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湖南农业大学学报(自然科学版) 2014年 4月 第 40卷 第 2期
Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), Apr. 2014, 40(2):153–156 
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.009
投稿网址：http://www.hunau.net/qks
菊花脑热激蛋白 70 基因的克隆及表达分析
张杨 1，孙明 1,2,3*，杨海燕 1，张启翔 1,2,3
(1.北京林业大学园林学院，北京 100083；2.国家花卉工程技术研究中心，北京 100083；3.花卉种质创新与分子
育种北京市重点实验室，北京 100083)
 
摘 要：采用同源克隆结合 RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白 70基
因 (hsp70) 的 cDNA序列，并通过荧光定量 PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在 40 ℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、
2、3、6 h)后叶片中 hsp70基因的表达差异。结果表明，克隆的 cDNA序列全长 2 224 bp，与水母雪莲花、紫茎泽
兰的 hsp70 基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为 88%、98%，表明该序列为菊花脑的 hsp70 基因序列
(GenBank登录号，KJ561911)，命名为 Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为 1 944 bp，其编码的蛋白(647个氨
基酸) 的相对分子质量约为 70 900，含有 HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明，Cnhsp70基因的表达
在热激后短时间内迅速上调，热激 3 h达到最高，热激 6 h时表达量迅速下调。
关 键 词：菊花脑；热激蛋白 70；基因克隆；高温胁迫；表达分析
中图分类号：S682.1+1 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2014)02−0153−04
 
Cloning and expression analysis of heat shock protein 70 gene
in Chrysanthemum nankingense
ZHANG Yang1, SUN Ming1,2,3*, YANG Hai-yan1，ZHANG Qi-xiang1,2,3
(1.College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.National Engineering
Research Center for Floriculture, Beijing 100083, China; 3.Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm
Innovation and Molecular Breeding, Beijing 100083, China)
 
Abstract: Homology cloning combined with RACE techniques was applied to clone the cDNA of heat shock protein 70
gene (hsp70) from Chrysanthemum nankingens and real–time quantitative PCR (qRT–PCR) was conducted to analyze the
expression patterns of this gene under 40 for 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h and 6 h℃ . The results showed that the full cDNA
sequence cloned is 2 224 bp, which is determined to be hsp70 gene of Chrysanthemum nankingens, and subsequently named
Cnhsp70 as it shares 88% homology with Saussurea medusa at nucleotide level and 98% homology with Ageratina
adenophora at amino acid level. Cnhsp70 contains a 1 944 bp open reading flame (ORF), which encodes 647 amino acids
containing the HSP70 family sequence tags with a predicted molecular mass of 70 900. Real–time quantitative PCR
presented that the expression of Cnhsp70 was up-regulated quickly in a short time after heat stress and get to the highest level
3 h after stress, which was rapidly down-regulated 6 h after stress.
Key words: Chrysanthemum nankingense; heat shock protein 70; gene cloning; heat stress; expression analysis

                                                              
收稿日期：2013–12–09
基金项目：国家“十二·五”科技支撑计划(2013BAD01B07)；中央高校基本科研业务费专项(YX2011-32)
作者简介：张杨(1989—)，女，湖南常德人，硕士研究生，主要从事园林植物遗传育种研究，zhangyang8144@163.com；*通信作者, sun.sm
@163.com
热激蛋白(heat shock protein, HSP)是生物体在
应对高温或其他胁迫环境下所产生的应激蛋白，能
在短时间内大量合成和累积，以提高生物体对高温
等不利环境的耐受性[1]。不同物种 HSPs 的氨基酸
序列与功能都很保守。Carper 等[2]根据相对分子质
量大小，将热激蛋白分为 HSP110、HSP90、HSP70、


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HSP60、小分子 sHSP 和泛素等 6 个家族，其中，
HSP70 最为保守和普遍[3]，也是研究得最为广泛的
热激蛋白之一。目前，已从拟南芥[4]、玉米[5]、菠
菜[6]、紫茎泽兰[7]等植物中克隆到 hsp70 基因，但
有关菊花的 hsp70基因还未见报道。
菊花(Chrysanthemum morifolium)是中国十大传
统名花和世界四大切花之一，品种丰富，花型花色
多样，观赏价值极高。菊花生长和发育的最适温度
是 15~25 ℃，超过 25 ℃即不利于菊花的生长。菊
花脑(Chrysanthemum nankingense)为菊科菊属菊花
的野生种，有较强的耐热能力[8]。本研究运用同源
克隆技术，拟从菊花脑中克隆出 hsp70基因，并对
其在高温下的表达情况进行分析，旨在为菊花耐热
育种及种质发掘提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 供试菊花
从北京林业大学小汤山基地菊花资源圃选择
无病虫害、长势一致的菊花脑脚芽进行扦插繁殖，
所用基质为草炭和珍珠岩(质量比为 1∶1)，温室培
养 2个月后，转移至人工气候箱中。于温度 20 /℃
18 ℃(白天/黑夜)，相对湿度 75%，光周期 12 h/12
h(光照/黑暗)的条件下缓苗 1 d 后，将温度设成
40 ℃，热激 6 h，收集热激前(热激 0 h)、热激后 0.5、
1、2、3、6 h的上部新鲜叶片置于液氮中冷冻后，
–70℃保存、备用。
1.2 方 法
1.2.1 总 RNA 的提取
用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(艾
德莱)分别提取收集的叶片的总 RNA。用 NanoDrop
2000 超微量分光光度计 (Thermo Scientific)测定
RNA的 A260 nm/A280 nm值，判断质量，并用 1%的琼
脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性。
1.2.2 hsp70 基因的克隆
1) 中间保守序列的扩增。 选取热激 3 h的叶片
的总 RNA，用 TIANscript cDNA 第一链合成试剂盒
(天根生化科技有限公司)合成总 cDNA。根据GenBank
蛋白数据库中紫茎泽兰(登录号为 ACM42161)、烟
草(登录号为 AAR17080)、水母雪莲花(登录号为
AAV97978)、杜鹃(登录号为 ADD71975)、仙客来(登
录号为 ABP35942)等 hsp70基因的序列，利用在线
网站 Icodehop设计简并引物 HSP1(5′–CTTATTCTT
GTGTTGGAGTTTGGCARCAYGAYMG–3′)和 HSP2
(5′–ATCTCTCAGACACTTTTCAACAGGYTCCAT
RCAYT–3′)，以扩增 hsp70 基因的中间保守序列。
PCR反应体系 (25 μL)为：cDNA 2 μL，2×Taq PCR
MasterMix(BIOMIGA)12.5 μL，10 μmol/L HSP1 0.3
μL，10 μmol/L HSP2 0.3 μL。PCR反应程序为：94 ℃
预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 1 min，30个循环；最后 72 ℃延伸 4 min。将
扩增得到的 PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，
切胶回收后经 T载体克隆，测序。
2) 3′RACE 的扩增。选取热激 3 h 的叶片的总
RNA，用 SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit
试剂盒(Clontech公司)合成 cDNA。根据测序获得的
中间保守序列设计特异引物 3GSP1(5′–GACATCAC
TGGTAACCCCAGAGCCC–3′)和 3GSP2(5′–CCCTC
TCATCAACTGCTCAAACCACC–3′)，按照SMARTer™
RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行两轮扩
增，以获得 hsp70基因 3′–端序列。将扩增得到的 PCR
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后经 T载
体克隆，测序。
3) 5′RACE 的扩增。根据测序获得的中间保守
序列设计引物GSP(5′–TCGC CTACCGATGAGA–3′)，
以热激 3 h 的叶片的总 RNA 为模板，用 5′RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version
2.0 试剂盒(Invitrogen 公司)合成扩增 hsp70 基因 5′–
端序列所需的 cDNA，然后分别以根据中间保守序
列设计的引物 5GSP1(5′–GTGTTGGTAGGGTTCAT
GGC–3′)和 5GSP2(5′–CTCAGAATCAGTAAAGGCA
AC–3′)进行第一轮和第二轮扩增。将扩增得到的
PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后
经 T载体克隆，测序。
4) 全长 cDNA 的拼接与验证。使用 Contig-
Express 序列拼接软件将扩增得到的 3 段目的基因
片段进行拼接，获得 hsp70基因全长 cDNA。根据
拼接所得序列设计特异引物 70U1(5′–AAACATTA
CACTCTCTCATCAC–3′)和 70D1(5′–TTGTATTGT
ATCACAAGCAAC–3′)，以热激3 h的叶片的总cDNA
为模板进行 PCR扩增。将扩增得到的 PCR产物经
1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后经 T 载体克


第 40 卷第 2 期 张杨等 菊花脑热激蛋白 70 基因的克隆及表达分析 155 
隆，测序。将测序结果与拼接序列用 DNAman软件
进行比对。
1.2.3 序列分析
用 NCBI 网站(http://www.ncbi. nim.nih.gov/)
BLASTn、BLASTp软件及 DNAman软件进行核苷
酸序列、氨基酸序列的比对和保守域的预测。
1.2.4 基因表达分析
用 TIANscript cDNA 第一链合成试剂盒，以
热激后 0、0.5、1、2、3、6 h的叶片的总 RNA为
模板合成 cDNA。根据获得的全长基因序列设计上
游引物(5′–GAAGTAGGCTGGGA CTGTAAC–3′)和
下游引物(5′–TAACTACAAGGGTGAGGAGAA–3′)。
在 Piko® Thermal Cycler 96–well system (Thermo
Scientific)，用 SYBR® Premix EX TaqTM (Til RNaseH
Plus)试剂盒(TaKaRa公司)进行定量 PCR检测，PCR
扩增体系为 10 μL (cDNA模板 1 μL，10 μmol/L上、
下游引物各 0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，
ddH2O 3.6 μL)。反应条件：95℃预变性 1 min，95℃
变性 15 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，40个循
环后进行熔解曲线分析。每个样品重复 3次，结果
取平均值。选预试验中表达量较稳定的 PP2Acs 基
因为相对定量的内参基因[9]，采用 2–△△Ct 方法[10]
计算相对表达量，比较不同热激时间下目的基因的
表达情况。
2 结果与分析
2.1 RNA 的质量检测
用 NanoDrop 2000 超微量分光光度计对提取
的 RNA的 A值进行测定，其 A260 nm/A268 nm略大于
2.0，表明 RNA的纯度较高。凝胶电泳结果也显示，
总 RNA 的条带清晰(图 1)。可见，所提取的 RNA
纯度高，完整性好，可以满足后续试验的要求。


1~6分别为热激处理 0、0.5、1、2、3、6 h的菊花脑叶片的 RNA。
图 1 菊花脑叶片的总 RNA 电泳结果
Fig.1 Electrophoresis of RNA isolated from leaves of
Chrysanthemum nankingense
2.2 菊花脑 hsp70 的 cDNA 克隆
以菊花脑叶片 cDNA 为模板，使用引物组合
HSP1、HSP2扩增，获得大小为 831 bp的 hsp70基
因的中间片段(图 2–A)。根据中间片段序列，进行
3′Race、5′Race扩增，获得 1 323 bp的 3′序列(图 2–B)
和 252 bp的 5′序列(图 2–C)的 cDNA片段。将 3个
片段的序列拼接后得到大小为 2 224 bp的基因全长
序列。根据拼接的全长序列设计引物，扩增获得了
2 224 bp(图 2–D)的片段，验证了拼接序列的正确性。
Blastn分析发现，克隆的序列与水母雪莲花(GenBank
登录号为 AF509336)、紫茎泽兰(GenBank登录号为
EU269069) hsp70基因的同源性均为 88%，表明获得
的基因为菊花脑 hsp70基因，命名为 Cnhsp70，将序
列登录 GenBank，获得的登录号为 KJ561911。

M 1 M 1
                     
A B  
M 1 M 1
                   
C D
M 为 DNA 相对分子质量 DL 2000；A 中 1 为中间片段产物；B 中
1 为 3′RACE 产物；C 中 1 为 5′RACE 产物；D 中 1 为全长 cDNA 产物。
图 2 菊花脑 hsp70 的 PCR 扩增电泳结果
Fig.2 Electrophoresis of PCR products for hsp70 of
Chrysanthemum nankingense
2.3 菊花脑 Cnhsp70 序列分析
Cnhsp70的 cDNA含 1 944 bp的完整开放性阅
读框，编码 647个氨基酸，与水母雪莲花(GenBank
登录号：AAV97978)、紫茎泽兰(GenBank登录号为
ABX76301) hsp70基因的编码氨基酸的同源性均高
28 s
18 s
500 bp
100 bp
1 000 bp
250 bp
2 000 bp
750 bp
750 bp
2 000 bp
1 000 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 000 bp
500 bp
100 bp
250 bp
2 000 bp
750 bp
750 bp
100 bp
250 bp
500 bp
1 000 bp
2 000 bp


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达 98%，并包含 HSP70高度保守的 3个家族标签序
列 DLGTTYS(13–19)、IFDLGGGTFD VSLL(203–
216)和 VVLVGGSARIPKVQQ(340–354)；1个非细
胞器保守基序 RARFEEL(305–311)；1 个糖基化位
点NVSA(493–496)和胞质HSP70的特征基序EEVD
(644–647)[11]。
2.4 Cnhsp70 表达特性分析
定量 PCR 检测结果表明，当菊花脑受到高温胁
迫时，Cnhsp70的表达量呈现先升高再下降的趋势。
高温胁迫0.5 h时，Cnhsp70的表达量为对照的3倍多；
之后其表达保持平缓的上升趋势，于高温胁迫 3 h时
达到最大，接近对照的 5倍；但当热激 6 h时，Cnhsp70
基因表达量急剧下降，甚至略低于对照水平。
3 讨 论
热激蛋白能提高植物的耐热性，减少高温对生
物体的伤害[12–13]。本试验利用同源克隆技术获得了
菊花脑热激蛋白 70 基因(Cnhsp70)，并对其表达进
行了分析，得出 Cnhsp70基因在常温下有少量表达，
且表达量稳定，而在受到短暂高温刺激后表达量明
显提高。可见，HSP70 能在短时间内对高温胁迫进
行响应。然而，Cnhsp70的表达量在热激处理 6 h后
出现显著性下降，这与同为热激蛋白家族的
Lshsp90[14]及老鼠的 hsp70基因[15]表现一致，这可能
是由于热激基因的长时间表达不利于生物体，生物
体在适应了高温环境后其表达即下调[16]。
本试验的结果表明，菊花脑的热激蛋白 70 主
要在热胁迫初期起作用，以短时间内大量表达来帮
助植物体应对不利环境，表明可根据 hsp70短时表
达量的多少来初步判断菊花脑的耐热情况。
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责任编辑：罗 维
英文编辑：罗 维