全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 163 - 168
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 09 - 28; 修回日期 : 2008 - 01 - 10
基金项目 : 中国博士后科学基金项目 (20060390310) ; 农业部 ‘948’项目 (20062G28)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fwm64@ sina1com)
水杨酸对根际低氧胁迫八棱海棠幼苗活性氧代谢的
影响
白团辉 1 , 马锋旺 1, 23 , 李翠英 1 , 束怀瑞 1, 2 , 韩明玉 1
(1 西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 2 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018)
摘 　要 : 采用营养液水培系统 , 以苹果砧木八棱海棠 (M alus robusta Rehd. ) 为试材 , 用叶面喷施的方
法 , 研究了外源水杨酸 ( salicylic acid, SA) 对根际低氧胁迫下八棱海棠叶片活性氧 (ROS) 代谢的影响。
结果表明 : 低氧胁迫下八棱海棠叶片丙二醛 (MDA )、超氧阴离子 (O2
-· )、过氧化氢 (H2 O2 )、谷胱甘肽
( GSH) 含量和抗氧化酶活性均高于对照 , 而抗坏血酸 (A sA ) 含量低于对照 ; 外源 SA明显抑制 MDA和
O2
-·的积累 , 显著增强超氧化物歧化酶 ( SOD )、过氧化物酶 ( POD )、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 和谷
胱甘肽还原酶 ( GR) 的活性。说明 SA作为化学诱抗剂 , 可抑制低氧胁迫下苹果幼苗体内 ROS的产生 , 提
高抗氧化酶的活性 , 降低膜脂过氧化水平 , 从而减轻低氧胁迫对植株的伤害。
关键词 : 水杨酸 ; 八棱海棠 ; 低氧胁迫 ; 抗氧化酶 ; 活性氧
中图分类号 : S 661　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220163206
Effects of Sa licylic Ac id on Reactive O xygen Spec ies M etabolism in M a lus
robusta Rehd. under Root2zone Hypox ia Stress
BA I Tuan2hui1 , MA Feng2wang1, 23 , L I Cui2ying1 , SHU Huai2rui1, 2 , and HAN M ing2yu1
(1 College of Horticu lture, N orthw est A & F U niversity, Yangling, Shaanxi 712100, Ch ina; 2 College of Horticu lture Science and
Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Taipian, Shandong 271018, China)
Abstract: By means of a system of nutrient solution culture, an app le rootstock, M alus robusta Rehd.
was used to study the effect of foliar app lication of exogenous salicylic acid ( SA ) on reactive oxygen species
metabolism under root2zone hypoxia stress. The results showed that the content of malonaldehyde (MDA ) ,
superoxide radical (O2
-· ) , hydrogen peroxide (H2O2 ) and glutathione ( GSH ) and activities of antioxidant
enzymes under root2zone hypoxia stress were higher than the control. However, the level of ascorbic acid
(A sA ) were decreased. Exogenous SA significantly decreased the content of O2
-·
, MDA and GSH, increased
the activities of superoxide dismutase ( SOD) , peroxidase ( POD ) , ascorbate peroxidase (APX) and gluta2
thione reductase ( GR) under hypoxia stress. Itwas p roposed that exogenous SA as a chem ical activator could
induce resistance, reduce p roduction of reactive oxygen species, raise the activities of anti2oxidative enzymes,
and decrease the membrane lip id peroxidation, therefore it alleviated the damage degree of hypoxia stress of
M alus robusta Rehd.
Key words: salicylic acid; M alus robusta Rehd. ; hypoxia stress; antioxidant enzyme; reactive oxygen
species
土壤雨涝积水、灌溉不均和土壤质地紧实都会造成根际低氧逆境 (Ma⁄gorzata & W aldemar,
2004; 周国贤 等 , 2006)。低氧逆境使细胞内正常的电子传递链被阻断 , 造成 O2
-·、H2 O2等活性氧
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
(ROS) 增加 , 引起细胞结构和功能的破坏 , 影响植物正常生长发育 (Vantoai & Bolles, 1991)。目前
国内外已对低氧胁迫条件下黄瓜、沙棘、羽扇豆和大麦进行了研究 , 表明低氧下植物体内 ROS大量
产生 (Bozena et al. , 2004; Ma⁄gorzata & W aldemar, 2004; Narayanan et al. , 2005; 周国贤 等 ,
2006)。超氧化物歧化酶 ( SOD )、过氧化物酶 ( POD )、过氧化氢酶 (CAT) 和抗坏血酸 —谷胱甘肽
(A sA - GSH) 循环各自通过不同的作用方式清除植物体内产生的 ROS, 从而减弱氧化伤害 ( Prochaz2
kova et al. , 2001; Ma⁄gorzata & W aldemar, 2004)。
水杨酸 ( SA ) 被认为是一种化学诱抗剂 , 能够激活植物抗性防卫反应 , 可以诱导植物对重金属、
臭氧、紫外辐射、低温、热激、水分亏缺和盐害等非生物胁迫产生一定的抗性 ( Raskini & Hamnn,
1987; 李国婧和周燮 , 2001; Jyoti, 2003) , 但外源 SA对植物抗低氧胁迫的研究还未见报道。八棱海
棠是我国特有的植物资源 , 被广泛用作苹果砧木。
本试验通过叶面喷施 SA, 研究了 SA对低氧胁迫下植物体内 ROS代谢的影响 , 以期为利用化学
诱抗剂缓解低氧胁迫伤害提供理论依据。
1　材料与方法
111　材料与试验处理
试验于 2006年 3—11月在西北农林科技大学培养室内进行 , 供试材料为八棱海棠。3月份将层
积处理后的种子播入营养钵中 (基质为珍珠岩 ∶泥炭 ∶表土 = 1∶1∶1) , 10片真叶时 , 6月 10日选均匀
一致的植株移至 1 /2Hoagland营养液的水培槽中。气泵正常通气 , 调营养液 pH ( 615 ±011) , 每 5 d
更换 1次营养液。培养条件为 : 14 h光照 , 光照强度 140～160μmol·m - 2 ·s- 1 , 昼温 20～25 ℃ /夜
温 15～20 ℃。
预培养 15 d后进行处理。分 3部分处理 , 每处理 60株 , 设 3个重复。处理 1为对照 , 正常通气
(DO值 810～815 mg·L - 1 ) ; 处理 2为低氧 ( hypoxia) +清水 , 将氮气充入营养液中驱赶氧气 , 用溶
氧调节仪 (上海苏泊公司产 , FC2680型 ) 调控 DO 值 115 ～210 mg·L - 1 ; 处理 3 为低氧 + 015
mmol·L - 1 SA。
112　测定指标及方法
分别于处理后第 0、5、10、15和 20天取第 3～6叶位的成熟叶片 , 每次取样 15株 , 液氮速冻 ,
- 70 ℃保存 , 用于测定 H2 O2 (高俊凤 , 2000)、O2
-· [按王爱国和罗广华 ( 1990) 介绍的 O2
-·对羟胺
氧化的方法略做改进 , 将氧化产物 NO2- 在对氨基苯磺酸和α - 萘胺中显色后的偶氮染料转移到等体
积的乙醚中 , 测定水相液 530 nm 处的吸光度 , 其含量用 A530 ·g- 1 FM 表示 ]、MDA (李合生 等 ,
2000)、A sA (Logan et al. , 1998) 和 GSH ( Griffith, 1980) 含量。
SOD、POD和 CAT活性的测定 (高俊凤 , 2000) : 称样 015 g叶片加入磷酸缓冲液 ( pH 718) ,
在冰浴上研磨成匀浆后定容至 8 mL, 4 ℃ 12 000 ×g离心 20 m in, 取上清液用于酶活性测定。SOD活
性测定以抑制 NBT光化学还原 50%为一个酶活力单位 (U ) , 单位为 U·g- 1。CAT活性按紫外吸收
法测定 , 以吸光度每分钟减少 011为一个酶活性单位 (U ) , 单位为 U·g- 1。POD活性以吸光度每分
钟增加 0101为一个酶活性单位 (U) , 单位为 U·g- 1。APX和 GR活性 (Nakano & A sada, 1981) 的
测定 : 称样 013 g叶片 , 在含 011 mmol·L - 1 EDTA、013% Triton X2100和 4% (质量体积比 ) PVP的
50 mmol·L - 1磷酸缓冲液 (pH 715) 中研磨成匀浆 , 定容 5 mL, 4 ℃ 16 000 ×g离心 15 m in, 上清液
即为酶液。
各项指标重复 3次以上。
酶活性测定采用 UV22550分光光度计 , 数据统计分析采用 Excel和 DPS数据处理系统。
461
　2期 白团辉等 : 水杨酸对根际低氧胁迫八棱海棠幼苗活性氧代谢的影响 　
2　结果与分析
211　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 MDA、O2-·和 H2 O2含量的影响
从图 1看出 , 低氧胁迫条件下叶片 MDA含量显著提高 , 呈先升后降的变化趋势。在处理第 15天
时达到峰值 , 为对照的 1116倍。低氧胁迫下添加外源 SA , 抑制了低氧胁迫引起的 MDA增加 , 在处
理第 10天 MDA含量为胁迫下的 9117%。
对照的幼苗叶片 O2
-·和 H2 O2的含量变化幅度较小。低氧胁迫下 , 幼苗叶片 O2
-·含量始终高于同期
的对照 , 且随着处理时间的延长呈上升趋势 , H2 O2含量显著提高 , 处理第 20天达到峰值 , 以后呈下
降趋势。低氧胁迫下添加外源 SA能明显抑制 O2
-·的产生 , 处理第 15天时 O2
-·含量仅为胁迫处理的
7115% ; H2 O2含量与低氧胁迫下相比前期有所升高 , 后期与胁迫处理无显著差异。
212　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 SOD、POD和 CAT活性的影响
从图 2可以看出 , 低氧胁迫下 SOD活性明显增加 , 显著高于对照且呈先升后降的变化趋势 , 在
处理第 15天达到峰值 , 比通气对照增加了 3611% , 以后逐渐下降 ; POD和 CAT活性前期迅速升高 ,
后期变化缓慢 , 分别在处理第 5和 15天达到峰值 , 是通气对照的 1126和 1142倍 , 以后也逐渐下降。
这可能是幼苗对低氧胁迫的响应。外源 SA能明显提高低氧胁迫下 SOD和 POD活性 , 在处理第 10天
时分别比胁迫处理提高了 2317%和 4413% , 其变化趋势和胁迫处理下基本一致 , 而外源 SA对 CAT
活性影响较小。
图 1　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 O 2
-·、H2O 2
和 MDA含量的影响
F ig. 1　Effects of SA on con ten t of O 2
-·, H2O 2 and MDA in the
leaves of M a lus robusta Rehd. under hypox ia stress
图 2　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 SOD、POD
和 CAT活性的影响
F ig. 2　Effects of SA on activ ity of SOD, POD and CAT in the
leaves of M a lus robusta Rehd. under hypox ia stress
561
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
213　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 APX和 GR活性的影响
图 3表明 , 低氧胁迫下 APX活性明显高于对照 , 呈现先升后降趋势。低氧胁迫下添加外源 SA ,
处理前期 APX活性低于胁迫处理 , 第 10天以后明显上升 , 第 15天时达到峰值 , 是胁迫处理的 1127
倍。这可能是前期 SA抑制了 APX活性 , 后期抑制作用消失 , APX活性上升。
低氧胁迫下 GR活性与 APX活性变化基本一致 , 但外源 SA在抑制 GR活性方面作用不大。
214　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 A sA和 GSH含量的影响
由图 4可以看出 , 低氧胁迫下叶片 A sA含量低于对照 , 并呈先降后升的变化趋势 , 处理第 10天
达到最低值 , 为对照的 7718%。
低氧胁迫下添加外源 SA, A sA含量在处理前期与胁迫处理无明显差异 , 后期低于胁迫处理。
低氧胁迫下 GSH含量高于对照 , 添加 SA对胁迫下植株体内 GSH含量的影响也不大 , 但一直高
于对照。
图 3　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 APX和 GR
活性的影响
F ig. 3　Effects of SA on activ ity of APX and GR in the leaves
of M a lus robusta Rehd. under hypox ia stress
图 4　SA对低氧胁迫下八棱海棠叶片 A sA和 GSH
含量的影响
F ig. 4　Effects of SA on con ten t of A sA and GSH in the leaves
of M a lus robusta Rehd. under hypox ia stress
3　讨论
正常生理条件下 , 植物体内会产生 O2
-·、H2 O2和 ·OH等 ROS, ROS又不断被消除 , 使植物体内
ROS产生和清除处于动态平衡。这种平衡由植物体抗氧化酶系统 ( SOD、CAT、 POD、APX和 GR
等 ) 和抗氧化物质 (A sA、GSH和 VE等 ) 调控。逆境胁迫会使 ROS代谢平衡被破坏 , 导致 ROS自由
基大量积累 (Demm ing, 1992; 杜秀敏 等 , 2001)。本研究表明 , 低氧胁迫下幼苗体内的 O2
-·、H2 O2
含量明显升高 (图 1) , 这与前人在其他植物上的研究结果 (Ma⁄gorzata & W aldemar, 2004; 周国贤
等 , 2006) 一致。这可能是低氧逆境使细胞内正常的电子传递被阻断 , 造成细胞内能荷降低、还原
力提高、细胞质酸化、Fe2 + 、Cu2 +等二价离子过剩等造成了 ROS的积累 (Vantoai & Bolles, 1991)。
低氧胁迫下喷施 015 mmol·L - 1 SA, 能抑制低氧胁迫下 O2-·的产生 , 提高了叶片 H2O2水平 , 这与刘高
峰等 (2006) 的报道相似。
661
　2期 白团辉等 : 水杨酸对根际低氧胁迫八棱海棠幼苗活性氧代谢的影响 　
植物体内 ROS代谢中 , SOD、POD和 CAT是清除 ROS过程中最重要的抗氧化酶 , SOD清除 O2
-·
,
O2
-·转化为 H2 O2和 O2 , CAT和 POD 清除 H2 O2使之转化为 H2 O (Demm ing, 1992; 杜秀敏 等 ,
2001)。本研究中低氧胁迫下 SOD、CAT和 POD活性升高 , 这可能是植物保护酶系统应激反应的表
现。添加 SA后其活性增加明显 , 使 O2
-·含量显著下降 (图 1) , 这可能是 SA诱导提高了 SOD和 POD
活性 (图 2) , 自由基清除能力加强。Jyoti (2003) 认为 SA进入细胞能诱导一系列防卫反应的发生 ,
活化 POD、G蛋白和蛋白激酶等。低氧胁迫下 H2 O2含量明显升高 , 低氧胁迫下添加 SA , 前期 H2 O2
含量迅速升高 , 10 d后与胁迫处理无显著差异 (图 1)。SA可能通过提高 SOD活性 , 促进 O2
-·生成
H2 O2和 O2的歧化反应 , 从而增加了 H2O2的生成量。尽管 H2O2含量有积累 , 但 H2 O2的升高是一种胁
迫后果还是胁迫信号至今还不清楚 , 这可能类似于氧爆发作用 (Raskini & Hamnn, 1987; 李国婧和
周燮 , 2001)。至于 SA如何提高抗氧化酶活性 , 其机理可能相似于植物的耐盐机理 , 即由于植物体
内 SA受体蛋白基因与过氧化物酶基因高度同源 , 外源 SA进入体内能够激活 SOD活性 (Raskini &
Hamnn, 1987; Jyoti, 2003)。Agarwal等 (2005) 认为 SA通过激活抗氧化酶共同的转录因子诱导抗
氧化酶的表达 , 但其间更深入的联系尚缺少直接的研究证据 , 有待深入研究。
A sA - GSH循环是一个重要的清除 H2 O2的系统 , 其中 APX是关键酶 , APX是利用 A sA为电子供
体的 H2 O2的清除剂 (孙卫红 等 , 2005)。A sA和 GSH是重要的抗氧化物质 , 其变化反映了植物对环
境变化的响应 , A sA也可直接清除植物体内 ROS, 并通过 A sA - GSH循环中的 APX间接清除 H2 O2
(Narayanan et al. , 2005; 孙卫红 等 , 2005)。本试验中 , 低氧胁迫下 A sA 含量显著下降 (图 4 ) ,
A sA含量的下降可能与 ROS过量产生有关 , 过量的 ROS可以降低叶绿体中的 A sA含量 (Valpuesta &
Botella, 2004)。APX活性在处理前期明显上升 , 10 d后开始下降 (图 3) , 这可能是前期 A sA含量下
降和后期 H2 O2大量产生使 APX部分失活。导致后期 APX活性下降。低氧胁迫下添加外源 SA , 处理
前期部分 APX活性被抑制 , 变化缓慢 , 第 10天以后明显上升。GSH作为 DHA的电子供体 , 其氧化
还原态是通过 A sA - GSH循环与 A sA相联系 (孙卫红 等 , 2005)。本试验中 , 低氧胁迫下 GSH含量
和 GR活性明显上升 (图 3, 图 4) , 这可能是对低氧胁迫的适应性响应。添加外源 SA对低氧胁迫下
GSH含量和 GR活性的影响不明显 , 这说明 SA可能不是 A sA - GSH循环的限制因子。
综上所述 , 低氧胁迫导致八棱海棠幼苗伤害的主要原因是体内 ROS代谢失调 , 施用 015 mmol·
L - 1外源 SA, 能有效抑制根际低氧胁迫下八棱海棠幼苗体内 ROS产生 , 提高了 SOD、POD和 CAT等
抗氧化酶活性 , 减少 MDA生成 , 增强植物的耐低氧能力 , 对于缓解低氧胁迫引起的 ROS伤害有重要
作用。
至于 SA对抗氧化酶的作用机理 , 还有待进一步研究。
References
Agarwal S, Sairam R K, Srivastava G C, TyagiA, Meena R C. 2005. Role of ABA, salicylic acid, calcium and hydrogen peroxide on antiox2
idant enzymes induction in wheat seedlings. Plant Science, 169: 559 - 570.
Bozena S, Malgorzata D, Anna M R. 2004. Factors affecting determ ination of superoxide anion generated by m itochondria from barley roots after
anaerobiosis. Journal of Plant Physiology, 161: 1339 - 1346.
Demm ing A B. 1992. Photo p rotection and other responses of p lants to high light stress. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Boil, 435: 619 -
626.
Du Xiu2m in, Yin W en2xuan, Zhao Yan2xiu, Zhang Hui. 2001. The p roduction and scavenging of reactive oxygen species in p lants. Chinese
Journal of B iotechnology, 17 (2) : 121 - 125. ( in Chinese)
杜秀敏 , 殷文璇 , 赵彦修 , 张 慧. 2001. 植物中活性氧的产生及清除机制. 生物工程学报 , 17 (2) : 121 - 125.
Gao Jun2feng. 2000. Technology of p lant physiological experiment. Xipian: World Book Press: 159 - 198. ( in Chinese)
高俊凤. 2000. 植物生理学试验技术. 西安 : 世界图书出版社 : 159 - 198.
761
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
Griffith O W. 1980. Determ ination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 22vinylpyridine. Anal B iochem, 106:
207 - 212.
Jyoti S. 2003. The salicylic acid loop in p lant defense. Current Op inion in Plant B iology, 6: 365 - 371.
L i Guo2jing, Zhou Xie. 2001. Salicylic acid and abiotic stress resistance in p lants. Chinese Bulletin of Botany, 18 (3) : 295 - 302. ( in Chi2
nese)
李国婧 , 周 燮. 2001. 水杨酸与植物抗非生物胁迫. 植物学通报 , 18 (3) : 295 - 302.
L i He2sheng, Sun Qun, Zhao Shi2jie. 2000. The p rincip le and technology of p lant physiological biochem ical experiment. Beijing: H igher Edu2
cation Press: 164 - 194. ( in Chinese)
李合生 , 孙 群 , 赵世杰. 2000. 植物生理生化实验原理和技术. 北京 : 高等教育出版社 : 164 - 194.
L iu Gao2feng, Yang Hong2qiang, ZhangW ei, Ma Fang2fang. 2006. Effects of salicylic acid on the active oxygen metabolism and ultraweak lu2
m inescence of M alus hupehensis Rehd. Acta Horticuhurae Sinica, 33 (1) : 118 - 121. ( in Chinese)
刘高峰 , 杨洪强 , 张 伟 , 马方放. 2006. 水杨酸对湖北海棠活性氧代谢及超微弱发光的影响. 园艺学报 , 33 (1) : 118 - 121.
Logan B A, Grace S C, Adam s ⅢW W , Demm ig2Adam sB. 1998. Seasonal differences in xanthophyll cycle characteristics and antioxidants in
M ahonia repens growing in different light environments. Oecologia, 116: 9 - 17.
Ma⁄gorzata G, W aldemar B. 2004. Effects of a short2term hypoxic treatment followed by re2aeration on free radicals level and antioxidative en2
zymes in lup ine roots. Plant Physiology and B iochem istry, 42: 233 - 240.
Nakano Y, A sada K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate2specific peroxidase in sp inach chlorop lasts. Plant Cell Physiology,
22: 867 - 880.
Narayanan S, Ruma D, Gitika B, Sharma S K, Pauline T, Sai Ram M, Ilavazhagan G, Sawhney R C, Kumarand D, Banerjee P K. 2005.
Antioxidant activities of seabuckthorn (H ippophae rham noides) during hypoxia induced oxidative stress in glial cells. Molecular and Cellular
B iochem istry, 278: 9 - 14.
Prochazkova D, Sairam R K, Srivastava G C, Singh D V. 2001. Oxidative stress and antioxidant activity as the basis of senescence in maize
leaves. Plant Science, 161: 765 - 771.
Raskini E, Hamnn A. 1987. Salicylic acid: A natural inducer of heat p roduction. Science, 23 (7) : 1601 - 1602.
Sun W ei2hong, W ang W ei2qing, Meng Q ing2wei. 2005. Functional mechanism and enzymatic and molecular characteristic of ascorbate peroxi2
dase in p lants. Plant Physiology Communications, 41 (2) : 143 - 147. ( in Chinese)
孙卫红 , 王伟青 , 孟庆伟. 2005. 植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性. 植物生理学通讯 , 41 ( 2) : 143 -
147.
Valpuesta V, Botella M A. 2004. B iosynthesis of L2ascorbic acid in p lants: new pathways for an old antioxidant. Trends Plant Science, 9:
573 - 577.
Vantoai T T, Bolles C S. 1991. Postanoxic injury in soybean (Glycine m ax) seedlings. Plant Physiol, 97: 588 - 592.
W ang A i2guo, Luo Guang2hua. 1990. Quantitative relation between the reaction of hydroxylam ine and superoxide anion radicals in p lant. Plant
Physiology Communications, 26 (6) : 55 - 57. ( in Chinese)
王爱国 , 罗广华. 1990. 植物的超氧化物自由基与羟胺反应的定量关系. 植物生理学通讯 , 26 (6) : 55 - 57.
Zhou Guo2xian, Guo Shi2rong, W ang Su2p ing. 2006. Effects of exogenous polyam ines on photosynthetic characteristics and membrane lip id per2
oxidation of Cucum is sa tivus seedlings under hypoxia stress. Chinese Bulletin of Botany, 23 (4) : 341 - 347. ( in Chinese)
周国贤 , 郭世荣 , 王素平. 2006. 外源多胺对低氧胁迫下黄瓜幼苗光合特性和膜脂过氧化的影响. 植物学通报 , 23 ( 4) : 341 -
347.
861