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Spectroscopic analysis of the interaction between β-ionone and chemosensory protein 1 (CSP1) in Bemisia tabaci biotype Q

光谱分析Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与β-紫罗兰酮的相互作用



全 文 :植物保护学报 Journal of Plant Protection, 2016, 43(1): 62 - 69 DOI: 10􀆰 13802 / j. cnki. zwbhxb. 2016􀆰 01􀆰 009
基金项目:国家自然科学基金(31471773),北京市叶类蔬菜创新团队建设(BLVT⁃13),国家公益性行业(农业)科研专项(2013003019)
∗通讯作者(Authors for correspondence), E⁃mail: hlli@ cjlu. edu. cn, luochen@ baafs. net. cn
收稿日期: 2015 - 08 - 10
光谱分析 Q型烟粉虱化学感受蛋白 CSP1
与 β⁃紫罗兰酮的相互作用
张  萌1   吴  帆1   王  然2   冯一璐1   罗  晨2∗  李红亮1∗
(1.中国计量学院生命科学学院, 浙江省生物计量及检疫检验重点实验室, 杭州 310018;
2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所, 北京 100097)
摘要: 为明确烟粉虱在入侵过程中的寄主选择性与其化学感受系统对寄主植物挥发物的分子识别
之间的相互作用和化学机理,通过荧光、紫外光谱和圆二色谱等技术分析了烟粉虱化学感受蛋白
BtCSP1 与一种重要的植物挥发物成分—β⁃紫罗兰酮之间的相互作用。 结果表明,β⁃紫罗兰酮与
BtCSP1 在不同温度时的猝灭机理不同,300 K(27℃)时二者的亲和力较弱,表观结合常数 KA为
2􀆰 44 × 105 L / mol,较低温 290 K(17℃)和高温 310 K(37℃)时的 3􀆰 22 × 105 L / mol 和 3􀆰 23 × 105
L / mol均要低,表明 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮在不同的温度下呈现不同的结合机理,低温时为静态猝
灭,而高温时为动态猝灭。 通过热力学参数和非辐射能量转移理论分析,β⁃紫罗兰酮与 BtCSP1 蛋
白结合时发生了荧光共振能量转移,结合距离为 5􀆰 2 nm。 圆二色谱结果显示,随着 β⁃紫罗兰酮浓
度的升高,BtCSP1 蛋白中α⁃螺旋比例逐渐减少,由纯蛋白时的 63%下降到 55􀆰 9% ,二级结构发生
了变化。
关键词: 烟粉虱; 化学感受蛋白; β⁃紫罗兰酮; 荧光光谱; 作用机理
Spectroscopic analysis of the interaction between β⁃ionone and
chemosensory protein 1 (CSP1) in Bemisia tabaci biotype Q
Zhang Meng1   Wu Fan1   Wang Ran2   Feng Yilu1   Luo Chen2∗   Li Hongliang1∗
(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine; College of Life Sciences,
China Jiliang University, Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China; 2. Institute of Plant and Environmental
Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China)
Abstract: To study the chemosensory system’ s function of the whitefly Bemisia tabaci in selecting and
recognizing host volatiles in the biological invasion process, fluorescence, ultroviolet (UV) spectroscopy
and circular dichroism ( CD) were used to discover and interpret the binding interaction between a
chemosensory protein BtCSP1 and a tomato fruit volatile β⁃ionone. The results showed that the quenching
mechanism was different at different temperatures, and the binding affinity (KA) was 2􀆰 44 ×105 L / mol at
300 K (27℃), lower than those at the low temperature 290 K (17℃) and high temperature 310 K
(37℃), with a KA of 3􀆰 22 × 105 L / mol and 3􀆰 23 × 105 L / mol, respectively. This suggested that the low
temperature presented static quench, and high temperature presented dynamic quench. The results of
fluorescence and UV showed that fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurred in the binding
process, and the binding distance was calculated as 5􀆰 2 nm. CD data of the α⁃helix of BtCSP1 decreased to
55􀆰 9% with increasing β⁃ionone concentration, indicating that the dimensional structure of BtCSP1 extended.
Key words: Bemisia tabaci; chemosensory protein ( CSP ); β⁃ionone; fluorescence spectrum;
binding interaction
    烟粉虱 Bemisia tabaci (Gennadius)复合种是热
带和亚热带地区为害严重的农业害虫,寄主广泛,适
应性和繁殖力强,其中 B 型和 Q型烟粉虱传入我国
后迅速扩散并暴发成灾 (罗晨等,2000;褚栋等,
2012;刘银泉和刘树生,2012)。 植食性昆虫寻找寄
主植物的过程中,植物自身的挥发物起着至关重要
的作用(钦俊德,1987;莫圣书等,2006)。 寄主植物
挥发物对烟粉虱在选择不同植物时具有重要的行为
导向(曹凤勤等,2008;Togni et al. ,2010)。 烟粉虱
可以通过其化学感受系统分辨和识别这些挥发物
质,并建立相应的偏嗜和驱避行为(吴帆等,2015)。
深入解析烟粉虱化学感受系统对寄主植物挥发物的
感受和识别机制,对于了解其寄主选择的偏嗜性具
有重要意义。
化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)是一
类广泛存在于昆虫全身化学感受器官中的可溶性小
分子蛋白,另外一类常见的昆虫感受蛋白是专营嗅觉
感受的气味结合蛋白(odorant⁃binding proteins,OB⁃
Ps)。 在蜜蜂等研究嗅觉系统的模式生物中,CSPs得
到较为广泛的研究,一般认为其具有复杂的生理功
能,如嗅觉和信息素识别、CO2 感受、组织发育及再
生,甚至机械感受等(Pelosi et al. ,2006)。 作为一种
主要的农业害虫,烟粉虱的化学感受系统研究相对较
少,在获得 Q型烟粉虱化学感受蛋白 BtCSP1 重组蛋
白的基础上,发现其能与多种非寄主或有明显驱避行
为的植物挥发物产生较强的结合(吴帆等,2015),这
说明在烟粉虱入侵过程中 BtCSP1蛋白通过识别和结
合植物挥发物来选择或趋避植物。 β⁃紫罗兰酮是大
部分开花植物和烟粉虱多种寄主植物中普遍存在的
一种挥发性成分,但目前还没有 BtCSP1 和 β⁃紫罗兰
酮作用的相关研究。 因此,本试验基于本课题组的前
期试验结果(吴帆等,2015),对二者之间的作用进行
了更深入的分析。
蛋白与小分子的相互作用常见于小分子化学药
物与血清白蛋白的结合作用研究中 (聂丽华等,
2001;Papadopoulou et al. ,2005;张方圆和倪永年,
2012),其主要原理是利用人血清白蛋白中含有发
光氨基酸(如第 214 位色氨酸),在一定激发波下,
第 214 位色氨酸产生荧光发射光谱,当药物与血清
白蛋白结合后会吸收该色氨酸的荧光而导致荧光猝
灭 ( Yeggoni & Subramanyam, 2014; Sinisi et al. ,
2015),整个过程可以利用荧光光谱仪检测和记录,
然后通过公式计算结合常数、结合距离等参数来研
究和分析二者间的作用机制。 由于 BtCSP1 与小分
子结合时其荧光也可以被猝灭,这为深入解析二者
相互作用的化学机理提供了依据(吴帆等,2015)。
因此,本研究利用多种光谱手段对 BtCSP1 与开花植
物挥发物 β⁃紫罗兰酮的结合机理、结合距离、结合
力及构象变化等几个方面进行了探讨,以期对深入
了解烟粉虱基于化学感受蛋白的行为功能模式规
律,以及基于挥发物对烟粉虱的综合防控技术提供
理论参考。
1 材料与方法
1􀆰 1 材料
供试材料:Q型烟粉虱 BtCSP1 重组蛋白为本实
验室制备保存(吴帆等,2015)。 将本实验室前期制
备保存含有 pET30(a)⁃BtCSP1 重组质粒的 BL21 大
肠杆菌,经终浓度为 1 mmol / L 的 IPTG 诱导蛋白表
达,通过 Ni2 + ⁃琼脂糖柱对目的蛋白纯化,经牛血清
标准蛋白标定浓度,最后用 pH 7􀆰 4 的 PBS 缓冲液
稀释 BtCSP1 重组蛋白至 1 μmol / L保存备用。
试剂与仪器:β⁃紫罗兰酮(纯度 > 98% ),日本
梯希爱 ( TCI) 公司; 5 mg / mL 牛血清标准蛋白
(BSA),生工生物工程(上海)股份有限公司;其它
试剂均为国产分析纯。 RF⁃5301PC型分子荧光光谱
仪、UV⁃1800 型紫外可见分光光度计,日本岛津公
司;J⁃815 型圆二色谱仪,日本 Jasco 公司;9012 型精
密制冷 /加热循环水浴,美国 PolyScience公司。
1􀆰 2 方法
1􀆰 2􀆰 1 荧光光谱测定
为了研究 BtCSP1 重组蛋白与 β⁃紫罗兰酮结合
能力的强弱,选取荧光报告子 N⁃苯基⁃1⁃萘胺(N⁃
phenyl⁃1⁃naphthylamine,1⁃NPN)作为结合特性研究
时的竞争性荧光探针。 取 1 μmol / L的 BtCSP1 重组
蛋白于 1 cm石英比色皿中,用甲醇溶液配制成终浓
度为 1 mmol / L的 1⁃NPN滴定,混匀静置反应 2 min
后通过分子荧光光谱仪发射光谱扫描确定其激发波
长为 281 nm,记录蛋白荧光发射光谱,直至蛋白最
大荧光发射波长处的荧光值不再猝灭为止,然后再
用 1 mmol / L β⁃紫罗兰酮对 BtCSP1⁃1⁃NPN混合溶液
进行滴定,研究 β⁃紫罗兰酮与 1⁃NPN 竞争结合
361 期 张  萌等: 光谱分析 Q型烟粉虱化学感受蛋白 CSP1 与 β⁃紫罗兰酮的相互作用
BtCSP1 重组蛋白,记录荧光发射光谱和最大荧光峰
值(吴帆等,2015)。 光谱测定时激发与发射狭缝宽
度均设为 5 nm,记录 290 ~ 450 nm荧光发射光谱及
最大发射波长处荧光值。 为了探索和分析 β⁃紫罗
兰酮与蛋白的相互作用机制,本研究通过荧光光谱
法变温试验分别测试和记录不同温度 290、300、310
K下 β⁃紫罗兰酮与 1⁃NPN 竞争结合 BtCSP1 重组蛋
白,然后利用动态和静态方程计算二者结合常数
KA,并分析猝灭机制。
有机小分子对生物大分子的荧光猝灭主要包括
静态猝灭和动态猝灭。 动态猝灭利用 Stern⁃Volmer
方程进行描述和推测(Lakowicz,2006;Shahabadi et
al. ,2014):F0 / F = 1 + Kqτ0[Q] = 1 + KSV[Q],式中
F0和 F分别为猝灭剂 β⁃紫罗兰酮加入前后体系的
荧光强度;Kq为荧光猝灭速率常数;τ0为无猝灭剂时
荧光分子的平均寿命,生物大分子的荧光平均寿命
约为 10 - 8 s;[Q]为猝灭剂 β⁃紫罗兰酮的浓度;KSV为
双分子猝灭过程常数。 若结合过程为动态猝灭,则
KSV随温度升高而增大;若结合过程为静态猝灭,则
KSV随温度升高将减小(孟丽艳等,2009;黄文华等,
2011)。 静态猝灭则利用 Lineweaver⁃Burk 双倒数方
程(Woosley & Muldoon,1977)处理数据:1 / (F0 -
F) = 1 / F0 + 1 / (KAF0 [Q]),其中 F0为未加入猝灭
剂时荧光物质的荧光强度;F 为猝灭剂浓度等于
[Q]时荧光物质的荧光强度;KA为表观结合常数。
1􀆰 2􀆰 2 紫外吸收光谱测定
蛋白与小分子作用后可以影响蛋白的紫外吸
收,如紫外吸收光谱发生改变则为静态猝灭,反之则
为动态猝灭,这是由于静态猝灭产生了新的配合物
从而改变了吸收光谱的基态能量,而动态猝灭因碰
撞猝灭没有改变。 取 3 mL 浓度为 1 μmol / L 的
BtCSP1 重组蛋白于石英比色皿中,加入 3 μL 初始
浓度为 1 mmol / L的 β⁃紫罗兰酮溶液至二者摩尔浓
度比为 1 ∶ 1,以 PBS 缓冲液作为参比,在紫外可见
分光光度计中记录二者作用后在 190 ~ 400 nm波长
范围内的紫外吸收光谱。 然后在相同参数下分别测
试 BtCSP1 重组蛋白和 β⁃紫罗兰酮各自的紫外吸收
光谱,即以 PBS 缓冲液作参比测试 1 μmol / L 的
BtCSP1 重组蛋白的紫外吸收,以及以甲醇作为参比
测试 1 μmol / L的 β⁃紫罗兰酮的紫外吸收。
1􀆰 2􀆰 3 作用力和结合距离分析
由上述荧光光谱和紫外吸收光谱的测定结果,结
合热力学参数和非辐射能量转移理论,可以推测
BtCSP1重组蛋白与 β⁃紫罗兰酮结合时的作用力以及
结合距离。 配基与生物大分子之间的作用力主要包
括疏水作用力、氢键、范德华力、静电引力等,通过荧
光光谱变温试验(290、300、310 K),可以计算吉布斯
自由能 ΔG、焓变 ΔH、熵变 ΔS 的能量变化,而热力学
参数 ΔG、ΔH和 ΔS的结果可以反映蛋白与小分子的
作用力。 在配合物形成的过程中,其热力学关系式为
(Hu et al. ,2006):ΔG = - RTlnK = ΔH - TΔS;ΔH =
RT1T2 ln(K0,2 / K0,1 ) / (T2 - T1 );ΔS = (ΔH - ΔG) / T;
其中 R为气体常数,T为热力学温度,试验设有 T1 与
T2,K为结合常数,K0,1和 K0,2分别为 T1 与 T2 间的结
合常数。 当 ΔH < 0、ΔS > 0 时,作用力为疏水作用和
静电作用;当 ΔH >0、ΔS >0时,作用力为典型的疏水
作用;当 ΔH <0、ΔS <0时,作用力为氢键和范德华力
作用(Ross & Subramanian,1981)。
根据 Föster 非辐射能量转移理论 ( Selvin,
1994),当化合物满足以下条件时能量将发生非辐
射能量转移:供体能发射荧光;供体发射光谱与受体
吸收光谱有足够的重叠;供体与受体的距离接近,一
般的距离为 1 ~ 10 nm。 能量转移效率 E 与供体 -
受体之间距离 r0及能量转移距离 R0的关系为:E =
R0 6 / (R0 6 + r0 6),R0 6 = 8􀆰 8 × 10 - 25K2N - 4φJ,J = ∑F
(λ)ε(λ)λ - 4Δλ / ∑F(λ)Δλ,其中 R0为转移效率是
50%时的临界距离;K2 为偶极空间向因子,取受体
与供体各随机分布平均值的 2 / 3;N 为介质的折射
指数,一般取水和有机物折射指数平均值 1􀆰 336;φ
为供体的荧光量子产率;J 为 BtCSP1 的荧光发射光
谱与 β⁃紫罗兰酮的紫外吸收光谱间的重叠积分;
F(λ)为 BtCSP1 在波长 λ 外的荧光强度;ε(λ)为
β⁃紫罗兰酮在波长 λ时的摩尔吸光系数。 结合能量
转移效率公式 E = 1 - F / F0,其中 F 和 F0分别为能
量受体存在以及能量受体不存在时能量供体的荧光
发射强度,可以计算 r0及分析 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮
间是否发生了非辐射能量转移。
1􀆰 2􀆰 4 圆二色谱的测定
圆二色性是用来研究蛋白与小分子作用时的空
间结构变化的,由于蛋白质的α⁃螺旋在 208 nm 和
222 nm处有标志性负峰,通过α⁃螺旋等二级结构比
例变化可分析蛋白的构象变化。 在 1 μmol / L 的
BtCSP1 重组蛋白溶液中,利用圆二色谱仪在波长
190 ~ 300 nm范围内进行扫描,获得圆二色谱图,逐
渐加入 1 mmol / L 的 β⁃紫罗兰酮溶液,使蛋白与
β⁃紫罗兰酮浓度比依次为 1∶ 15 和 1∶ 22,通过 Gauss⁃
ian 03 软件(Kelly et al. ,2005;王利江等,2006)计算
获得 BtCSP1 蛋白在不同浓度 β⁃紫罗兰酮下的二级
46 植  物  保  护  学  报 43 卷
结构变化(沈星灿等,2005)。
2 结果与分析
2􀆰 1 荧光光谱及猝灭机理结果分析
β⁃紫罗兰酮与 1⁃NPN 竞争结合 BtCSP1 重组蛋
白的试验结果显示,β⁃紫罗兰酮解离常数 KD值达
14􀆰 98 μmol / L,表明二者结合力较强。 以 β⁃紫罗兰
酮直接对 BtCSP1 重组蛋白溶液进行滴定,随着β⁃紫
罗兰酮浓度的增加,BtCSP1 的荧光发射光谱发生规
律性的猝灭,且最大发射波长为 337 nm 左右(图
1)。 变温试验结果表明,β⁃紫罗兰酮与 BtCSP1 处于
2 个温度段时二者的结合机理并不相同。 温度在从
290 K(17℃)至 300 K(27℃)时的斜率 KSV减小(图
2⁃A),表明结合过程为静态猝灭;而温度在从 300 K
(27℃)到 310 K(37℃)时斜率 KSV增大(图 2⁃B),表
明结合过程为动态猝灭。
图 1 不同浓度 β⁃紫罗兰酮猝灭 BtCSP1 的荧光光谱
Fig. 1 Fluorescence spectra of BtCSP1 quenched by
β⁃ionone with different concentration
a→k: 增加 β⁃紫罗兰酮浓度后 BtCSP1蛋白荧光峰值
逐渐减小。 a→k: Fluorescence peak of BtCSP1 quenched
with increasing β⁃ionone concentration from a to k.
 
图 2 不同温度下 β⁃紫罗兰酮对 BtCSP1 蛋白荧光猝灭的 Stern⁃Volmer图
Fig. 2 Stern⁃Volmer plot of fluorescence quenching of BtCSP1 by β⁃ionone at different temperatures
 
2􀆰 2 紫外吸收光谱分析
在荧光光谱中 2 个温度区间出现了不一致的结
果,因此利用紫外吸收光谱进一步验证 BtCSP1 与
β⁃紫罗兰酮在不同温度时的光谱变化。 在低温 290
K(17℃)时,BtCSP1 混合 β⁃紫罗兰酮后紫外吸收光
谱的最大吸收发生了明显改变(图 3⁃A);在中温
300 K(27℃)时,变化极小(图 3⁃B);而在高温 310
K(37℃)时,则几乎没有发生变化(图 3⁃C)。 表明
在低温 290 K(17℃)时 β⁃紫罗兰酮对 BtCSP1 猝灭
是静态猝灭,此时由于二者产生了新的配合物而引
起吸收光谱改变;在中温 300 K(27℃)时,变化不明
显,此时可能处于过渡时期;而在高温 310 K(37℃)
时,β⁃紫罗兰酮对 BtCSP1 猝灭是动态猝灭,此时由
于只影响了荧光分子的激发态,未改变其吸收光谱。
综合紫外吸收光谱与荧光光谱分析结果,可推断
BtCSP1 蛋白与 β⁃紫罗兰酮的结合模式随温度变化
而发生改变,从 290 K(17℃)至 310 K(37℃)的变
化过程中,呈先静态后动态猝灭的过程。
Lineweaver⁃Burk 双倒数方程计算结果显示,
BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮在温度为 290 K(17℃)、300
K(27℃)和 310 K(37℃)时的表观结合常数 KA分别
为 3􀆰 22 × 105、2􀆰 44 × 105、3􀆰 23 × 105 L / mol(表 1)。
由此可知,当温度为 300 K(27℃)时 BtCSP1 与 β⁃紫
罗兰酮的表观结合常数最小,二者的结合作用也最
弱;但随着温度的升高或降低,结合常数均增大,二
者的结合作用均增强。
2􀆰 3 作用力和结合距离分析
所有供试温度下 BtCSP1 重组蛋白与 β⁃紫罗兰
酮结合时 ΔG均小于 0(表 1),表明在所有温度下的
相互作用过程均是自发反应过程。 在静态猝灭过程
561 期 张  萌等: 光谱分析 Q型烟粉虱化学感受蛋白 CSP1 与 β⁃紫罗兰酮的相互作用
图 3 不同温度下 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮作用的紫外吸收光谱图
Fig. 3 UV absorption spectra of the interaction between BtCSP1 and β⁃ionone at different temperatures
 
中,ΔH < 0、ΔS > 0表明二者的主要作用力为疏水相
互作用和静电作用;而在动态猝灭过程中,ΔH > 0、
ΔS > 0 表明二者的主要作用力为典型的疏水相互
     
作用,说明在从 290 K(17℃)至 310 K(37℃)的温
度变化过程中,疏水相互作用是二者的主要作用力,
而静电作用仅存在于低温阶段。
表 1 β⁃紫罗兰酮与 BtCSP1 相互作用的热力学参数
Table 1 Thermodynamic parameters of the interaction between β⁃ionone and BtCSP1
猝灭机制
Quenching
mechanism
温度
Temperature
(K)
结合常数
Binding affinity
KA(L / mol)
相关系数
Related
coefficient
焓变
Enthalpy change
ΔH (kJ / mol)
熵变
Entropy change
ΔS (J·mol - 1·K - 1)
吉布斯自由能
Gibbs free energy
ΔG (kJ / mol)
静态猝灭
Static quenching
动态猝灭
Dynamic quenching
290
300
300
310
3􀆰 22 × 105
2􀆰 44 × 105
2􀆰 44 × 105
3􀆰 23 × 105
0􀆰 9911
0􀆰 9947
0􀆰 9947
0􀆰 9911
- 20􀆰 29
- 20􀆰 29
20􀆰 45
20􀆰 45
35􀆰 48
35􀆰 48
171􀆰 45
171􀆰 45
- 30􀆰 58
- 30􀆰 93
- 30􀆰 98
- 32􀆰 70
    依据 Föster非辐射能量转移理论,由 BtCSP1 荧
光光谱和 β⁃紫罗兰酮紫外吸收光谱的重叠图计算
可知,当温度为 300 K (27℃)时,重叠积分 J 为
2􀆰 72 × 10 - 12,临界能量距离 R0为 6􀆰 34 nm,能量转
移效率 E为 0􀆰 094,二者分子间的距离 r0为 5􀆰 2 nm
(图 4)。 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮分子间的距离介于
1 ~ 10 nm之间,表明 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮间发生
了非辐射能量转移。
2􀆰 4 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮相互作用的构象变化
BtCSP1 蛋白在 208 nm 和 222 nm 的 2 个负峰
非常明显(图 5),表明 BtCSP1 的二级结构主要是
α⁃螺旋,经过 Gaussian 03 软件计算,在 3 种情况下,
即纯 BtCSP1 以及 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮比例分别
为 1∶ 15 和 1∶ 22 时,BtCSP1 的 α⁃螺旋比例分别从纯
蛋白时的 63%下降到 62􀆰 5%和 55􀆰 9% 。 表明随着
β⁃紫罗兰酮浓度的增加,BtCSP1 的 α⁃螺旋含量略微
下降,BtCSP1 的三维结构变得更加伸展。
3 讨论
Q型烟粉虱的化学感受蛋白 BtCSP1 已被证实
图 4 BtCSP1 荧光光谱(a)和 β⁃紫罗兰酮
紫外吸收光谱(b)重叠图
Fig. 4 Overlap figure BtCSP1 fluorescence spectra and
β⁃ionone UV absorption spectra
 
能与多种对烟粉虱有驱避作用的植物挥发物,如
3⁃蒈烯、p⁃伞花烃、顺⁃3⁃己烯⁃1⁃醇和 α⁃蒎烯等产生
较强的结合(吴帆等,2015),推测 BtCSP1 有可能参
与 Q型烟粉虱对寄主植物选择时的趋避性反应。
然而本试验中,同样用 1⁃NPN 作探针的竞争性荧光
66 植  物  保  护  学  报 43 卷
图 5 BtCSP1 添加不同浓度的 β⁃紫罗兰酮
的圆二色谱
Fig. 5 Circular dichroism spectra of BtCSP1 in the
presence of β⁃ionone with different concentrations
 
法测定发现,BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮也能产生较强的
相互作用,其解离常数 KD值达 14􀆰 98 μmol / L,表明
BtCSP1 对 β⁃紫罗兰酮的亲和力甚至高于之前发现
的各种偏嗜性挥发物。 基于 β⁃紫罗兰酮能显著猝
灭 BtCSP1 重组蛋白的荧光,而荧光猝灭法已广泛应
用于蛋白与小分子的相互作用研究中(张方圆和倪
永年,2012;Sinisi et al. ,2015)。 因此本研究利用荧
光猝灭法分析了 BtCSP1 蛋白与 β⁃紫罗兰酮的相互
作用,通过变温试验和紫外吸收光谱法确定 β⁃紫罗
兰酮与 BtCSP1 的结合模式,低温时为静态猝灭,高
温时为动态猝灭;根据热力学参数和荧光共振能量
转移理论获得二者结合时的作用力主要为疏水相互
作用,结合距离为 5􀆰 2 nm;依据圆二色谱描述不同
浓度β⁃紫罗兰酮对 BtCSP1 二级结构的影响,结果显
示随着 β⁃紫罗兰酮浓度增加,BtCSP1 的 α⁃螺旋比例
逐渐减少,说明二者结合时改变了 BtCSP1 蛋白的构
象。 本研究结果显示,Q 型烟粉虱化学感受蛋白
BtCSP1 与植物挥发性物质 β⁃紫罗兰酮的相互作用
机理与温度密切相关,这对于探讨不同温度下烟粉
虱化学感受系统与植物挥发物的相互作用,以及植
物挥发物对烟粉虱的行为导向和影响等化学作用规
律均具有重要的理论意义。
荧光变温试验发现 BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮在不
同温度下的结合机理和猝灭作用力均有一定差异,
在较低温度 17 ~ 27℃时,BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮的结
合机理为静态猝灭,其主要作用力为静电作用力和
疏水相互作用力,此温度区间的作用与东方蜜蜂
Apis cerana信息素结合蛋白 ASP1 与信息素 HOB 的
作用几乎完全一致,只是 ASP1 与 HOB 的作用力为
氢键和范德华力(Weng et al. ,2015);而当温度从
27℃升高至 37℃过程中,二者的结合机理转变为动
态猝灭,此时静电作用力消失,二者主要作用力为典
型的疏水相互作用,此温度区间的作用与东方蜜蜂
化学感受蛋白 CSP3 与 β⁃紫罗兰酮的作用完全一致
(Li et al. ,2013)。 这表明不同昆虫在不同温度下其
化学感受系统与相应化学配基或植物挥发物的结合
机理具有一定的相似性,而具体的相互作用力与相
应的蛋白和具体配基有关。
植物挥发物 β⁃紫罗兰酮具有浓郁的芳香,是开
花植物中花香的重要组成成分(金荷仙等,2006;Li
et al. ,2013)。 番茄是烟粉虱重要的偏嗜寄主之一,
在番茄果实挥发物中主要有 30 余种,β⁃紫罗兰酮是
其中非常重要的成分(Baldwin et al. ,2000);然而番
茄叶片中的挥发物并不含有 β⁃紫罗兰酮,主要是一
些萜类和烯烃物质(赵艳群等,2012)。 相对于成熟
果实的植物,烟粉虱更趋向于取食新鲜嫩叶的幼苗,
所以 β⁃紫罗兰酮可能通过化学感受系统影响烟粉
虱寄主选择,但 β⁃紫罗兰酮是否作为烟粉虱判断番
茄植株的成熟度来选择取食或趋避还需进一步研
究。 另一方面,烟粉虱在不同温度下的生理机能差
异非常大,如烟粉虱的最佳发育温度是在 26℃,在
极低( < 17℃)或极高( > 32℃)温度下其发育均会
出现滞缓(Qiu et al. ,2003),而本研究发现 β⁃紫罗
兰酮与 BtCSP1 在不同温度下的亲和力也显示出规
律性变化,当温度接近烟粉虱最佳发育温度时
(27℃),BtCSP1 与 β⁃紫罗兰酮的表观结合常数最
小,二者亲和力最小;但是在极高 (37℃)或极低
(17℃)的温度下,二者亲和力较高。 这表明烟粉虱
在最佳发育温度时,身体机能可能更倾向于发育和
生殖系统,而在不利温度下(高温或者低温)烟粉虱
化学感受系统的机能才会因环境胁迫而随之增强。
鉴于昆虫生物学和蛋白作用机制影响因子较为复
杂,今后还需在二者的亲和力随温度变化是否与烟
粉虱对逆境温度的响应机制方面进一步深入研究或
验证。
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(责任编辑:李美娟)
961 期 张  萌等: 光谱分析 Q型烟粉虱化学感受蛋白 CSP1 与 β⁃紫罗兰酮的相互作用