全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２０１５ꎬ ４２(５): ８１３ － ８１９ ＤＯＩ: １０􀆰 １３８０２ / ｊ. ｃｎｋｉ. ｚｗｂｈｘｂ. ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１７
基金项目:国家科技支撑计划(２０１２ＢＡＤ３８Ｂ０７)ꎬ山西省高等学校 １３１ 领军人才工程
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｘｈａｏｌｉｎ２０１４＠ １６３. ｃｏｍ
收稿日期: ２０１５ － ０１ － ２３
解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 抗菌蛋白的
分离纯化及其抗菌作用
秦　 楠１ꎬ２ 　 郝　 林１∗　 李　 鑫１
(１.山西农业大学食品学院ꎬ 太谷 ０３０８０１ꎻ ２.山西农业大学信息学院ꎬ 太谷 ０３０８０１)
摘要: 为探究解淀粉芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７ 菌株所产抗菌蛋白物质对禾谷镰
孢菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ 的抑制机理ꎬ采用硫酸铵分级沉淀菌株发酵液ꎬＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ柱和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 柱层析分离纯化抗菌蛋白ꎬ聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗菌蛋白分子量ꎻ
并采用平板计数法和扫描电子显微镜观察病原菌孢子萌发和菌丝生长情况ꎮ 结果表明ꎬ硫酸铵饱
和度为 ５０％时 ＨＲＨ３１７ 菌株发酵液的抑菌活性最大ꎬ抑菌圈直径可达 ２􀆰 ０２ ｃｍꎬ显著大于其它饱和
度处理ꎻ２ 次柱层析可纯化出抗菌蛋白ꎬ分子量约为 ３６􀆰 ０ ｋＤꎮ 禾谷镰孢菌经该抗菌蛋白处理后 １２
ｈꎬ病原菌孢子萌发率为 ５５􀆰 ８％ ꎬ显著低于对照ꎬ且 ２ ~ １２ ｈ间其孢子萌发率平均下降了 ５７􀆰 ３％ ꎻ该
抗菌蛋白还可造成病原菌菌丝变细、畸形与扭曲ꎬ且末端膨大等现象ꎮ 表明解淀粉芽胞杆菌
ＨＲＨ３１７ 菌株产生的抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发和菌丝发育具有较强的抑制作用ꎮ
关键词: 解淀粉芽胞杆菌ꎻ 抗菌蛋白ꎻ 分离纯化ꎻ 抗菌机理
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７
Ｑｉｎ Ｎａｎ１ꎬ２ 　 Ｈａｏ Ｌｉｎ１∗ 　 Ｌｉ Ｘｉｎ１
(１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉｇｕ ０３０８０１ꎬ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉｇｕ ０３０８０１ꎬ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍꎬ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｏｌｕｍｎ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ ａｓ ｃｏｌｕｍｎ ｆｉｌｌｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ.
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ. Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｙｐｈａｅ ａｎｄ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｃｈｅｃｋｅｄ ｂｙ ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ.
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｏｆ ５０％ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ
ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ｃｉｒｃｌｅ ｏｆ ２􀆰 ０２ ｃｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ ｏｔｈｅｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅｓ ａｎｄ ｌａｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ. ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ３６􀆰 ０ ｋＤ. Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗａｓ ５５􀆰 ８％ ｗｈｅｎ Ｆ.
ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ １２ ｈꎻ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ５７􀆰 ３％ ꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ２ － １２ ｈ. Ｈｙｐｈａｅ ｏｆ Ｆ.
ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｗｅｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｔｏ ｂｅ ｗｉｔｈｅｒｅｄꎬ ｄｉｓｔｏｒｔｅｄꎬ ｗｉｔｈ ｓｗｏｌｌｅｎ ｅｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈ
ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓꎻ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
　 　 小麦赤霉病和玉米茎基腐病都是世界性流行土
传病害ꎬ在我国引发这 ２ 种病害的主要病原菌为禾
谷镰孢菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍꎬ每年造成巨大的经
济损失(秦子惠ꎬ２０１４)ꎮ 目前上述病害主要依靠化
学防治ꎬ但由于环境污染、农药残留、病原菌抗药性
等问题日益突出ꎬ使得防治重点逐步转向环境友好
的生物防治ꎬ该防治方法具有广谱、无毒、无污染等
优点(Ｓｏｍｅｙａꎬ２００８ꎻ孙卓和杨利民ꎬ２０１５)ꎮ 自 Ｊｏｈｎ￣
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ. (１９４５)报道枯草芽胞杆菌可产生抗菌物质
后ꎬ开发微生物源抗菌物质拮抗真菌病害已成为研
究热点ꎮ 从芽胞杆菌中可分离得到多种抗菌物质ꎬ
包括多肽类、脂肽类及抗菌蛋白等ꎬ不仅能抑制多种
植物病原真菌ꎬ还可抑制某些食品腐败真菌与致病
菌(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００２ꎻＢｅａｔｔｙ ＆ Ｊｅｎｓｅｎꎬ２００６ꎻＢｈａｓｋａｒ
ｅｔ ａｌ. ꎬ２００７)ꎮ
近几年ꎬ包括农杆菌属 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、芽胞杆菌
属 Ｂａｃｉｌｌｕｓ等细菌在国内外生防领域的应用较普遍
(邱德文ꎬ２０１０)ꎮ 解淀粉芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑ￣
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ 作为一类生防资源ꎬ在植物病害防治中发
挥着重要作用ꎬ如 Ｌｉｓｂｏａ ｅｔ ａｌ. (２００６)从巴西森林中
分离得到能抑制曲霉属 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ 真菌和麦根腐离
蠕孢菌 Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎｕｍ 的解淀粉芽胞杆菌
ＬＢＭ ５００６ 菌株ꎻＳｕｔｙａｋ ｅｔ ａｌ. (２００８)从益生菌乳制
品中分离出 ｌ 株解淀粉芽胞杆菌ꎬ可对李斯特菌
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ产生抑制作用ꎻＡｌｖｉｎｄｉａ ＆ Ｎａｔ￣
ｓｕａｋｉ(２００９)从香蕉表面分离的解淀粉芽胞杆菌
ＤＧＡ１４ 菌株对香蕉冠腐病有较强的抑制效果ꎻ王英
国等(２００７)从堆肥中分离得到 １ 株对尖镰孢菌 Ｆ.
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ具有强烈抗性的解淀粉芽胞杆菌ꎻ孙燕霞
等(２０１０)和陈成等(２０１１)分别发现解淀粉芽胞杆
菌菌株 ＳＹＸ￣２ 和 ＨＮ０６ 对黄瓜枯萎病菌 Ｆ. ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ与水稻纹枯病菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｒｚｉａ
ｓｏｌａｎｉ 有很好的抑制作用ꎮ 目前ꎬ生防细菌筛选研
究多针对单一病害ꎬ而获得具有广谱抑菌的新类型
菌株较少ꎮ 本课题组从山西农业大学玉米农田土壤
中分离获得了 １ 株解淀粉芽胞杆菌菌株 ＨＲＨ３１７ꎬ
经前期研究发现该菌株发酵液具有优良的广谱抑菌
活性ꎬ可以抑制革兰氏阴性、阳性细菌、酵母和霉菌ꎬ
是微生物中十分难得的生防资源ꎬ在生物防治与食
品防腐领域具有广阔的应用前景(任淑娟ꎬ２０１３)ꎮ
在此基础上ꎬ本试验采用层析法从 ＨＲＨ３１７ 菌株发
酵液中分离纯化出抗菌蛋白ꎬ以期揭示其抗菌机理ꎬ
为其作为一种潜在的生防资源提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌种:解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 菌株现保
藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心(编号:ＣＧＭＣＣ Ｎｏ. ７３１４)ꎬ指示菌为禾谷镰孢菌ꎬ
均由山西农业大学生物工程实验室提供ꎮ
培养基:营养琼脂( ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒꎬＮＡ)培养基:
牛肉膏 ０􀆰 ５ ｇ、蛋白胨 １ ｇ、ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ、琼脂 １􀆰 ５ ｇ、水
１００ ｍＬꎻ马铃薯葡萄糖琼脂 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒꎬ
ＰＤＡ)培养基:马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、
水 １ Ｌꎻ营养肉汤(ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈꎬＮＢ)培养基:牛肉膏
０􀆰 ５ ｇ、蛋白胨 １ ｇ、ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ、水 １００ ｍＬꎻ马铃薯葡
萄糖液体 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈꎬ ＰＤＢ)培养基:即
ＰＤＡ培养基中不加琼脂ꎮ
试剂:ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗꎬ上海紫一试剂
公司ꎻＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ꎬ美国 ＧＥ公司ꎻ考马斯亮蓝 Ｇ￣
２５０ꎬ北京中生瑞泰科技有限公司ꎻ标准蛋白分子量ꎬ
上海生物化学研究所ꎻ其余试剂均为国产分析纯ꎮ
仪器:ＪＤＧ型真空冷冻干燥机ꎬ兰州科近真空冻
干技术有限公司ꎻＤＹＣＺ￣２４ＤＮ 型垂直电泳仪ꎬ北京
六一仪器厂ꎻＪＹ０４Ｓ￣３Ｃ 型电泳凝胶成像分析系统ꎬ
北京君意东方电泳设备有限公司ꎻＩＢ￣３ 型离子镀膜
仪ꎬ日本 ＥＩＫＯ 公司ꎻＪＳＭ￣６４９０ＬＶ 型扫描电子显微
镜ꎬ日本 ＪＥＯＬ公司ꎮ
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体发酵液抑菌活性测定
挑取活化后的 ＨＲＨ３１７ 菌株 ３ 环接种到装有
５０ ｍＬ ＮＢ培养基的 ２５０ ｍＬ 三角瓶中ꎬ３７℃、１８０ ｒ /
ｍｉｎ振荡培养 ２４ ｈꎮ ４℃、１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 条件下离心
２０ ｍｉｎꎬ去沉淀ꎬ上清液即为粗提液ꎮ 该粗提液经孔
径 ０􀆰 ２２ μｍ 细菌过滤器过滤ꎬ即得无菌体培养滤
液ꎮ 采用牛津杯法检测滤液抑菌活性( Ｓｃｈｎüｒｅｒ ＆
Ｍａｇｎｕｓｓｏꎬ２００５)ꎮ 在灭菌培养皿中加 １５ ｍＬ ＰＤＡ培
养基ꎬ待其凝固后ꎬ加入 １０ － ６ ＣＦＵ / ｍＬ 禾谷镰孢菌
孢子悬浮液 ０􀆰 ２ ｍＬꎬ然后用灭菌涂布棒涂匀ꎬ待孢
子悬浮液被充分吸收后ꎬ在培养皿中等距离放置牛
４１８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
津杯ꎬ每个牛津杯中加 ０􀆰 ２ ｍＬ的菌株 ＨＲＨ３１７ 无菌
体培养滤液ꎬ于 ４℃冰箱内放置 ２４ ｈꎬ待发酵液充分
扩散后于 ３０℃培养 ５ ｄꎬ观察抑菌圈情况ꎮ 以无菌
水为对照ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌粗蛋白的制备
采用硫酸铵分级沉淀菌株 ＨＲＨ３１７ 发酵液ꎮ 首
先取 １ Ｌ上述 ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体培养滤液ꎬ缓慢
加入硫酸铵至 ２０％饱和度ꎬ４℃静置 ２ ｈꎬ１０ ０００ ｒ /
ｍｉｎ、４℃离心 ３０ ｍｉｎꎬ分别收集上清液和沉淀ꎮ 向收
集的上清液中继续加入硫酸铵ꎬ同法调节到 ３０％ 、
４０％ 、５０％ 、６０％ 、７０％和 ８０％饱和度ꎮ 收集每个饱
和度下的沉淀蛋白ꎬ用原 １ / １０ 体积 ０􀆰 ０２ ｍｏｌ / Ｌ ｐＨ
６􀆰 ８ 的 Ｔｒｉｓ缓冲液溶解ꎬ装入透析袋后采用浓度相
同的 Ｔｒｉｓ缓冲液透析过夜ꎮ 以禾谷镰孢菌为指示
菌ꎬ采用牛津杯法按 １􀆰 ２􀆰 １ 步骤测定各组分的抑菌
活性ꎬ活性最强的组分即为最适饱和度硫酸铵制备
的抗菌粗蛋白ꎬ用于后续研究ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的分离纯化
以最适饱和度硫酸铵沉淀后的沉淀复溶物进行
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 离子交换层析ꎮ 将预处
理的 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 手动装填ꎬ用 ０􀆰 ０５
ｍｏｌ / Ｌ ｐＨ ６􀆰 ８ 的 Ｔｒｉｓ缓冲液洗脱平衡柱床ꎬ样品上
样ꎬ先用 ｐＨ ６􀆰 ８ 的 Ｔｒｉｓ缓冲液洗脱ꎬ然后用 ０ ~ １􀆰 ０
ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣ１ 溶液进行梯度洗脱ꎬ洗脱速度为 １􀆰 ０
ｍＬ / ｍｉｎꎬ按每管 ４ ｍＬ 收集ꎬ在紫外波长 ２８０ ｎｍ 处
检测抗菌蛋白吸光度值ꎮ 洗脱液冻干浓缩ꎬ检测有
抑菌活性的蛋白峰ꎬ供 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 凝胶层析进
一步分离纯化抗菌蛋白ꎮ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 凝胶溶胀
后装柱ꎬ用 ０􀆰 ０５ ｍｏｌ / Ｌ ｐＨ ６􀆰 ８ 的 Ｔｒｉｓ缓冲液平衡至
Ａ２８０ ｎｍ基线ꎮ 将 ＤＥＡＥ 纯化得到的冻干浓缩样品上
样ꎬ并用 Ｔｒｉｓ缓冲液洗脱ꎬ洗脱速度为 ０􀆰 ５ ｍＬ / ｍｉｎꎬ
按每管 ２ ｍＬ收集ꎬ紫外波长 ２８０ ｎｍ 处检测抗菌蛋
白吸光度值ꎮ 收集吸收峰ꎬ冻干浓缩后分别做抑菌
试验ꎬ选取最大抑菌活性峰用于电泳检测ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白分子量测定
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ＨＲＨ３１７ 菌株抗
菌蛋白分子量(Ａｒｒｅｂｏｌａ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１０)ꎬ浓缩胶和分
离胶浓度分别为 ４％ 和 １２％ ꎬ恒压 ６ Ｖ / ｃｍꎬ采用
ＤＹＣＺ￣２４ＤＮ型垂直电泳仪电泳 ３ ｈꎮ 采用考马斯亮
蓝染色过夜ꎬ７％冰醋酸固定后ꎬ置于摇床轻摇 ２０ ~
３０ ｍｉｎꎬ待条带清晰ꎬ拍照记录ꎮ 以牛血清白蛋白为
标准蛋白质样本ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白对病原菌的抑制作用
对病原菌孢子萌发的抑制作用:取 ＰＤＡ 平板中
培养 ５ ｄ的禾谷镰孢菌菌丝悬浮于无菌水中ꎬ６ 层纱
布过滤ꎬ室温下 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ收集孢子ꎬ用
ＰＤＢ培养液制备孢子悬浮液并调节浓度至 １０６ 个 /
ｍＬꎮ 取 １０ μＬ孢子悬浮液与等体积 ５００ μｇ / ｍＬ抗菌
蛋白液混合ꎬ悬滴法置于无菌载玻片中央ꎬ３０℃恒温
培养ꎮ 分别在 ２、４、６、８、１０、１２ ｈ 时镜检(４００ × )观察
孢子萌发情况ꎬ每处理低倍镜下检查 １００ 个孢子ꎬ计
算孢子萌发率ꎮ 以 １０ μＬ 孢子悬浮液与等体积 ＰＤＢ
培养液混合为对照ꎮ 每个处理 ３ 次重复ꎮ 孢子萌发
率 ＝萌发孢子数 /调查孢子总数 ×１００％ꎮ
对病原菌菌丝生长的抑制作用:按照牛津杯法
检测ꎬ从开始出现抑菌圈起ꎬ分别挑取生长正常的菌
丝和生长被抑制的菌丝ꎬ加入 ３％ 戊二醛固定 ５
ｍｉｎꎬ二甲苯二氯胺脘脱水干燥后采用 ＩＢ￣３ 型离子
镀膜仪镀金ꎬ扫描电子显微镜观察并照相ꎮ
１􀆰 ３ 数据分析
所有试验数据均采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＡＳ ８􀆰 ０ 统
计软件进行处理分析ꎬ应用最小差异显著法(ＬＳＤ)
进行差异显著性检验ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体发酵液的抑菌活性
抑菌活性测定结果表明ꎬＨＲＨ３１７ 菌株无菌体
培养液对指示菌—禾谷镰孢菌有很强的抑菌活性
(图 １￣ａ)ꎬ抑菌圈平均直径为 ２􀆰 ０ ｃｍꎬ而对照则无抑
菌活性(图 １￣ｂ)ꎮ
图 １ ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体培养液对禾谷镰孢菌
的抑菌活性比较
Ｆｉｇ. １ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｆｒｅｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７
ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ
ａ: 培养液处理ꎻ ｂ: 无菌水对照ꎮ ａ: Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｆｒｅｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ ｂ: ＣＫ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ.
　
２􀆰 ２ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌粗蛋白的抑菌活性
ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体培养液不同饱和度硫酸铵
沉淀物的抑菌活性检测结果表明ꎬ硫酸铵饱和度为
５０％时抑菌活性最大ꎬ抑菌圈直径可达 ２􀆰 ０２ ｃｍꎬ显
５１８５ 期 秦　 楠等: 解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用
著高于其余处理ꎻ饱和度为 ２０％ 、３０％ 、４０％ 、６０％
的抑菌圈直径分别为 １􀆰 ５５、１􀆰 ６８、１􀆰 ７２ 和 １􀆰 ６８ ｃｍꎬ
处理间差异不显著(图 ２)ꎮ 表明 ５０％硫酸铵饱和
度时抗菌粗蛋白完全沉淀ꎮ
图 ２ ＨＲＨ３１７ 菌株无菌体培养液不同饱和度硫酸铵
沉淀蛋白对禾谷镰孢菌的抑菌活性
Ｆｉｇ. ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｍｏｎｉｕｍ
ｓｕｌｆａｔｅ￣ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７
图中数据为平均数 ±标准差ꎮ 柱上不同小写字母表示
经 ＬＳＤ 法检验在 Ｐ < ０􀆰 ０５ 水平差异显著ꎮ Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＤ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ < ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＬＳＤ ｔｅｓｔ.
　
２􀆰 ３ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的分离纯化
ＨＲＨ３１７ 菌株发酵液经 ５０％饱和度硫酸铵沉淀
并透析后ꎬ所得到的粗蛋白经 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ离子交换层析分离ꎬ出现了 ２ 个峰(图 ３￣ａ)ꎬ分
别收集 ２ 个吸收峰组分ꎬ冻干浓缩后进行抑菌活性
检测ꎬ结果表明峰 １ 没有抑菌活性ꎬ峰 ２ 具有抑菌活
性ꎮ ＤＥＡＥ收集到的峰 ２ 冻干浓缩ꎬ经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣
２００ 凝胶层析进一步洗脱得到 ２ 个峰ꎬ峰 ２￣１ 和峰 ２￣
２(图 ３￣ｂ)ꎬ收集 ２ 个吸收峰组分ꎬ冻干浓缩后检测
发现峰 ２￣１ 没有抑菌活性ꎬ峰 ２￣２ 具有抑菌活性ꎮ
２􀆰 ４ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的分子量
ＨＲＨ３１７ 菌株培养上清液经硫酸铵沉淀获得的
粗蛋白含有多种蛋白组分ꎬ即除抗菌蛋白外还含有
多种不同分子量的杂蛋白ꎬ粗蛋白经 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａ￣
ｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 柱层析得到的峰 ２ 也含有多条条带ꎬ
表明含有多种蛋白组分ꎮ 通过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 凝胶
柱进一步层析纯化得到峰 ２￣２ꎬ经过 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测
呈现出一条单独条带ꎬ表明分离得到了纯的抗菌蛋
白ꎬ其表观分子质量约为 ３６􀆰 ０ ｋＤ(图 ４)ꎮ
２􀆰 ５ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的抑菌作用
２􀆰 ５􀆰 １ 抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发的影响
经过 ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白处理的禾谷镰孢菌
图 ３ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的 ＤＥＡＥ离子交换柱
和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 凝胶柱层析纯化结果
Ｆｉｇ. ３ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ
ｓｕｌｆａｔｅ￣ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７
ｏｎ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ａｎｄ
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ ｃｏｌｕｍｎ
　
图 ４ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白的电泳图谱
Ｆｉｇ. ４ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＨＲＨ３１７
１: 硫酸铵沉淀蛋白ꎻ ２: ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
层析出的具抑菌活性蛋白ꎻ ３: Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 层析出的
具抑菌活性蛋白ꎻ Ｍ: 标准蛋白ꎮ １: Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ￣
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ２: ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ＤＥ￣
ＡＥ ｐｅａｋ ２ꎻ ３: ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣
２００ ｐｅａｋ ２ꎻ Ｍ: ｍａｒｋｅｒ.
　
孢子萌发率均显著下降(图 ５)ꎮ １２ ｈ时对照的孢子
萌发率达到了 ９５􀆰 ４％ ꎬ而抗菌蛋白处理的孢子萌发
率仅为 ５５􀆰 ８％ ꎮ ２ ~ １２ ｈ间孢子萌发率平均下降了
５７􀆰 ３％ ꎮ 表明抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发具有
强烈的抑制作用ꎮ
６１８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 ５ ＨＲＨ３１７ 菌株抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子
萌发的抑制作用
Ｆｉｇ. ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ
ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ
图中数据为平均数 ±标准差ꎮ 不同小写字母表示
经 ＬＳＤ 法检验在 Ｐ < ０􀆰 ０５ 水平差异显著ꎮ Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＤ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ < ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＬＳＤ ｔｅｓｔ.
　
２􀆰 ５􀆰 ２ 抗菌蛋白对禾谷镰孢菌菌丝形态的影响
扫描电子显微镜观察发现ꎬ对照中禾谷镰孢菌
菌丝体生长粗细均一ꎬ表面光滑ꎬ生长正常(图 ６￣ａ、
ｂ)ꎬ而经抗菌蛋白液处理 ２０ ｈ 后菌丝出现变细、畸
形、扭曲ꎬ末端膨大现象(图 ６￣ｃ)ꎬ放大至 ５ ０００ 倍时
可看出菌丝结节ꎬ表面不平滑(图 ６￣ｄ)ꎮ 说明该抗
菌蛋白能够抑制禾谷镰孢菌菌丝体的生长ꎮ
图 ６ 扫描电镜下抗菌蛋白对禾谷镰孢菌菌丝生长的效果
Ｆｉｇ. ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｐｈａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｕｎｄｅｒ ＳＥＭ
ａ ~ ｂ: 对照菌丝 × ５００、 × ５ ０００ꎻ ｃ ~ ｄ: 抗菌蛋白处理菌丝 × ５００、 × ５ ０００ꎮ ａ － ｂ: Ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｅ ｏｆ ＣＫ ｕｎｄｅｒ
ＳＥＭ × ５００ꎬ × ５ ０００ꎻ ｃ － ｄ: ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｅ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ＳＥＭ × ５００ꎬ × ５ ０００. 　
３ 讨论
芽胞杆菌具有繁殖能力强、抗逆性强、抗菌谱广
等特点ꎬ是植物微生态体系中的优势微生物种群
(李姝江等ꎬ２０１４)ꎮ 目前ꎬ芽胞杆菌所产抗菌蛋白
大多采用硫酸铵分级沉淀与逐步层析结合等方法分
离纯化得到ꎮ Ｋｉｍ ＆ Ｃｈｕｎｇ(２００４)利用解淀粉芽胞
杆菌 ＭＥＴ０９０８ 菌株获得了分子量为 ４０ ｋＤ 且可防
治炭疽病的抗菌蛋白ꎻ杨丽荣等(２０１０)从解淀粉芽
胞杆菌 ＹＮ￣１ 菌株中分离纯化到分子量约为 ３１ ｋＤ
且对黄瓜灰霉病菌具有拮抗活性的抗菌蛋白ꎻ本研
究中解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 菌株发酵液经硫酸铵
分级沉淀ꎬ采用 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 柱和
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣２００ 柱层析纯化得到 １ 种对禾谷镰孢菌
有良好抑制作用的抗菌蛋白ꎬ分子量约为 ３６ ｋＤꎬ与
上述已报道的抗菌蛋白分子量大小相似ꎮ 目前ꎬ国
内外报道的芽胞杆菌抗菌物质抑菌机制主要是抑制
孢子萌发和破坏细胞壁 (谢栋等ꎬ１９９８ꎻ李晶等ꎬ
２００８)ꎮ 本试验结果表明ꎬ菌株 ＨＲＨ３１７ 的抗菌蛋
白对病原菌抑制作用主要有 ２ 种方式:一是抑制孢
子萌发ꎻ二是造成菌丝变细、畸形、扭曲及末端膨大
现象ꎬ影响其正常生长ꎬ这与张宝俊等(２０１０)报道
ＬＰ￣５ 菌株发酵液抑制梨黑斑病菌的作用方式一致ꎬ
在谢栋等(１９９８)对 ＢＳ￣９８ 菌株、汪澈等(２００５)对
Ｂ９６０１￣Ｙ２Ａ菌株的研究中也均有体现ꎮ 本试验中
菌株 ＨＲＨ３１７ 对禾谷镰孢菌的良好抑制效果表明其
在实际生产应用中具有替代化学农药的潜力ꎬ可作
为小麦赤霉病和玉米茎基腐病生物防治的资源菌被
进一步开发利用ꎮ
理想生防菌除了要求拮抗能力强ꎬ还要能在土
７１８５ 期 秦　 楠等: 解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用
壤和寄主植株根部定殖ꎮ 目前ꎬ抗菌蛋白还不能直
接施用于田间ꎬ一是因为成本问题ꎬ二是因为抗菌蛋
白在复杂的田间环境中的稳定性需要考虑ꎬ能否稳
定持续地发挥防效还需进一步研究ꎮ 由于本试验中
抗菌物质的分离是根据蛋白质的特性进行分离纯化
的ꎬ因此不排除该菌株同时产生其它非蛋白物质的
可能ꎮ 经 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 柱层析纯化得
到的峰 １ 冻干浓缩物中就包含多种物质ꎬ可以继续
采用薄层色谱法、高效液相及气质联用色谱法等方
法进行分离纯化ꎬ相关研究有待进一步开展ꎮ
芽胞杆菌产生的抗菌蛋白类物质是其抑制植物
病原真菌生长的一个重要因子ꎬ但是其抑菌作用可
能还依赖于脂肽类物质与微生物代谢过程中产生的
挥发性物质(李宝庆等ꎬ２０１０)ꎮ 多种生防机理相互
结合、相互补充促进ꎬ才能使生防微生物在病虫害综
合防治中发挥最大作用ꎮ 鉴于本研究中解淀粉芽胞
杆菌 ＨＲＨ３１７ 菌株对引起小麦赤霉病和玉米茎基腐
病的禾谷镰孢菌有很好的抑制效果ꎬ下一步将对其
产生的抗菌蛋白在氨基酸序列、编码基因、表达调控
等方面进一步分析研究ꎬ为培育高效生防微生物和
抗病转基因植物提供技术支撑ꎮ
参 考 文 献 (Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ)
Ａｌｖｉｎｄｉａ ＤＧꎬ Ｎａｔｓｕａｋｉ ＫＴ. ２００９. Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＧＡ１４ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ ｓｕｒｆａｃｅ
ａｇａｉｎｓｔ ｂａｎａｎａ ｃｒｏｗｎ ｒｏｔ￣ｃａｕｓｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ
２８(３): ２３６ － ２４２
Ａｒｒｅｂｏｌａ Ｅꎬ Ｊａｃｏｂｓ Ｒꎬ Ｋｏｒｓｔｅｎ Ｌ. ２０１０. Ｉｔｕｒｉｎ Ａ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｉｎ￣
ｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
ＰＰＣＢ００４ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐ￣
ｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １０８(２): ３８６ － ３９５
Ｂｅａｔｔｙ ＰＨꎬ Ｊｅｎｓｅｎ ＳＥ. ２００２. Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ｐｒｏｄｕｃｅｓ
ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ￣ｔｙｐｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａ￣
ｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓꎬ ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｂｌａｃｋｌｅｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃａｎｏ￣
ｌａ. Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ４８(２): １５９ － １６９
Ｂｈａｓｋａｒ Ｎꎬ Ｓｕｄｅｅｐａ ＥＳꎬ Ｒａｓｈｍｉ ＨＮꎬ Ｔａｍｉｌ ＳＡ. ２００７. Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒ￣
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ
ＣＦＲ３００１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｉｓｈ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗａｓｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉ￣
ａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ. Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ９８(１４): ２７５８ － ２７６４
Ｃｈｅｎ Ｃꎬ Ｃｕｉ ＴＢꎬ Ｙｕ ＰＲ. ２０１１. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ￣ｆｕｎｇａｌ
ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎ￣
ｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ. Ｍｏｄｅｒｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２７
(１): ３６ － ３９ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [陈成ꎬ 崔堂兵ꎬ 于平儒. ２０１１.
一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究. 现
代食品科技ꎬ ２７(１): ３６ － ３９]
Ｊｏｈｎｓｏｎ ＢＡꎬ Ａｎｋｅｒ Ｈꎬ Ｍｅｌｅｎｅｙ ＦＬ. １９４５. Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ: ａ ｎｅｗ ａｎｔｉ￣
ｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｒｏｕｐ. Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
１０２(２６５０): ３７６ － ３７７
Ｋｉｍ ＰＩꎬ Ｃｈｕｎｇ ＫＣ. ２００４. Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｅ￣
ｉｅｎｓ ＭＥＴ０９０８. ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒꎬ ２３４(５): １７７ － １８３
Ｌｉ ＢＱꎬ Ｌｕ ＸＹꎬ Ｇｕｏ ＱＧꎬ Ｑｉａｎ ＣＤꎬ Ｌｉ ＳＺꎬ Ｍａ Ｐ. ２０１０. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＡＢ￣１. Ｓｃｉｅｎｔｉｃａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
Ｓｉｎｉｃａꎬ ４３(１７): ３５４７ － ３５５４ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [李宝庆ꎬ 鹿秀
云ꎬ 郭庆港ꎬ 钱常娣ꎬ 李社增ꎬ 马平. ２０１０. 枯草芽孢杆菌
ＢＡＢ￣１ 产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定. 中国农业科
学ꎬ ４３(１７): ３５４７ － ３５５４]
Ｌｉ Ｊꎬ Ｙａｎｇ Ｑꎬ Ｚｈａｏ ＬＨꎬ Ｗａｎｇ ＹＸ. ２００８. Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
ｆｒｏｍ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ２９ ｓｔｒａｉｎ. Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ￣
ｇｙꎬ ２８(２): ５９ － ６５ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [李晶ꎬ 杨谦ꎬ 赵丽华ꎬ 王
玉霞. ２００８. 生防枯草芽孢杆菌 Ｂ２９ 菌株抗菌物质的初步
研究. 中国生物工程杂志ꎬ ２８(２): ５９ － ６５]
Ｌｉ ＳＪꎬ Ｚｈｕ ＴＨꎬ Ｑｉａｏ ＴＭꎬ Ｈａｎ Ｓ. ２０１４. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｄｉｅｂａｃｋ ｆｕｎ￣
ｇｕｓ Ｃｅｎａｎｇｉｕｍ ｆｅｒｒｕｇｉｎｏｓｕｍ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ ｗｈｉｔｅ ｐｉｎｅ Ｐｉｎｕｓ ａｒｍａｎｄｉｉ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ４１
(５): ５６９ － ５７７ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [李姝江ꎬ 朱天辉ꎬ 谯天敏ꎬ 韩
珊. ２０１４. 松烂皮病内生拮抗细菌的筛选、生防效果及华山
松的生理响应. 植物保护学报ꎬ ４１(５): ５６９ － ５７７]
Ｌｉｓｂｏａ ＭＰꎬ Ｂｏｎａｔｔｏ Ｄꎬ Ｂｉｚａｎｉ Ｄꎬ Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ ＪＡꎬ Ｂｒａｎｄｅｌｌｉ Ａ.
２００６. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ￣ｌｉｋｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ａｔｌａｎｔｉｃ
Ｆｏｒｅｓｔ. Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ９(２): １１１ － １１８
Ｑｉｎ ＺＨꎬ Ｒｅｎ Ｘꎬ Ｊｉａｎｇ Ｋꎬ Ｗｕ ＸＦꎬ Ｙａｎｇ ＺＨꎬ Ｗａｎｇ ＸＭ. ２０１４.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｕｓｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｅａｒ ｒｏｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎꎬ ４１(５): ５８９ － ５９６ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [秦子惠ꎬ 任旭ꎬ 江凯ꎬ
武小菲ꎬ 杨知还ꎬ 王晓鸣. ２０１４. 我国玉米穗腐病致病镰孢
种群及禾谷镰孢复合种的鉴定. 植物保护学报ꎬ ４１(５):
５８９ － ５９６]
Ｑｉｕ ＤＷ. ２０１０. Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏ￣ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ. Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [邱德文. ２０１０. 蛋白质生物农药. 北京: 科学出
版社]
Ｒｅｎ ＳＪ. ２０１３. Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ
ｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ ＨＲＨ３１７ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ. Ｍａｓｔｅｒ Ｔｈｅｓｉｓ. Ｔａｉｇｕ:
Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [任淑娟. ２０１３.
一株高抑制青霉菌菌株的分类鉴定与抑菌谱. 硕士学位论
文. 太谷: 山西农业大学]
Ｓｃｈｎüｒｅｒ Ｊꎬ Ｍａｇｎｕｓｓｏ Ｊ. ２００５. Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓ
ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ. Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ １６(１ /
３): ７０ － ７８
Ｓｏｍｅｙａ Ｎ. ２００８. Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ７４
(６): ４５９ － ４６０
Ｓｕｎ ＹＸꎬ Ｚｈａｎｇ ＲＱꎬ Ｌｉｕ ＢＹꎬ Ｙｕａｎ ＴＹꎬ Ｌｉｕ ＷＨ. ２０１０. Ｔｈｅ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ￣
８１８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
ｃｉｅｎｓ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｘｙｓｐｏｒｕｍ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ. Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ￣
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ (１２): ５５ － ５７ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [孙燕霞ꎬ 张瑞清ꎬ
刘保友ꎬ 袁堂玉ꎬ 刘万好. ２０１０. 白地霉和解淀粉芽孢杆菌
对黄瓜枯萎病的防治效果. 山东农业科学ꎬ (１２): ５５ － ５７]
Ｓｕｎ Ｚꎬ Ｙａｎｇ ＬＭ. ２０１５. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａ￣
ｇａｉｎｓｔ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｙ ｆｕｎｇｕｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎꎬ ４２(１): ７９ － ８６ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [孙卓ꎬ杨利民. ２０１５. 人
参病原菌拮抗细菌的分离筛选与鉴定. 植物保护学报ꎬ ４２
(１): ７９ － ８６]
Ｓｕｔｙａｋ ＫＥꎬ Ｗｉｒａｗａｎ ＲＥꎬ Ａｒｏｕｔｃｈｅｖａ ＡＡꎬ Ｃｈｉｋｉｎｄａｓ ＭＬ. ２００８.
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｔｉｌｏｓｉｎ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ￣ｄｅｒｉｖｅｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ. Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １０４(４): １０６７ － １０７４
Ｗａｎｇ Ｃꎬ Ｈｅ ＹＱꎬ Ｚｈａｎｇ ＹＱ. ２００５. Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃ￣
ｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ９６０１￣Ｙ２ .
Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａꎬ ３５(１): ３０ － ３６ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[汪澈ꎬ 何月秋ꎬ 张永庆. ２００５. 枯草芽孢杆菌 Ｂ９６０１￣Ｙ２ 抑
菌蛋白活性及产生条件的研究. 植物病理学报ꎬ ３５
(１): ３０ － ３６]
Ｗａｎｇ ＳＬꎬ Ｓｈｉｎ ＩＬꎬ Ｌｉａｎｇ ＴＷ. ２００２. Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａ￣
ｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｖ６５６ ｉｎ ａ ｓｈｒｉｍｐ ａｎｄ ｃｒａｂ ｓｈｅｌｌ ｐｏｗｄｅｒ
ｍｅｄｉｕｍ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ５０(８):
２２４１ － ２２４８
Ｗａｎｇ ＹＧꎬ Ｗａｎｇ ＪＨꎬ Ｑｕａｎ ＣＳꎬ Ｆａｎ ＳＤ. ２００７. Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎ￣
ｔｉｆｕｎｇａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ. Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２７(１２): ４１ － ４５ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [王英国ꎬ 王军华ꎬ 权春善ꎬ 范圣第. ２００７. 解淀
粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究. 中
国生物工程杂志ꎬ ２７(１２): ４１ － ４５]
Ｘｉｅ Ｄꎬ Ｐｅｎｇ Ｊꎬ Ｗａｎｇ ＪＨꎬ Ｈｕ Ｊꎬ Ｗａｎｇ ＹＷ. １９９８. Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ９８Ⅲ ｆｒｏｍ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ. Ａｃ￣
ｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａꎬ ３８ (１): １３ － １９ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [谢
栋ꎬ 彭憬ꎬ 王津红ꎬ 胡剑ꎬ 王岳五. １９９８. 枯草芽孢杆菌抗
菌蛋白 Ｘ９８Ⅲ的纯化与性质. 微生物学报ꎬ ３８(１): １３ － １９]
Ｙａｎｇ ＬＲꎬ Ｗａｎｇ ＺＪꎬ Ｘｕｅ ＢＧꎬ Ｌｉｕ ＨＹꎬ Ｍａ ＪＧꎬ Ｚｈｅｎｇ ＹＰ. ２０１０.
Ｃｌｏｎｇｉｎｇ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴａｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑ￣
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＹＮ￣１ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２９(５): ８２３ － ８２８ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [杨丽荣ꎬ
王正军ꎬ 薛保国ꎬ 刘红彦ꎬ 马建岗ꎬ 郑亚平. ２０１０. 解淀粉
芽孢杆菌 ＹＮ￣１抑菌蛋白 ＴａｓＡ基因的克隆及原核表达. 基
因组学与应用生物学ꎬ ２９(５): ８２３ － ８２８]
Ｚｈａｎｇ ＢＪꎬ Ｚｈａｎｇ ＪＲꎬ Ｈａｎ ＪＣꎬ Ｌｉｕ ＨＰꎬ Ｗａｎｇ ＪＭ. ２０１０. Ｐｕｒｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｐｈｙｔ￣
ｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＰ￣５. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ
３７(２): １４３ － １４７ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [张宝俊ꎬ 张家榕ꎬ 韩巨才ꎬ
刘慧平ꎬ 王建明. ２０１０. 内生解淀粉芽孢杆菌 ＬＰ￣５ 抗菌蛋
白的分离纯化及特性. 植物保护学报ꎬ ３７(２): １４３ － １４７]
(责任编辑:李美娟)
９１８５ 期 秦　 楠等: 解淀粉芽胞杆菌 ＨＲＨ３１７ 抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用