全 文 ：　
第４４卷　第３期　
２０１４年３月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４４（３）：０５０～０５６
Ｍａｒ．，２０１４
龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选
付　峰１，２，隋正红１，常连鹏１，周　伟１，魏惠惠１
（１．中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛２６６０３２；２．烟台大学海洋学院，山东 烟台２６４００５）
摘　要：　用紫外线辐射处理野生型龙须菜果孢子体放散刚附着的果孢子，并通过耐高温的筛选，初步获得了２株具有耐
高温，生长快速等优良性状的四分孢子体突变株，命名为ＢＺＴ－１１和ＢＺＴ－１８，将其与９８１和野生型藻株进行了比较分析。
结果显示，这２株突变体在实验室内和海上的日平均生长速率为均明显高于９８１和野生型藻株。在热胁迫时间内，ＢＺＴ－１１
和ＢＺＴ－１８的丙二醛（ＭＤＡ）含量均明显低于野生型，超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性明显高于野生型；而在整个胁迫过程中２
株突变体与９８１藻株的 ＭＤＡ含量和ＳＯＤ活性水平差异不显著。经过４ｈ的热激后，藻株ＢＺＴ－１１和ＢＺＴ－１８的ｈｓｐ７０基
因表达水平也显著高于野生型。这些结果进一步证明了该２株突变藻体的耐高温优势。本研究提供了耐高温突变体的筛
选技术。
关键词：　紫外诱变；耐高温；丙二醛；过氧化物歧化酶；热激蛋白７０；龙须菜
中图法分类号：　Ｑ９４９．２　　　　　文献标志码：　Ａ　　　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１４）０３－０５０－００
　 　基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划项目（２０１２ＡＡ１０Ａ４１１）；农业部公益性项目（２００９０３０３０）资助
收稿日期：２０１３－０３－０７；修订日期：２０１３－０３－２８
作者简介：付　峰（１９７９－），女，讲师，博士生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｕｆｅｎｇ２００５＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
　 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｉｚｈｅｎｇｈ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　龙须菜（Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ）是我国重
要的产琼胶红藻，是主要的琼胶来源；其多糖成分还具
有抗氧化和抗肿瘤等一些生理活性，具有开发医药产
品与保健食品的价值；它还被用做养殖鲍鱼的主要鲜
品饲料；龙须菜养殖可以修复浅海生态环境，有效防止
海洋赤潮［１－２］。我国龙须菜的人工栽培始于１９８０年代，
目前已成为我国继海带和紫菜之后的第三大栽培海
藻。龙须菜栽培业不仅促进了琼胶制造业的发展，还
产生了良好的生态效益，对促进我国的海水养殖事业
的可持续发展具有重要的意义［３］。
野生型龙须菜主要分布在我国山东半岛的潮间
带，其最适生长温度是１２～２３℃。随着龙须菜养殖业
的不断发展，其耐高温性、生长速率及琼胶含量仍亟待
提高，以扩大其栽培地域并延长栽培时间，进一步提高
产品产量和质量。１９９８年张学成等［３］采用 Ｎ－甲基－
Ｎ’－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）诱变，经过１０ａ的栽培选育出
了耐高温品系９８１，其生长速率、琼胶含量和耐高温性
均得到了显著地提高，在我国南方海域得到了广泛推
广，它能够耐受的最高温度由原来的２３℃提高到了
２６℃［４］，然而９８１仍然不能够在南方成功渡夏，因此亟
待选育出更加耐高温的品系，来满足龙须菜栽培业的
需要。
高温胁迫可以破坏植物体活性氧（ＲＯＳ）代谢的平
衡，导致产生过量的活性氧，引起细胞伤害。过量的活
性氧可以引起膜脂过氧化，产生丙二醛（ＭＤＡ）。丙二
醛的含量与高温对细胞的伤害程度有关［５－６］。植物通
过体内抗氧化系统来抵御氧化压力，研究显示高温胁
迫下植物体抗氧化酶的活性在植物耐高温中起着重要
作用，在藻类中的研究显示也是如此［７－８］。超氧化物歧
化酶（ＳＯＤ）是抗氧化系统中主要的一种酶，研究显示
它的活性变化与藻体的耐热性相关。热激蛋白基因
（ｈｓｐ）的表达也是藻类应对高温胁迫的一种响应机制，
当藻体受到高温胁迫时，体内的热激蛋白基因会大量
表达，参与体内新生肽链的折叠、组装以及变性蛋白的
复性和降解，缓解高温胁迫带来的伤害，产生耐热
性［９－１０］。
本实验首次利用紫外线诱变方法处理龙须菜果孢
子，通过对其进行紫外诱变，进一步探索选育龙须菜优
良品系的适宜方法。本文以耐高温作为主要性状筛选
龙须菜抗逆突变体，就高温胁迫对突变株藻体与９８１
和野生型的 ＭＤＡ含量，ＳＯＤ活性以及ｈｓｐ７０基因的
表达情况等方面的影响进行了比较分析，旨在建立适
于龙须菜耐高温品系的筛选方法和选育出龙须菜的高
产抗逆品系，为进一步将其应用于生产打下基础。
１　材料与方法
１．１果孢子体的培养和诱导放散
本实验用材料为２０１１年１０月采自青岛湛山湾的
野生果孢子体。用毛刷刷洗除去杂藻。采用ｆ／２培养
基，培养温度为（２０±１）℃，光强３０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光
３期 付　峰，等：龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选
暗周期１２Ｌ∶１２Ｄ。每周更换一次培养基。
将经过处理的雌配子体切成２ｃｍ长的藻段，置于
９ｃｍ玻璃培养皿中，加入培养基３０ｍＬ，每个培养皿中
藻体切段数为４～６段，培养条件同上。定期观察，待
果孢子大量放散。
１．２果孢子紫外诱变
将刚放散附着在玻璃平皿中的果孢子用来进行紫
外诱变，诱变剂量为２０Ｗ 紫外灯（２５４ｎｍ），距离为３０
ｃｍ，照射时间设置为０、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｓ共７个时
间梯度。每个时间梯度设置３个平行。紫外线照射后
加入ｆ／２培养基，避光黑暗培养２４ｈ，然后再恢复至光
下培养，培养条件（２０±１）℃，１５μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），１２Ｌ∶
１２Ｄ。诱变后第７天对存活的果孢子进行统计。在倒
置显微镜１０倍物镜下（×２００），随机挑选２０个视野，颜
色保持红褐色的记为存活的，统计存活的孢子数目，用
来计算果孢子的紫外诱变致死率，致死率／％＝（１－存
活孢子数目／总孢子数）×１００％。
１．３耐高温藻株的筛选
选择刚附着未经诱变处理的野生果孢子，培养在
（２０±１）℃的培养箱中，光强３０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光暗周
期１２Ｌ∶１２Ｄ，每周更换１次培养基。待其长至５ｃｍ左
右长的幼苗期时（约８周后），将培养在玻璃培养皿中
的幼苗置于高温水浴，温度分别设置为３６～４２℃共计
６个温度梯度，每个温度设置３个平行，胁迫培养
３０ｍｉｎ，然后再置于培养温度为（２０±１）℃条件黑暗培
养１２ｈ，恢复至光下培养；５ｄ后观察藻株存活情况，计
算存活率。导致野生型幼苗全部死亡的最低温度即确
定为致死温度，作为幼苗期突变藻株耐高温筛选的温
度。
将紫外诱变后生长至５ｃｍ长的四分孢子体幼苗
置于上述温度预实验确定的筛选温度，水浴热胁迫
３０ｍｉｎ，将存活的藻体经培养成熟后，每株称取约０．１ｇ
藻段，每株设３个平行，置于３５℃高温胁迫培养７２ｈ，
观察藻体状态，存活下来的即初步认定为耐高温藻株。
１．４日平均生长速率的测定
１．４．１实验室内高温培养　　称取０．５ｇ鲜重的突变
体藻株、９８１和野生型藻体，置于含３００ｍＬ灭菌海水
（含ｆ／２培养基）的５００ｍＬ三角烧瓶中，培养在培养箱
中，温度为（２８±１）℃，光照强度３０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）（１２Ｌ∶
１２Ｄ），培养３个周，每周更换１次培养基。每株藻体设
置３个平行。在培养结束后称量藻体鲜重。
１．４．２胶州湾海上培养　　２０１２年９月２０日～１０月
２０日，将初筛得到的耐高温藻株挂于青岛胶州湾海区
进行栽培试验，海区水温１８～２５℃，平均水温２１．５℃
（数据来自国家海洋局官网，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏａ．ｇｏｖ．ｃｎ）。
每个品系各夹苗１０根。在胶州湾海区挂养３０ｄ后
称重。
按照下列公式计算龙须菜的日平均生长速率
（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒａｔｅ，ＳＧＲ）：
ＳＧＲ＝１００（ｌｎＷｔ－ｌｎＷ０）／ｔ，
式中，ＳＧＲ／％·ｄ－１为日平均生长速率，Ｗｔ为第ｔ天的
藻体湿重／ｇ；Ｗ０ 为初始夹苗量／ｇ。
１．５抗逆特征分析
称取０．２ｇ鲜重的突变体、９８１和野生型藻体，置
于含２００ｍＬ灭菌海水（含ｆ／２培养基）的５００ｍＬ三角
烧瓶中，在培养温度（３２±１）℃，光照强度３０μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ
（１２Ｌ∶１２Ｄ）培养１、２、３ｄ。热胁迫后，称取０．１ｇ藻体
立即置于液氮中冻存，然后储存于－８０℃用来进行后
续的测定。每株藻体设置３个平行。在（２０±１）℃培
养的没有经过热胁迫的藻体作为对照组。
１．５．１丙二醛（ＭＤＡ）含量　　ＭＤＡ 含量采用硫代巴
比妥酸比色法测定［１１］。将０．１ｇ鲜重的样品，加入
０．０５ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．８）５ｍＬ研磨成匀
浆。加入５ｍＬ含有０．５％硫代巴比妥酸的５％的三氯
醋酸，混合液沸水浴加热１０ｍｉｎ，冷却后，１０　０００×ｇ离
心１５ｍｉｎ，收集上清，分别测定在４５０、５３２和６００ｎｍ
处的吸光值。ＭＤＡ（μｍｏｌ／ｇ　ＦＷ）含量计算如下：
ＭＤＡ＝［６．４５× （Ａ６５２－Ａ６００）－０．５６×Ａ４５０］×Ｖｔ／
（１　０００×ＦＷ），
其中，Ｖｔ：上清的体积／ｍＬ；ＦＷ：样品鲜重／ｇ。
１．５．２过氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性测定　　ＳＯＤ活性
采用氮蓝四唑（ＮＢＴ）法测定［１１］。将０．１ｇ鲜重的样
品，加入含有１％吡咯烷酮的０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液
（ｐＨ＝７．８）５ｍＬ研磨成匀浆。收集上清为粗酶液，
１０　０００×ｇ离心１０ｍｉｎ。将含有１００μＬ粗酶液的试管
中加入１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．８）２．５５ｍＬ，
１３０ｍｍｏｌ／Ｌ的甲硫氨酸３００μＬ，０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ氮蓝四
唑（ＮＢＴ）３００μＬ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ·Ｎａ２３００μＬ
和０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ核黄素６０ｍＬ。将试管置于３５℃，光
照强度为５０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）处显色２０ｍｉｎ。用可见分
光光度计在５６０ｎｍ处测定溶液的吸光值。总蛋白含
量用考马斯亮蓝染色法测定［１２］。总ＳＯＤ活性（Ｕ／ｇ），
比活力（Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏｔ）计算如下：
总ＳＯＤ活性＝（Ａ０－Ａｓ）×Ｖｔ／（Ａ０×０．５×ＦＷ×Ｖｓ）
比活力＝ 总ＳＯＤ活力／总蛋白含量，其中，Ａ０：光下对
照的吸光值；Ａｓ：样品的吸光值；Ｖｔ：粗酶液的体积／
ｍＬ；Ｖｓ：参加反应的粗酶液的体积／ｍＬ；ＦＷ：样品的鲜
重／ｇ。
１．６热激蛋白基因ｈｓｐ７０的表达情况分析
称取０．２ｇ鲜重的突变体、９８１和野生型藻体，置
于含２００ｍＬ灭菌海水（含ｆ／２培养基）的５００ｍＬ三角
烧瓶中，在３２℃培养箱中热胁迫４ｈ，光照强度３０
１５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）。在（２０±１）℃培养的没有经过热胁迫
的藻体作为对照组。实验设置３个重复。采用荧光定
量ＰＣＲ方法来确定热胁迫条件下热激蛋白基因ｈｓｐ７０
的表达量。
总ＲＮＡ的提取采用Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ试剂盒（购自
ＯＭＥＧＡ），ｃＤＮＡ 合成利用 ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤ－
ＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ试剂盒（购自ＴａＫａＲａ）。根据ｈｓｐ７０－１［１３］全
长ｃＤＮＡ 序列设计特异性引物 Ｈｓｐ７０－ｓ／Ｈｓｐ７０－ａ（见
表 １），根 据 龙 须 菜 １８ＳｒＲＮＡ 序 列 （ＧｅｎＢａｎｋ：
ＪＮ５６１０７８．１）设计内参基因引物１８ＳｒＲＮＡ－ｓ／１８Ｓ
ｒＲＮＡ－ａ（见表１）。ＱＲＴ－ＰＣＲ采用ＳＹＢＲ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｍａｓ－
ｔｅｒ　Ｍｉｘ（购自上海英维捷基）在 ＡＢＩ　７５００荧光定量
ＰＣＲ仪上进行，所有的反应设置３个平行。ｈｓｐ７０ｍＲ－
ＮＡ的表达量用２－ΔΔＣＴ方法进行计算［１４］。
表１　荧光定量ＰＣＲ中设计的引物序列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ
ｃＤＮＡ引物名称
ｃＤＮＡ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｎａｍｅ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
Ｈｓｐ７０－ｓ　 ＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣ
Ｈｓｐ７０－ａ　 ＴＣＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＡ
１８ＳｒＲＮＡ－ｓ　 ＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴ
１８ＳｒＲＮＡ－ａ　 ＴＴＧＡＣＣＣＧＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＣＡ
１．７数据分析
数据分析采用ＳＰＳＳ　２０．０进行单因素方差分析
（ＡＮＯＶＡ），采用最小显著差数（ＬＳＤ）法进行，以
Ｐ０．０５为差异显著性水平。
２　结果
２．１紫外诱变条件的确定
紫外诱变预实验采用了从０～６０ｓ的不同辐射时
间，来确定紫外诱变的半致死剂量。从图１可以看出，
果孢子对紫外线辐射比较敏感。在紫外线辐射３０ｓ
时，果孢子的致死率为６０．４６％，辐射６０ｓ时致死率为
９３．２１％。根据实际的致死率，得出紫外诱变的线性致
死率（见图１）。通过图１中的公式计算得，在致死率为
５０％时的紫外辐射时间约为２７ｓ，致死率为８０％时的
紫外辐射时间约为４８ｓ。
为了获得较高的正突变率，又不至于造成大部分
细胞死亡［１５］，本实验选用了２０Ｗ 紫外灯，照射距离
３０ｃｍ，辐射时间为４８ｓ的诱变条件。
２．２筛选温度的确定
５ｃｍ长的龙须菜四分孢子体幼苗经高温胁迫３０
ｍｉｎ后，结果显示其对高温变化比较敏感，在４１℃高温
水浴处理３０ｍｉｎ的条件下，野生型四分孢子体幼苗的
存活率为０（见图２）。以没有野生型幼苗存活的最低处
理温度作为致死温度，用来进行突变藻株的耐高温筛
选。因此，在后续的实验中采用４１℃作为突变藻株幼
苗耐高温的筛选温度。
图１　不同紫外诱变时间对果孢子的致死率
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｌｅｔｈａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｂｙ
ＵＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ
图２　不同温度胁迫下幼苗的存活率
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ　ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
２．３果孢子的紫外诱变和耐高温藻株的筛选
刚附着的果孢子（每个平皿中大约有１０５ 个孢子，
共６０个平皿）经紫外诱变后，存活的藻体幼苗培养在
９ｃｍ玻璃培养皿中，经４１℃热胁迫３０ｍｉｎ，３ｄ后观察
发现一些藻体尖端变白，有的甚至整个藻体变白死亡。
随着培养时间的延长，有的尖端变白的藻体恢复为红
棕色。５ｄ后观察藻体存活情况，此时整个藻体均保持
红棕色的藻体被认定为存活的藻株，初步认定其为耐
高温幼苗。
耐高温幼苗长至成熟藻体后，经３５℃胁迫培养
７２ｈ后，仍有部分藻体在高温胁迫下出现藻体变绿、变
白死亡的现象，另外一部分藻体经胁迫后仍然能保持
活力，藻体颜色保持红棕色，经此２次筛选后存活的藻
２５
３期 付　峰，等：龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选
株初步认定其为耐高温藻株，用于后期性状分析。
２．４日平均生长速率的测定
将初步筛选获得的耐高温藻体和９８１藻株以及野
生型，分别经过在实验室和在海上的培养后，其中２株
藻体具有较快的日平均生长速率，被命名为ＢＺＴ－１１和
ＢＺＴ－１８。
２株突变株的日平均生长速率与９８１藻株和野生
型进行了比较分析，结果发现在实验室内和海上培养
的两株突变体的生长速率明显比９８１藻株和野生型
快，而且差异极显著（Ｐ ＜０．０１）（见图３）。
（同一个图表中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｆｉｇｕｒｅ　ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．）
图３　藻株在实验室（Ａ）和海上（Ｂ）条件下的日平均生长速率
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌａｂ（Ａ）ａｎｄ　ｓｅａ（Ｂ）
２．５丙二醛含量的测定
见图４，随着胁迫时间的延长，４株藻体的 ＭＤＡ含
量呈现上升的趋势。而且野生型藻体 ＭＤＡ含量增加
的比其它３株藻体要多。在胁迫之前的对照组中显
示，４株藻体的 ＭＤＡ含量差异不显著（Ｐ＞０．０５）。在
胁迫３ｄ后，四株藻体的 ＭＤＡ含量出现了明显的差
异，野生型的 ＭＤＡ含量最高约为对照组的２．４８倍，
ＢＺＴ－１１藻株的 ＭＤＡ含量最低，为对照组的１．８１倍。
ＢＺＴ－１８和９８１藻株的 ＭＤＡ含量相近，分别为对照组
的１．８１和２．１０倍，与前两者均差异显著（Ｐ ＜０．０５）。
（Ｃ：为没有经过热胁迫的对照组；在同一胁迫时间的相同字母表示差异
不显著，而不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。Ｃ　ｗａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｗｉｔｈｏｕｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ．）
图４　藻株在热胁迫不同时间后的 ＭＤＡ含量变化
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＭＤＡ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｉｍｅ
２．６过氧化物歧化酶活性的测定
见图５在热激１天后，４株藻体的ＳＯＤ活性均呈
升高趋势，在胁迫后第１天显著升高。随着胁迫时间
的延长，藻体的ＳＯＤ活性逐渐降低，在胁迫后第３天，
其活性显著低于对照组。在高温胁迫前后，ＢＺＴ－１１、
ＢＺＴ－１８和９８１藻株的ＳＯＤ酶活性差异不显著（Ｐ＞
０．０５），但是均比野生型高，具有显著性差异。在胁迫
的第１天，藻株的ＳＯＤ含量的增加量有差异，ＢＺＴ－１１
增加了１８３．７１％，ＢＺＴ－１８增加了１７６．２１％，９８１增加
了１９５．３３％，野生型增加了 １６９．７７％。ＢＺＴ－１１ 和
ＢＺＴ－１８的增加量均比野生型的多。
（Ｃ：为没有经过热胁迫的对照组；在同一胁迫时间的相同字母表示差异
不显著，而不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。Ｃ　ｗａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｗｉｔｈｏｕｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｓｔｏｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ．）
图５　藻株在热胁迫不同时间后的ＳＯＤ活性变化
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＳＯＤ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ
ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｉｍｅ
３５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
２．７热激蛋白基因表达量的测定
热激４ｈ后，热激蛋白基因ｈｓｐ７０的表达量迅速增
加（见图６）。其中ＢＺＴ－１８和９８１藻株ｈｓｐ７０的表达量
差异不显著（Ｐ＞０．０５），分别为对照组的１５．９４和
１６．４２倍；ＢＺＴ－１１藻株ｈｓｐ７０的表达量为对照组的
１２．４８倍，这３株藻体的热激蛋白基因的表达量都明显
地高于野生型藻株（Ｐ＜０．０５）。
图６　藻株在热胁迫４ｈ后ｈｓｐ７０表达量的变化
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＭＤＡ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｓｔｒａｉｎｓ
ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｉｍｅ
３　讨论
３．１诱变方法
近年来，紫外诱变技术应用广泛，尤其在微生物和
微藻方面。它的诱变频率高，而且不易回复突变，是使
用最早、沿用最久、应用最广泛的一种物理诱变剂。紫
外线可引起ＤＮＡ与蛋白质的交联、胞嘧啶与尿嘧啶之
间的水合作用、ＤＮＡ链的断裂、形成嘧啶二聚体等，从
而导致基因突变［１５］。
紫外诱变被广泛应用于藻类诱变育种中。Ｓａｎｄ－
ｅｓｈ等［１６］利用紫外诱变的方法获得了高产类胡萝卜素
和虾青素的雨生红球藻。李建宏等［１７］利用紫外线对钝
顶螺旋藻进行诱变，筛选获得的两株突变株的生长速
度和光合放氧速率均有显著提高，而且其长碳链不饱
和脂肪酸含量高于出发藻株。张学成等［１８］通过对小球
藻株进行紫外诱变，筛选出了３个株系，其生长速率和
蛋白含量均有显著的提高。严兴洪等［１９］利用紫外线辐
射诱变条斑紫菜原生质体，获得了可再生的纯红色突
变体。Ｓｈｅｎ等［２０］通过紫外线辐射细基江蓠２ｍｍ厚
的藻体切片，对其进行诱变，通过筛选获得了稳定的具
有镉（Ｃｄ）抗性的突变藻体。
诱变育种是龙须菜品系选育的一个重要的手段。
龙须菜诱变研究中经常使用的化学诱变剂有甲基磺酸
乙酯（ＥＭＳ）和Ｎ－甲基－Ｎ’－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）。Ｚｈａｎｇ
等［２２］用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变龙须菜诱导获得了多
种色素突变体，为龙须菜的遗传研究提供了良好的材
料。张学成等［２１］用ＭＮＮＧ诱变龙须菜幼配子体，获得
了各种色素突变体，为研究突变体的光合特性和色素
组成提供了基础，而且研究发现江蓠属海藻的颜色是
由多基因控制的性状。张学成等［３］采用 ＭＮＮＧ诱变
龙须菜藻体，经过羟脯氨酸和高温条件的筛选，获得了
９８１良种，并通过海上实践证实了其遗传稳定性。孟琳
等［２３］利用 ＭＮＮＧ诱变９８１藻尖，通过高温筛选获得了
０７－２耐高温新品系，具有比９８１更耐高温、生长快、琼
胶含量高等优良特性。
相对于一些化学诱变，紫外诱变方法简单方便，安
全有效。在海藻方面大多是以微藻藻株或者大型海藻
幼体作为诱变处理的材料。在本次实验中，采用刚释
放附着的果孢子作为紫外诱变的对象，刚附着的果孢
子还没有分裂，为单细胞，遗传物质的改变容易表现在
完整植株体，不会形成嵌合体；且刚放散的果孢子也没
有很厚的多糖外壁，利于紫外线的穿透和功效发挥，因
此它是进行诱变的良好材料。本实验中利用紫外诱变
果孢子的方法来获得生长快速的耐高温突变体，实验
结果显示了紫外辐照方法对于果孢子诱变的可行性。
３．２耐热突变体的筛选
研究显示龙须菜在幼体时期具有更高的抗高温
性［２４］。本实验中为了获得能够稳定表达耐热性的突变
藻株，将不同生长阶段的突变体，包括幼苗期和成熟
期，都经过高温胁迫的筛选。四分孢子体幼苗期的耐
高温筛选温度设置为导致野生型幼苗的存活率为零的
最低处理温度。因此幼苗期高温筛选条件为４１℃热
胁迫３０ｍｉｎ。成熟期藻体的耐高温筛选温度参照本实
验室前期的实验结果［２５］。
在热胁迫条件下，ＭＤＡ含量的增加，说明细胞膜
脂过氧化的程度增高，细胞受损害的程度增加。在本
实验中 ＭＤＡ含量在整个热胁迫过程中逐渐升高，说
明藻体细胞膜受损害的程度随着胁迫的时间的增加而
增强。龙须菜在高温下 ＭＤＡ含量的变化，与他人的研
究结果相似［２６］，表明高温胁迫条件下 ＭＤＡ含量与藻
类的耐热性具有重要相关性。在整个热胁迫过程中两
株突变株的 ＭＤＡ含量明显低于野生型，而与９８１藻株
没有显著性差异，初步说明了筛选获得的这２株突变
藻株可能具有较高的抗逆性。
ＳＯＤ能够清除活性氧，是抗氧化防御系统中的关
键酶之一，研究显示藻类细胞ＳＯＤ活力的升高与其高
耐热性相关［２７－２８］。本研究结果显示在４株藻体中ＳＯＤ
活性在胁迫后的第１天内呈上升趋势，随着胁迫时间
的延长活性逐渐降低，藻体受到高温的伤害可能与
ＳＯＤ含量的降低有关。在高温胁迫下，２株突变藻株
的ＳＯＤ活性与９８１藻株相当，并始终高于野生型，而且
在胁迫第１天ＳＯＤ活性的增加幅度高于野生型，这在
一定程度上也反映了２株突变藻株具有较强的耐热
４５
３期 付　峰，等：龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选
性。
Ｈｓｐ７０是生物体内一种高度保守的热激蛋白，
ｈｓｐ７０基因的表达是藻类应对热胁迫的一种重要的方
式［２７］。Ｇｕ等［１３］也曾报道在高温胁迫条件下ｈｓｐ７０基
因的表达与龙须菜的耐热性是直接相关的。在本实验
中，４株藻体经热胁迫４ｈ后，ｈｓｐ７０基因的表达水平均
比对照组显著增高，而２株突变株ｈｓｐ７０基因的表达
量又比野生型藻株分别高出３．６４和４．６６倍。这也更
加证实了２株突变株比野生型藻体具有更高的耐热
性。
实验表明，紫外辐射是龙须菜的一种有效的诱变
育种方法。筛选出的２株耐高温突变株 ＢＺＴ－１１和
ＢＺＴ－１８显示了比９８１和野生型较快的日平均生长速
率。与野生型相比，在热胁迫条件下突变株具有较低
的 ＭＤＡ累积含量，较高的ＳＯＤ活性和ｈｓｐ７０基因表
达水平，初步显示了它们可能会具有较高的耐热性。
ＢＺＴ－１１和ＢＺＴ－１８藻株有望作为优良品系应用于生产
栽培，２株突变株的特性是否能够稳定遗传，这仍然需
要进行大量的后续研究和实践工作。
本试验将紫外诱变与耐高温筛选相结合，建立了
一套可行的龙须菜耐高温品系的筛选方法，为深入了
解龙须菜的耐高温机制，选育生长快而且耐高温的龙
须菜优良品系提供研究基础。
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５５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
ＵＶ－Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｈｅｒｍｏ－Ｔｏｌｅｒａｎｔ　Ｓｔｒａｉｎｓ
ＦＵ　Ｆｅｎｇ１，２，ＳＵＩ　Ｚｈｅｎｇ－Ｈｏｎｇ１，ＣＨＡＮＧ　Ｌｉａｎ－Ｐｅｎｇ１，ＺＨＯＵ　Ｗｅｉ　１，Ｗｅｉ　Ｈｕｉ－Ｈｕｉ　１
（１．Ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ
２６６００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｏｃｅａｎ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ　２６４００５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｔｈｅ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｍｕｔａｔｅｄ　ｂｙ　ＵＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅｒｍｏ－ｔｏｌｅｒａｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｗｏ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ＢＺＴ－１１ａｎｄ　ＢＺＴ－１８，ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｍｕ－
ｔａｎｔｓ　ｇｒｅｗ　ｆａｓｔｅｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｔｈａｎ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅａ．
Ｔｈｅ　ＭＤＡ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ＢＺＴ－１１ａｎｄ　ＢＺＴ－１８ｗｅｒｅ　ａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ
ｔｈｒｅｅ　ｄａｙｓ’ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ　ＳＯＤ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＢＺＴ－１１ａｎｄ　ＢＺＴ－１８ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ
ｔｈｅ　ｗｉｌｄ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｏｓｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ｗｅｒｅ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｖｅｌ　ａｌ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ
ｈｓｐ７０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ａｆｔｅｒ　４ｈｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ．Ａｌ　ｔｈｅｓｅ　ｍａｙ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ａ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｗａｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　ＵＶ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｈｅａｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　７０；Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
责任编辑　高　蓓
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