕粤 酝葬则噪藻则遥 员 原 圆院 杂藻藻凿 藻皂遭则赠燥曰
猿 原 源院 泽藻藻凿曰 缘 原 远院 责藻藻造曰 苑 原 愿院 枣造藻泽澡曰 怨院 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 员园院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 员员院 遭造葬灶噪 糟燥灶贼则燥造曰 酝院 阅晕粤 酝葬则噪藻则援
表 员 八棱海棠同一果实内全部种子的带毒情况检测
栽葬遭造藻 员 陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 葬造造 泽藻藻凿泽 蚤灶 贼澡藻 泽葬皂藻 枣则怎蚤贼 燥枣 酝葬造怎泽 则燥遭怎泽贼葬 砸藻澡凿援
果实编号
杂藻则蚤葬造 灶怎皂遭藻则 燥枣 枣则怎蚤贼
种子数 辕个
晕怎皂遭藻则 燥枣 泽藻藻凿泽
带毒种子数 辕个
晕怎皂遭藻则 燥枣 蚤灶枣藻糟贼藻凿 泽藻藻凿泽
带毒率 渊豫 冤
陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻
员 远 猿 缘园援 园
圆 圆 圆 员园园援 园
猿 源 员 圆缘援 园
源 员园 圆 圆园援 园
缘 源 员 圆缘援 园
远 猿 员 猿猿援 猿
苑 猿 猿 员园园援 园
愿 猿 圆 远远援 苑
怨 苑 苑 员园园援 园
员园 圆 园 园援 园
员员 圆 圆 员园园援 园
员圆 圆 圆 员园园援 园
圆援 猿 圆豫氢氧化钠溶液脱毒效果
对 圆豫氢氧化钠溶液浸泡 员园尧员缘 和 圆园 皂蚤灶 的八
棱海棠种子及其各自实生苗进行病毒检测袁发现 猿
个脱毒处理的种子均未检出 粤杂杂灾凿曰实生苗却有不
同程度的病株检出袁其带毒率分别为 圆援 缘豫 尧员援 猿豫
和 园袁低于种子传毒率 员圆援 员豫 遥 可见氢氧化钠浸种
能有效脱除 粤杂杂灾凿袁且浸种时间越长袁实生后代的带
毒率越低袁脱毒效果越好渊表 圆冤遥
表 圆 圆豫氢氧化钠不同浸种时间脱除 粤杂杂灾凿的效果
栽葬遭造藻 圆 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 泽燥葬噪蚤灶早 贼蚤皂藻 憎蚤贼澡 圆豫 晕葬韵匀 燥灶 粤杂杂灾凿 藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶 豫
处理时间 渊皂蚤灶冤
栽则藻葬贼皂藻灶贼 贼蚤皂藻
种子带毒率
陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 泽藻藻凿泽
种子脱毒效率
耘枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 增蚤则燥蚤凿
藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 泽藻藻凿泽
实生苗带毒率
陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 泽藻藻凿造蚤灶早泽
实生苗脱毒效率
耘枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 增蚤则燥蚤凿
藻造蚤皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 泽藻藻凿造蚤灶早泽
园 远远援 园渊远远 辕 员园园冤 要 员圆援 员渊员源 辕 员员远冤 要
员园 园援 园渊园 辕 员园园冤 员园园援 园 圆援 缘渊圆 辕 愿园冤 怨苑援 缘
员缘 园援 园渊园 辕 员园园冤 员园园援 园 员援 猿渊员 辕 愿园冤 怨愿援 苑
圆园 园援 园渊园 辕 员园园冤 员园园援 园 园援 园渊园 辕 愿园冤 员园园援 园
摇 摇 括号内的数字表示带毒样本数与检测样本总数之比遥 阅葬贼葬 蚤灶 遭则葬糟噪藻贼泽 则藻责则藻泽藻灶贼 贼澡藻 则葬贼蚤燥 燥枣 贼澡藻 灶怎皂遭藻则 燥枣 蚤灶枣藻糟贼藻凿 泽葬皂责造藻泽 葬灶凿 贼澡藻 贼燥贼葬造
灶怎皂遭藻则 燥枣 泽葬皂责造藻泽援
源源猿 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
猿 讨论
目前袁砸栽鄄孕悦砸 技术被广泛应用于苹果尧梨尧桃
和杏中苹果锈果类病毒的检测袁许多研究显示该技
术灵敏度高尧特异性强尧检测结果可靠咱员园 原 员圆暂 遥 故本
研究运用该技术从分子水平首次证实了 粤杂杂灾凿 可
侵染八棱海棠种子袁并能传递给实生后代袁突破了张
团委咱员猿暂报道 粤杂杂灾凿 不能种传的认识局限袁为 粤杂杂鄄
灾凿的预防提供了新途径遥
许多种传病毒的研究显示袁种子传毒的实质是
种胚内病毒的传播与侵染袁种子传毒率与种胚侵染
率直接相关咱员源 原 员缘暂 遥 本研究中八棱海棠种胚侵染率
却明显低于种子传毒率遥 分析可能是与病毒检测技
术的灵敏度有关袁最初种胚内病毒含量极低袁经过种
子萌发和幼苗生长袁病毒增殖至可检出浓度曰也可能
是后代实生苗存在其它的侵染途径袁如在种子发芽
过程中种皮和种表的少部分仍具侵染性的病毒通过
机械微伤侵染了幼苗咱员远暂 袁具体原因还有待进一步深
入研究遥
建立八棱海棠无病毒采种圃是防治 粤杂杂灾凿 种
传的根本途径袁但这一目标短期内无法实现遥 药剂
脱毒成为时下抑制种传病害更快捷有效的方法袁其中
氢氧化钠因其能溶解蛋白和木质素袁增大种皮通透
性咱员苑 原 员怨暂而被广泛应用于植物种传病害的防治咱圆园 原圆员暂 遥
乔雪华等咱圆员暂发现氢氧化钠浸种可有效脱除八棱海
棠种子中的苹果潜隐性病毒袁但氢氧化钠是否也适
用于苹果锈果类病毒的脱除袁至今未见报道遥 本研
究显示 圆豫氢氧化钠溶液浸种 圆园 皂蚤灶 可更加高效地
脱除 粤杂杂灾凿遥 对于试验中脱毒种子未检出病毒袁实
生苗却检出少量病株这一现象袁分析可能是病毒检
出率较低时袁试验样本量不够多而引起的误差遥 总
体来看袁氢氧化钠溶液浸种能有效脱除多种苹果种
传病毒袁针对市售八棱海棠种子带毒情况不明的现
状袁采用氢氧化钠浸种无疑是一种抑制苹果种传病
毒的有效方法遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 张振英袁姜中武援 苹果锈果病的发生途径与预防措施援 河北
果树袁 圆园园愿渊员冤院 猿怨 原 源园
咱圆暂 张宗坤袁秦海林袁戎新克援 木美土里防控苹果花脸病效果初
报援 烟台果树袁 圆园员猿渊员冤院 员远 原 员苑
咱猿暂 王际轩袁 刘志袁 谢秀华袁 等援 苹果无病毒树的生长和结果表
现援 园艺学报袁 圆园园园袁 圆苑渊猿冤院 员缘苑 原 员远园
咱源暂 增葬灶 韵燥泽贼藻灶 匀 允袁 酝藻蚤躁灶藻噪藻 悦 粤 砸袁 孕藻藻则遭燥燥皂泽 匀援 郧则燥憎贼澡袁 赠蚤藻造凿
葬灶凿 枣则怎蚤贼 择怎葬造蚤贼赠 燥枣 增蚤则怎泽鄄蚤灶枣藻糟贼藻凿 葬灶凿 增蚤则怎泽鄄枣则藻藻 郧燥造凿藻灶 阅藻造蚤鄄
糟蚤燥怎泽 葬责责造藻 贼则藻藻泽袁 员怨远愿要员怨愿圆援 粤糟贼葬 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬藻袁 员怨愿猿袁
员猿园院 圆员猿 原 圆圆园
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势援 北方园艺袁 圆园园圆渊猿冤院 远远 原 远苑
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猿缘
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圆园员圆渊员冤院 圆愿 原 圆怨
咱员源暂 酝葬怎则赠 再袁 月燥泽泽藻灶灶藻糟 允 酝袁 月燥怎凿葬扎蚤灶 郧袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 责燥贼藻灶贼蚤葬造 燥枣
耘蕴陨杂粤 蚤灶 贼藻泽贼蚤灶早 泽燥赠遭藻葬灶 泽藻藻凿 枣燥则 泽燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽援 杂藻藻凿
杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨愿猿袁 员员院 源怨员 原 缘园猿
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藻葬泽藻 糟燥灶贼则燥造援 匀燥则贼栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨怨员袁 员院 愿源 原 愿苑
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