全 文 ：2011-08-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00537
应用与环境生物学报 2011，17 ( 4 ): 537~540
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
植物内生菌（Endophyte）是在其生活史的一定阶段或全
部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物. 被
感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法从严
格表面消毒的植物组织中分离出来，或直接从植物组织内扩
增出微生物DNA [1]. 植物内生菌中存在大量有抑菌活性的菌
株，但内生菌领域尚未充分开发，从中发现新的抗菌活性物
质的几率较高，并且具有毒性较低等特点，因此利用植物内
生菌筛选高效、低毒的抗菌活性物质产生菌潜力巨大 [2]. 本文
对华重楼地下块茎中内生菌 Iun35的分离及产生抗菌蛋白的
性质作如下报道.
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 供试材料 采集于四川省彭州市的4年生野生华重楼.
1.1.2 供试菌株 华重楼内生菌Paris polyphylla Smith var.
chinensis Iun35由本实验室分离，小麦赤霉病菌Gibberelle
zeae（Schw.）、玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani Kuha、玉米
弯胞病菌Curvu-laria lunata （Walk）Boed、金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus、苹果轮纹病菌Physalospora piricola、
水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae Cav、镰刀霉菌Fusarium
sp. 松赤枯病菌Pestalotiopsis funerea、绿色木霉Trichoderma
viride、白色念珠菌Candida albicans、球孢白僵菌Beauveria
bassiana、绿色粘帚霉Gliocladium viriens、冬瓜枯萎 病菌
Fusarium oxysporum、短双歧杆菌Bifi dobacterium breve、大肠
埃希菌Escherichia coli由本实验室保存.
1.1.3 培养基 分离培养基（NA）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，
NaCl 5 g，琼脂16 g，蒸馏水1 000 mL；马铃薯蔗糖琼脂培养基
（PDA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂16 g，蒸馏水1 000 mL.
1.1.4 主要试剂与仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒购
于上海 捷 瑞生物工程有限公司；EX Taq酶、标准分 子量蛋
白和PCR相关试剂购于大连TaKaRa公司. Sephadex G-75 和
DEAE-32纤维素、AKTA purifi er层析系统为 Pharmacia公司产
品，高速冷冻离心机（Beckman）. 其他为国产试剂.
1.2 方 法
1.2.1 内生菌的分离 将新鲜重楼地下块茎洗净泥土，无菌
水冲洗2次，无菌滤纸吸干水分. 常规无菌操作下，75%乙醇浸
华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质*
雍 彬 张 超 马沁沁 李 佳 王一丁**
（四川师范大学生命科学学院 成都 610068）
Isolation of Endophytic Bacterium Iun35 from Paris polyphylla var.
chinensis and Properties of Its Antibiotic Protein*
YONG Bin, ZHANG Chao, MA Qinqin, LI Jia & WANG Yiding**
(College of Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610068, China)
Abstract Endophytic bacteria from Paris polyphylla Smith var. chinensis Hara can produce proteins with strong antibiotic
activity. In this research, an active antibiotic endophytic bacterium Iun35 was isolated from the tuber of P. polyphylla
var. chinensis. The strain was classified as Bacillus subtilis based on its characteristics of morphology, physiology and
biochemistry as well as the 16S rDNA analysis. After (NH4)2SO4 fractional precipitation, SephadexG-75 and DEAE-32 column
chromatography, an antibiotic protein UD35 was isolated and purifi ed from the clear supernatant of fermenting liquid. The
protein UD35 was tested for antagonism toward plant-pathogenic fungi and showed strong inhibiting activity against the
pathogens of Rhizoctonia solani Kuha and Gibberelle zeae (Schw.), etc. SDS-PAGE analysis determined the molecular weight of
UD35 to be about 5.5×103. This antibiotic protein was composed of 17 kinds of amino acids by relative analysis. Fig 3, Tab 4, Ref 16
Keywords Paris polyphylla Smith var. chinensis; endophyte; antibiotic protein; isolation and purifi cation; antagonistic activity
CLC Q936 : S476.1
摘 要 从华重楼（Paris polyphylla Smith var. chinensis）块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌
Iun35，经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）. 将分离得到的Iun35菌株发酵
培养，培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白
UD35. 用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定，结果显示，UD35对玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha）、小麦
赤霉病菌[Gibberelle zeae（Schw.）]等多种菌有强烈抑制作用. 测定其相对分子质量约为55 000，氨基酸分析结果表明
其由17种氨基酸组成. 图3 表4 参16
关键词 华重楼；内生细菌；抗菌蛋白；分离纯化；抑菌活性
CLC Q936 : S476.1
收稿日期：2010-02-05 接受日期： 2011-06-27
*国家自然科学基金项目（No. 30471378）资助 Supported by the National
Natural Science Foundation of China (No. 30670218)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: wwwyiding@163.com)
538 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
泡1 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分；0.2%的HgCl2
浸泡5 min，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干水分. 用无菌解剖
刀将已表面消毒的重楼块茎削去表皮，切成0.5 cm大小的正
方体，置于分离培养基平板内，30 ℃培养3~8 d. 待平板有菌
长出后，平板划线纯化，直至得到单菌落，斜面保存备用. 将
获得的菌株用Iun编号. 为了检查表面消毒是否彻底，设置对
照试验. 将上述同样条件下处理过的重楼块茎不切割直接移
植于分离培养基平板上，置于相同的条件下培养，以样品周
围是否有菌生长，证实分离菌是否为内生菌.
1.2.2 内生细菌的筛选 采用杯碟法 [3]，用5种供试植物病原
菌 菌株做初步拮 抗测定，在 PDA平板中心放 入灭菌的牛津
杯，向牛津杯中加入100 μL内生菌培养液，在其周围均匀放
置3块直径为5 mm的植物病原菌菌块，28 ℃恒温培养箱中培
养7 d后测量并记录拮抗距离；将拮抗性好的菌株转移传代7
次以上，继续观察其抑菌效果.
1.2.3 形态和生理生化特征 内生菌菌株的形态学和生理
生化实验见东秀珠等著《常见细菌系统鉴定手册》[4].
1.2.4 内生菌DNA提取及16S rDNA序列分析 按试剂盒操
作说明书提取细菌基因组DNA为模板，以27F（5’- AGAGT-
TTGATCATGGCTCAG -3 ’）和1540R（5’-AGGAGGTGATCCA
ACCGCA-3’）为上、下游引物扩增菌株的16S rDNA. PCR反应
体系：Ex Taq 酶0.3 μL、dNTP 2 μL、DNA 模板 2 μL、上游引
物（20 μmol L-1）0.6 μL、下游引物（20 μmol L-1）0.6 μL、Mg2+
1.5 μL、10 ×Buffer 2.5 μL、双蒸水 15.6 μL. 反应条件：95 ℃
5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，循环30次；72
℃ 15 min. 由上海英骏生物技术有限公司测序. 将菌株的
16S rDNA 序列与GenBank核酸数据库进行Blastn相似性
分析.
1.2.5 抗菌蛋白粗提液的制备 将Iun35发酵培养60~72 h，
发酵液离心（12 000 r/min，20 min）除去菌体，上清液采用
硫酸铵沉淀法，分别制备30%~40%、40%~50%、50%~60%、
60%~70%、70%~80%盐析液，4 ℃静止过夜 . 离心（12 000
r/min，10 min）弃上清，沉淀物用磷酸缓冲液（10 mmol L-1
Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5）溶解，将分级盐析后得到的粗蛋
白液加入透析袋（22 mm，Mr 14 000）内，经透析脱盐后得浓
缩粗蛋白液. 用粗蛋白液采用杯碟法检测抑菌圈大小，分别
检测抑菌活性，根据抑菌活性确定分级盐析的适宜硫酸铵
饱和度.
1.2.6 SephadexG-75层析 将预处理的SephadexG75用15
mmol/LNaCl（Tris-HCl缓冲液，pH 8.2）平衡装柱，取适量粗
提液上样，用90 mmol L-1 NaCl（Tris-HCl缓冲液，pH 8.2）洗
脱，流速为0.6 mL/min，在280 nm处检测收集活性组分.
1.2.7 DEAE-32纤维素层析 将预处理的DEAE32纤维素用
90 mmol/LNaCl（Tris-HCl缓冲液，pH 8.2）平衡装柱（10 mm
× 200 mm），取以上活性组分上样，用90~450 mmol/L NaCl
（Tris-HCl缓冲液，pH 8.2）梯度洗脱，在280 nm处检测收集
活性组分.
1.2.8 蛋白质分子量测定 按文献[5]方法进行SDS-PAGE电
泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%.
1.2.9 抑菌活性的测定 采用生长速率法，28 ℃恒温培养
24~72 h，直至真菌长满对照平板. 采用十字交叉法每隔24 h
测量各处理菌落的直径，计算抑制率. 菌丝生长抑制率=（对
照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径- 5）×100 %.
1.2.10 氨基酸组成分析 样品通过氨基酸自动分析仪测定.
2 结 果
2.1 内生菌的筛选
分离纯化获得69株内生细菌，编号为Iun01~Iun69. 初步
拮 抗测定显示，有19株内生细菌对一种或几种植物病原菌
具有拮抗活性，占菌株总数的27.5%，抑菌距离从1 mm到18.5
mm不等，其中5株内生细菌对试验的5种植物病原菌均有较
好的抑菌活性（表1），对5种植物病原菌的抑菌距离都达到
了7 mm 以上.
由表1可知，内生细菌Inu35抑菌效果最明显，对5种植物
表1 各菌株在PDA平板上对植物病害菌的拮抗作用
Table 1 　The effect of endophytic bacteria against plant pathogenic fungi on PDA medium
内生菌
Endophytic bacteria
抑菌距离 Antagonistic distance (s/mm)
玉米纹枯病菌
Rhizoctonia solani Kuha
小麦赤霉病菌
Gibberelle zeae (Schw.)
松赤枯病菌
Pestalotia funerea
玉米弯胞病菌
Curvu-laria lunata (Walk) Boed
水稻稻瘟病菌
Pyricularia oryzae Cav
Inu18 7.2 8.6 7.0 9.1 7.9
Inu22 7.5 9.3 7.9 8.5 7.1
Inu27 7.0 7.2 8.0 7.6 8.3
Inu35 9.8 9.3 8.9 19.0 16.2
Inu37 8.2 9.0 7.0 9.6 8.9
图1 Inu35在PDA平板上的抑菌效果
Fig.1 The effect of endophytic bacterium Inu35 against plant pathogenic fungi on PDA medium
GZ：小麦赤霉病菌；CL：玉米弯胞病菌；PF：松赤枯病；PO：水稻稻瘟病菌；RS：玉米纹枯病菌
GZ: Gibberelle zeae (Schw.); CL: Curvu-lalunata (Walk) Boed; PF: Pestalotia funereal; PO: Pyricularia oryzae Cav.; RS: Rhizoctonia solani Kuha.
5394 期 雍 彬等：华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质
病原菌拮抗距离分别达到了9.5、9.3、8.9、18.5、16.2 mm. 因
此，本试验选取内生细菌Iun35菌株展开下一步研究，其抑菌
效果见图1.
2.2 菌株形态和生理生化特征
内生细菌Iun35 的形态特征与生理生化特性实验结果见
表2，初步鉴定Iun35为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌.
2.3 菌株的分子鉴定
提取菌株Iun35全基因组DNA，按方法通过PCR得到1.5
kb左右的16S rDNA. 委托上海英骏生物技术有限公司测得
Iun35的16S rDNA部分序列，长度为1 454 bp. Blastn比较发现
Iun35的16S rDNA与多株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtitls）的
16S rDNA相似性为100%，与该菌株的形态特征和生理生化
特性实验结果一致. 因此，确定为枯草芽孢杆菌.
2.4 抗菌肽的分离纯化
2.4.1 抗菌蛋白粗提液的制备 对Iun35发酵液用不同硫酸
铵浓度处理和抑菌能力测定，结果发现当硫酸铵浓度在30%
以下抑菌活性较小，40%~60%时抑菌效果最强，当浓度大于
60%时抑菌效果增强不明显，所以粗提液制备采用硫酸铵浓
度为40%~60%.
2.4.2 Sephadex G-75柱层析 根据紫外检测仪指示分别收
集两个蛋白峰，以玉米弯胞病菌为指示菌，分别检测两峰收
集液的抑菌活性. 结果表明，峰Ⅰ显示出很强的抑菌活性，而
峰Ⅱ无抑菌活性. 浓缩峰Ⅰ收集液，低温保存备用（图2-A）.
2.4.3 DEAE-32纤维素层析 将经过Sephadex G-75层析后收
集的活性成分上样到已经平衡处理的DEAE32纤维素层析
柱，用NaCl梯度洗脱，得到3个洗脱峰，用玉米弯孢病菌为指
示菌进行检测，第1峰有很强的抑菌活性，而第2和第3个峰没
有发现抑菌活性. 收集活性组分，即为蛋白UD35，浓缩后低
温保存备用（图2-B）.
2.5 SDS-PAGE分子量的测定
经蛋白电泳初步鉴定，此蛋白UD35显示单一条带，其相
对分子质量约为5.5×103（图3）.
2.6 UD35的抑菌谱
抑菌试验结果表明，UD35对玉米弯胞病菌、水稻稻瘟
病菌抑菌效果最好，抑菌率达到了93.3%和91.2%；对玉米纹
枯病、镰刀霉菌、松赤枯病菌抑菌率达到80%以上；对绿色
木霉、球孢白僵菌等其他真菌菌株也有较好的抑制效果. 说
明UD35对多种植物病害真菌有良好的抑菌作用，但其对细
菌几乎没有抑菌活性（表3）.
2.7 UD35的氨基酸组成
氨基酸组成分析结果表明，UD35含有17种氨基酸，不含
有色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）和酪氨酸（Tyr），其中极性氨
基酸为58.53%，非极性氨基酸相对较少，这与该蛋白易融入
水的特点相符（表4）.
3 讨 论
植物病原真菌的感染是引起植物病害、造成作物减产
表2 菌株形态和生理生化特性
Table 2 The morphology, physiological and biochemical
characteristics of strain Iun35
特征 Characteristics Iun35
形状 Shape of strain body 短轴 Short shaft
宽度 Width of rod 0.5~0.75 μm
长度 Length of rod 1.5~2.0 μm
孢子 Spore +
革兰氏染色 Gram staining +
氧化酶试验 Oxidase test +
过氧化氢酶 Catalase +
吲哚试验 Indole test -
水解酪蛋白 Casein hydrolysis +
水解明胶 Gelatin hydrolysis +
硝酸盐还原 Nitrate reduction +
MR试验 M.R test -
淀粉水解 Starch hydrolysis +
葡萄糖的利用 Glucose utilization +
V.P +
丙酸利用 Propionate utilization -
+：阳性；－：阴性 +: Positive; －: Negative
图2 抗菌蛋白层析图谱
Fig. 2 Chromatogram of antibiotic protein
图3 UD35 SDS-PAGE凝胶电泳图
Fig. 3 SDS-PAGE of antifungal protein
M: Maker; 1: UD35
表3 UD35对病害菌的抑菌活性
Table 3 The antagonistic activities of UD35
病原菌
Pathogen
抑菌活性
Antagonistic
activity*
抑菌率
Inhibition rate
(r/%)
镰刀霉菌 Fusarium sp. +++ 83.0
绿色粘帚霉 Gliocladium viriens ++ 76.4
小麦赤霉病菌 Gibberelle zeae (Schw.) +++ 83.1
水稻稻瘟病菌 Pyricularia oryzae Cav ++++ 91.2
球孢白僵菌 Beauveria bassiana ++ 73.0
松赤枯病菌 Pestalotia funerea +++ 82.4
苹果轮纹病菌 Physalospora piricala ++ 71.6
绿色木霉 Trichoderma viride +++ 77.0
玉米弯胞病菌 Curvu-laria lunata
(Walk) Boed ++++ 93.3
玉米纹枯病菌 Rhizoctonia solani Kuha +++ 86.2
冬瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum ++ 69.1
白色念珠菌 Candida albicans + Undetermined
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus Undetermined
短双歧杆菌 Bifi dobacterium breve Undetermined
大肠埃希菌 Escherichia coli Undetermined
*抑菌活性由抑菌圈直径来表示 *The antifungal activity is expressed by
the diameter of inhibition zone. +: 2~5 mm; ++: 5~10 mm; +++: 10~15 mm;
++++: 15~20 mm
540 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
的重要原因. 植物内生菌能产生抗生素、水解酶、生物碱及
植物生长调节剂等次生代谢产物，这些物质以促进宿主植物
生长或增强抵抗力以及诱导植物产生抗性等方式控制植物
病害 [6]，而且植物内生菌可以产生植物本身所具有的或者更
为新颖的生物活性物质[7~9]，从植物内生菌分离的大部分生物
活性物质是以前没有发现的化合物 [7]. 本实验从一株华重楼
内生菌发酵液中分离纯化出的抗菌活性物质UD35，通过DS-
PAGE凝胶电泳测定其相对分子质量为5 500左右，通过氨基
酸组成分析，该物质含有17种氨基酸，但该物质的官能团及
高级结构还有待进一步研究. 同时，分离得到的原菌株发酵
生产该蛋白的产率 不高，如果能得到控制合成该蛋白的基
因，构建基因工程菌，通过基因工程菌表达生产该蛋白，将
不仅会大大提高产量，而且后续的蛋白分离纯化也会更简单.
目前应用植物内生菌进行生物防治的研究主要集中在
对植物病原菌的抑制方面[10~11]. 至今为止，内生G-菌尤其是假
单胞菌（Pseudomonas）作为生防菌得到了广泛的研究 [12]，而
内生G+菌如芽孢杆菌（Bacillus）的研究相对较少. 国内外学
者尤其着重于滇重楼的化学成分、药理作用和临床应用的研
究，本实验从华重楼（P. polyphylla var. chinensis）中分离得
到69株内生细菌，其中19株内生细菌具有拮抗活性，占到菌
株总数的27.5%，说明药用植物内生菌中分离得到活性菌株
的几率比一般植物高，与Haiyan Li等的研究结果 [13]一致.
枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtitls）能够产生丰富的具
有 潜 在 的 植 物 病 害 防 治 和医学应 用 价 值 的 抗菌 物质，包
括 表面活 性 素（Surfact in）、枯草 菌素（Subt i l in）、杆 菌
毒 霉素（Toximycin）、伊 枯草 菌素A（It u r in A）、抗 霉 枯
草 菌素（Mycosubtil in）、酶 基肽（Acylpeptide）、优 霉素
（Eumycin）、伊枯草菌素Ｃ及枯草杆菌肽（Bacitracin）等多
肽类抗生素以及杆菌毒素SLD（Bacillomycin S.L.D.）[14]等蛋
白类抗真菌素. 但从分离得到内生枯草芽孢杆菌产生的活性
物质的报道不多 [15]. 本实验从内生的枯草芽孢杆菌发酵得到
的活性蛋白UD35对真菌具有极强的抑菌活性，该蛋白由17种
氨基酸组成，国内现有报到枯草芽孢杆菌产生的抗菌蛋白大
都由19种氨基酸组成 [16]，氨基酸组成上的差异对其结构、功
能和活性的影响有待进一步研究.
References
1 Stone JK, Bacon CW, Jr White JF. An overview of endophytic microbes:
Edophytism defi ned. Microbial Endophytes, New York: M Dekker, 2000
(3): 29
2 Sun LJ (孙力军), Lu ZX (陆兆新). Advance on antibiotics produced by
endophytes. Food & Ferment Ind (食品与发酵工业), 2005, 31 (2): 39~41
3 Xu J, Zhu MZ. Antibiotic. Beijing, China: Science Press, 1982
4 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册. 北京: 科学出版社, 2001. 77~144
5 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科学出版社, 2001
6 Shi JY (石晶盈), Chen WX (陈维信), Liu AY(刘爱媛). Advances in the
study of endophytes and their effects on control of plant diseases. Acta
Ecol Sin (生态学报), 2006, 26 (7): 2396~2401
7 Strobel GA. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes &
Infect, 2003, 5 (6): 535~544
8 Cao XD (曹晓冬), Zhou LG (周立刚), LI D (李端). Advances on
bioactive compounds produced by plant endophyt ic fungi. J Northwest A
& F Univ (西北农林科技大学学报), 2005, 33 (Suppl): 201~208
9 Yang CP (杨春平), Chen HB (陈华保) , Wu WJ (吴文君) . Diversity
of plant endophytic fungi secondary metabolites and their potential
appli cations. Acta Agric Bor-Occid Sin (西北农业学报), 2005, 14 (2):
126~132
10 Liu CH (刘常宏), Zou WX (邹文欣), Lü H (吕红), Tan RX (谭仁祥).
Antifungal activity of Artemisia annua endophyte cultures against
phytopathogenic fungi. J Biotechnol (生物技术杂志), 2001 88: 277~282
11 Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN. Isolation of
endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their
activities against Ralstonia solanacearum in vitro. World J Microbiol
Biotechnol, 2006, 22: 1275~1280
12 Hallmann J, Hallmann QA , Mahaffee Wf. Bacterial endophytes in
agricultural crops. Can J Microbiol, 1997, 43: 895~914
13 Li HY, Qing C, Zhang YL, Zhao ZW. Screening for endophytic fungi
with antitumour and antifungal activities from Chinese medicinal
plants. World J Microbiol & Biotechnol, 2005, 21: 1515~1519
14 Stein T, Borchert S, Conrad B. Two different lantibiotic-like peptides
originate from the ericin geae cluster of Bacillus subtilis A1/3. J
Bacteriol, 2002, 184: 1703~1711
15 Cho SJ, Park SR, Kim MK. Endophytic Bacillus sp. Isolated from the
interior of balloon fl ower root. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66 (6):
1270~1275
16 侯顺连. 芽孢杆菌XM16菌株抗真菌蛋白的分离纯化及性质结构研
究: [硕士学位论文]. 农学院, 2006
表4 UD35的氨基酸组成
Table 4 Amino acids composition of UD35
氨基酸
Amino acid
含量 Content
(Mole fraction, x/%)
氨基酸
Amino acid
含量 Content
(Mole fraction, x/%)
Thr 3.82 Lys 7.16
Ala 6.26 Pro 6.64
Glu 10.10 Met 1.41
Ser 6.46 Ile 5.45
Arg 5.65 Phe 5.25
Gly 7.07 Leu 4.24
Cys 7.27 His 6.06
Asp/Asn 10.60 Val 4.04