全 文 ：第 源员 卷摇 第 远 期
圆园员源 年 员圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 远
阅藻糟援 摇 圆园员源
基金项目院 西北农林科技大学基本科研业务费专项渊匝晕圆园员猿园员员冤袁西北农林科技大学博士科研启动基金渊圆园员猿月杂允允员员源冤袁陕西省科学技
术研究发展计划渊圆园员猿运园圆鄄员圆冤
作者简介院 罗晨袁男袁员怨愿怨年生袁硕士研究生袁研究方向为昆虫体内微生物袁耘鄄皂葬蚤造院 造糟扎澡蚤遭葬燥岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则泽 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 澡怎扎怎择蚤灶早岳 灶憎泽怎葬枣援 藻凿怎援 糟灶袁 扎澡葬燥澡赠岳 灶憎泽怎葬枣援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员源 原 员员 原 员缘
禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员基因的克隆尧
序列分析及原核表达
罗摇 晨员 摇 于永昂圆 摇 左亚运员 摇 张改生圆 摇 赵惠燕员鄢摇 胡祖庆员鄢
渊员援 西北农林科技大学植物保护学院袁 旱区作物逆境生物学国家重点实验室袁 陕西 杨凌 苑员圆员园园曰 圆援 西北农林
科技大学袁 国家杨凌农业生物技术育种中心袁 国家小麦改良中心杨凌分中心袁 小麦育种教育部工程研究中心袁
陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室袁 杨凌 苑员圆员园园冤
摘要院 为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理袁采用 砸栽鄄孕悦砸 方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽鄄杂鄄转
移酶渊早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽袁郧杂栽泽冤的 糟阅晕粤序列袁命名为 砸责郧杂栽员渊郧藻灶月葬灶噪 登录号 运孕员怨圆愿缘园冤袁
并构建原核表达载体 责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽员袁对 砸责郧杂栽员 基因进行原核表达尧杂阅杂鄄孕粤郧耘 和 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早
检测遥 结果显示袁禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的编码区长 远缘员 遭责袁编码 圆员远 个氨基酸袁分子量约为
圆源郾 园远 噪阅袁理论等电点为 远郾 圆园曰砸责郧杂栽员 基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为 源缘 噪阅 的融
合蛋白袁与预测的融合蛋白分子量大小一致遥 通过克隆 砸责郧杂栽员 基因的 糟阅晕粤序列并进行序列比对
分析袁表明构建了 郧杂栽基因的原核表达载体并成功表达遥
关键词院 禾谷缢管蚜曰 谷胱甘肽鄄杂鄄转移酶曰 基因克隆曰 序列分析曰 原核表达
悦造燥灶蚤灶早袁 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 葬灶凿 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻
杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 早藻灶藻 枣则燥皂 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤 渊匀藻皂蚤责贼藻则葬院 粤责澡蚤凿蚤凿葬藻冤
蕴怎燥 悦澡藻灶员 摇 再怎 再燥灶早爷葬灶早圆 摇 在怎燥 再葬赠怎灶员 摇 在澡葬灶早 郧葬蚤泽澡藻灶早圆 摇 在澡葬燥 匀怎蚤赠葬灶员鄢摇 匀怎 在怎择蚤灶早员鄢
渊员援 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 杂贼则藻泽泽 月蚤燥造燥早赠 枣燥则 粤则蚤凿 粤则藻葬泽袁 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 晕燥则贼澡憎藻泽贼 粤 驭 云 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁
再葬灶早造蚤灶早 苑员圆员园园袁 杂澡葬葬灶曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 晕燥则贼澡憎藻泽贼 粤 驭 云 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠曰 晕葬贼蚤燥灶葬造 再葬灶早造蚤灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 驭 月则藻藻凿蚤灶早 悦藻灶贼藻则曰 再葬灶早造蚤灶早 月则葬灶糟澡 燥枣 杂贼葬贼藻 宰澡藻葬贼 陨皂责则燥增藻皂藻灶贼 悦藻灶贼藻则曰 宰澡藻葬贼 月则藻藻凿蚤灶早
耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 砸藻泽藻葬则糟澡 悦藻灶贼藻则袁 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 耘凿怎糟葬贼蚤燥灶曰 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 匀藻贼藻则燥泽蚤泽 燥枣
杂澡葬葬灶曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 再葬灶早造蚤灶早 苑员圆员园园袁 杂澡葬葬灶曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 糟造葬则蚤枣赠 贼澡藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤 贼燥 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻泽 葬贼 皂燥造藻糟怎造葬则
造藻增藻造袁 贼澡藻 糟阅晕粤 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 郧杂栽 早藻灶藻泽 燥枣 砸援 责葬凿蚤 憎藻则藻 糟造燥灶藻凿 怎泽蚤灶早 砸栽鄄孕悦砸 葬灶凿 凿藻泽蚤早灶葬贼藻凿 葬泽
砸责郧杂栽员 渊 郧藻灶月葬灶噪 晕燥援 运孕员怨圆愿缘园 冤援 栽澡藻 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 砸责郧杂栽员 早藻灶藻 憎葬泽 凿燥灶藻 葬枣贼藻则
糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 蚤贼泽 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽员袁 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶凿 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早
葬灶葬造赠泽蚤泽援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 砸责郧杂栽员 早藻灶藻 蚤灶糟造怎凿藻凿 葬灶 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻 燥枣 远缘员 遭责 藻灶糟燥凿蚤灶早 圆员远
葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则藻凿蚤糟贼藻凿 皂燥造藻糟怎造葬则 皂葬泽泽 燥枣 圆源郾 园远 噪阅袁 葬灶凿 贼澡藻 贼澡藻燥则藻贼蚤糟葬造 蚤泽燥藻造藻糟贼则蚤糟 责燥蚤灶贼 憎葬泽
远郾 圆园援 栽澡藻 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 砸责郧杂栽员 蚤泽 源缘噪阅袁 憎澡蚤糟澡 蚤泽 糟燥灶泽蚤泽贼藻灶贼 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则藻凿蚤糟贼藻凿
则藻泽怎造贼援 栽澡藻 糟阅晕粤 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 郧杂栽 早藻灶藻 枣则燥皂 砸援 责葬凿蚤 憎藻则藻 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 糟造燥灶藻凿 葬灶凿 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻造赠
葬灶葬造赠扎藻凿援 栽澡藻 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 增蚤贼则燥 遭赠 责耘栽 泽赠泽贼藻皂援
运藻赠 憎燥则凿泽院 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤曰 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽曰 早藻灶藻 糟造燥灶蚤灶早曰 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
摇 摇 谷胱甘肽鄄杂鄄转移酶渊 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽袁
郧杂栽泽冤是一个由多基因家族编码的多功能蛋白酶袁
普遍存在于动物尧植物尧酵母和细菌等生物体内咱员暂 遥
该酶系在生物体内对内源性和外源性有毒物质的降
解过程中起着重要作用袁其主要功能是催化谷胱甘
肽渊早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻袁郧杂匀冤的巯基与一些亲电子类有毒物
质渊如杀虫剂尧除草剂和过氧化物等冤进行轭合反应
渊糟燥灶躁怎早葬贼蚤燥灶 则藻葬糟贼蚤燥灶冤袁中和亲电子中心袁提高水溶
性袁降低细胞毒性袁进而起到解毒作用咱圆 原 源暂 遥 郧杂栽泽
一般由 圆 个亚基组成同源或异源二聚体袁每一亚基
包含 圆 个结构域袁由 缘 耀 员园 个氨基酸残基组成的可
变连接区连接的 晕端结构域和 悦 端结构域袁晕 端结
构域含有保守的谷胱甘肽特异结合的 郧 位点袁悦 端
结构域含有可变性较大的结合疏水底物的 匀 位
点咱缘暂 遥 昆虫 郧杂栽泽可分为 杂蚤早皂葬尧韵皂藻早葬尧在藻贼葬尧栽澡藻贼葬尧
阅藻造贼葬和 耘责泽蚤造燥灶 等 远 个家族咱远暂 袁其中与杀虫剂抗性
相关的家族为昆虫特异的 阅藻造贼葬 和 耘责泽蚤造燥灶 家族咱苑暂 遥
目前袁对昆虫 郧杂栽功能的研究主要集中在对杀虫剂
的解毒代谢和抗氧化 圆 方面遥
禾谷缢管蚜 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤 渊蕴蚤灶灶葬藻怎泽冤是
小麦生产上的主要害虫之一袁在世界各地广泛分布袁
我国南北麦区均有发生袁已经成为小麦上的优势种
群袁严重影响小麦产量和品质遥 目前袁禾谷缢管蚜防
治主要以化学防治为主袁杀虫剂长期使用使其产生
了不同程度的抗药性袁同时对麦蚜的天敌造成不可
避免的伤害袁使其对麦蚜的自然控制能力减弱咱愿暂 遥
在害虫对杀虫剂产生抗性的多种机制中袁解毒酶活
性的增强是一种重要机制袁主要表现为解毒酶对杀
虫剂的代谢能力增强或对杀虫剂的结合力提高遥 谷
胱甘肽鄄杂鄄转移酶在昆虫对杀虫剂的解毒过程中起
着重要作用咱怨 原 员园暂 遥 已有研究表明谷胱甘肽鄄杂鄄转移
酶可以被杀虫剂诱导袁抗性种群比敏感种群的谷胱
甘肽鄄杂鄄转移酶活性高咱怨袁员员暂 遥 谷胱甘肽鄄杂鄄转移酶对
有机磷尧有机氯和氨基甲酸酯类等杀虫剂具有较高
的代谢活性咱员圆 原 员猿暂 遥 栽葬灶早 驭 栽怎咱员源暂研究表明果蝇和
家蝇 郧杂栽泽基因与 阅栽栽 抗性有关袁过量表达的重组
按蚊 郧杂栽泽基因产物在体外能催化 阅阅栽 脱氯化氢降
解生成 阅阅耘咱员缘 原 员远暂 袁二斑叶螨 栽藻贼则葬灶赠糟澡怎泽 怎则贼蚤糟葬藻
运燥糟澡抗螺螨酯品系中 郧杂栽 的相对表达量比敏感品
系显著增高咱员苑暂 遥 因此袁研究谷胱甘肽鄄杂鄄转移酶与
杀虫剂的关系袁对于防治小麦害虫具有重要的理论
和实践意义遥 本研究采用生物信息学技术和 砸栽鄄
孕悦砸方法从禾谷缢管蚜中克隆 郧杂栽 基因的 糟阅晕粤
序列袁并构建 郧杂栽 基因的原核表达载体袁在大肠杆
菌 月蕴圆员 渊阅耘猿冤宿主菌中诱导表达袁应用 宰藻泽贼藻则灶
遭造燥贼贼蚤灶早检测融合蛋白袁确认目的蛋白的表达袁以期
为进一步研究该基因在禾谷缢管蚜体内的功能奠定
理论基础遥
员 材料与方法
员郾 员 材料
供试昆虫院禾谷缢管蚜虫由本实验室人工饲养袁
饲养条件为温度 圆园 依 圆 益尧相对湿度渊苑缘 依 圆冤豫 尧光
周期 员源 蕴 颐 员园 阅遥
菌种及质粒院责郧酝鄄栽 载体尧大肠杆菌 阅匀缘琢 和
月蕴圆员渊阅耘猿冤阅晕粤 纯化回收试剂盒均购自北京天根
生物有限公司曰表达质粒 责耘栽鄄猿圆葬渊 垣 冤购自德国 晕燥鄄
增葬早藻灶公司遥
试剂院总 砸晕粤 提取试剂 栽则蚤扎燥造 和质粒小提试剂
盒购自北京天根生物有限公司曰反转录试剂盒尧限制
性内切酶和 栽源 阅晕粤连接酶均购自大连宝生物有限
公司曰 栽葬择 孕悦砸 月怎枣枣藻则尧栽葬择 阅晕粤 聚合酶尧阅晕粤 纯化
回收试剂盒袁北京庄盟国际生物基因科技有限公司遥
蕴月培养基院蛋白胨 员园 早尧酵母提取物 缘 早尧氯化钠
员园 早袁员圆员 益灭菌 圆园 皂蚤灶遥
仪器院阅再悦孕鄄猿源粤琼脂糖凝胶电泳仪袁北京六一
仪器厂曰苑圆员 型紫外分光光度计袁上海菁华科技仪器
有限公司曰哉灶蚤增藻则泽葬造 匀燥燥凿域型凝胶成像仪袁美国 月蚤燥鄄
砸葬凿公司曰酝曾猿园园园孕栽酝 孕悦砸仪袁美国 杂贼则葬贼葬早藻灶藻 公司曰
杂糟蚤藻灶贼扎鄄陨陨阅超声波细胞粉碎机袁宁波新芝生物科技
股份有限公司遥
员郾 圆 方法
员郾 圆郾 员 总 砸晕粤提取与 糟阅晕粤的合成
总 砸晕粤纯化后袁用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光
光度法检测提取总 砸晕粤 的完整性和纯度袁置于
原愿园 益保存备用遥 反转录操作依照反转录试剂盒
孕则蚤皂藻杂糟则蚤责贼栽酝 砸栽 砸藻葬早藻灶贼 运蚤贼 产品说明书进行反转
录试验遥
员郾 圆郾 圆 砸责郧杂栽员 基因的克隆及生物信息学分析
根据豌豆蚜 粤糟赠则贼澡燥泽蚤责澡燥灶 责蚤泽怎皂 谷胱甘肽鄄杂鄄转
移酶渊郧藻灶月葬灶噪登录号院晕酝赃园园员员远圆愿园圆冤的 糟阅晕粤 序
列袁搜索禾谷缢管蚜的 耘杂栽 数据库袁拼接获得一个
包含完整开发阅读框渊 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻袁韵砸云冤的
禾谷缢管蚜 郧杂栽 基因 糟阅晕粤 序列袁利用 孕则蚤皂藻则 缘郾 园
设 计 孕悦砸 扩 增 引 物院 砸责郧杂栽鄄云院 缘忆鄄悦粤粤悦郧栽鄄
悦粤粤粤粤悦栽悦悦粤粤 悦鄄猿忆曰砸责郧 杂栽鄄砸院 缘忆鄄栽悦粤粤粤粤悦粤悦鄄
郧粤粤粤悦粤悦粤粤鄄猿忆遥 以反转录合成的 糟阅晕粤 第一链为
模板进行 孕悦砸 反应袁扩增体系为院员 滋蕴 糟阅晕粤尧员园 伊
远远远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
栽葬择 孕悦砸 月怎枣枣藻则 圆郾 缘 滋蕴尧圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 酝早悦造圆 员郾 缘 滋蕴尧员园皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕 员 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴 上下游引物各 员 滋蕴尧
栽葬择 阅晕粤聚合酶 园郾 圆缘 滋蕴和 凿凿匀圆韵 员远郾 苑缘 滋蕴遥 反应
条件为院怨源 益 猿 皂蚤灶袁怨源 益 源园 泽袁缘远 益 源园 泽袁苑圆 益 源园 泽袁
共 猿缘 个循环曰最后 苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶遥 孕悦砸 产物经
员豫琼脂糖凝胶电泳检测后袁用 阅晕粤 纯化回收试剂
盒回收目的条带并连接 责郧酝鄄栽载体袁连接产物转化
至大肠杆菌 阅匀缘琢袁进行 粤皂责 抗性蓝白斑筛选袁挑
取阳性菌落提取质粒遥 经 孕悦砸 鉴定后送上海生工
生物技术有限公司测序遥
根据克隆的 郧杂栽 基因全长袁利用 晕悦月陨 的 韵砸云
云蚤灶凿藻则 在线工具查找该基因开放阅读框曰用 孕则燥贼鄄
孕葬则葬皂渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎藻遭援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 责则燥贼责葬则葬皂 辕 冤分析谷
胱甘肽鄄杂鄄转移酶基因所编码氨基酸序列的物理性
质曰栽酝匀酝酝 圆郾 园 分析其跨膜结构袁杂蚤早灶葬造孕 源郾 员 进行
信号肽分析曰用 悦造怎泽贼葬造 载 员郾 愿猿 进行多序列比对曰利
用 酝藻早葬 缘郾 园 软件以 晕鄄允 算法袁重复抽样 员 园园园 次来
构建系统进化树遥
员郾 圆郾 猿 原核表达载体的构建及鉴定
根据目的序列的完整编码序列袁设计原核表
达引物 孕员院缘忆鄄悦郧郧粤栽悦悦粤栽郧悦悦郧粤栽悦郧粤悦栽栽栽栽粤悦鄄
猿忆曰 孕圆院 缘忆鄄悦郧粤郧悦栽悦栽栽栽悦栽栽郧郧栽郧粤郧郧栽栽郧郧悦鄄猿忆袁
下划线分别表示 月葬皂匀 陨 和 杂葬糟 陨 酶切位点遥 以阳
性克隆质粒为模板袁扩增并回收目的基因袁将 孕悦砸
产物连接 责郧酝鄄栽构建带有相应酶切位点的重组质
粒 责郧酝鄄砸责郧杂栽遥 将重组质粒 责郧酝鄄砸责郧杂栽 和 责耘栽鄄
猿圆葬质粒分别用 杂葬糟 陨 和 月葬皂匀 陨 进行双酶切并回
收纯化酶切片段袁用 栽源 阅晕粤 连接酶 员远 益连接过
夜袁转化大肠杆菌 阅匀缘琢袁得到重组融合表达质粒
责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽遥 菌液 孕悦砸 筛选阳性菌株袁并抽提
质粒进行双酶切鉴定袁将酶切鉴定正确的重组质
粒测序遥
员郾 圆郾 源 重组蛋白的诱导表达
使用热激法将重组质粒 责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽 转化大
肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤感受态细胞袁挑取单菌落接种于
缘 皂蕴 蕴月 液体培养基中袁猿苑 益尧圆园园 则 辕 皂蚤灶 培养 员圆 澡遥
取 圆 皂蕴菌液接种于 圆园园 皂蕴 蕴月 液体培养基中袁摇菌
至 韵阅远园园为 园郾 远 左右袁加入终浓度为 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴陨孕栽郧诱导目的蛋白表达遥 猿苑 益尧圆园园 则 辕 皂蚤灶 分别诱
导表达 员尧圆尧猿尧源 和 缘 澡遥 收集菌液袁员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶 离
心 缘 皂蚤灶袁去上清遥 加入 凿凿匀圆韵 员园园 滋蕴尧缘 伊 杂阅杂 圆缘滋蕴凝胶加样缓冲液袁振荡悬浮菌体袁煮沸 员园 皂蚤灶遥 源
益尧员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶遥 取 圆园 滋蕴上清上样袁进
行 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳检测遥
员郾 圆郾 缘 重组蛋白可溶性检测及宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早检测
为检测重组蛋白的可溶性袁将诱导表达后的大
肠杆菌菌液在冰水浴中超声波破碎菌体袁超声 猿园 泽袁
间歇 猿园 泽袁共 员 澡遥 超声结束后将悬浮液于 源 益尧
员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园皂蚤灶袁分别收集上清和沉淀袁经处
理后进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测遥
诱导后的菌液经 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳鉴定后袁电转
移至 孕灾阅云膜上袁用含 缘豫脱脂奶粉的封闭液室温
封闭 猿 澡袁加入 远 伊 匀蚤泽 单克隆抗体室温反应 员 澡袁用
栽月杂栽 洗膜 缘 次袁每次 圆 皂蚤灶袁用辣根过氧化物酶
渊澡燥则泽藻则葬凿蚤泽澡 责藻则燥曾蚤凿葬泽藻袁匀砸孕冤标记的羊抗鼠 陨早郧 作
为二抗袁室温反应 员 澡袁栽月杂栽洗膜 缘 次后用化学发光
法显色袁拍照保存遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的克隆及序列分析
根据豌豆蚜 郧杂栽基因序列袁对高度同源的禾谷
缢管蚜 耘杂栽 序列进行拼接袁获得 员 个含有完整编码
框的禾谷缢管蚜 郧杂栽基因的 糟阅晕粤序列遥 根据拼接
序列设计引物袁采用 砸栽鄄孕悦砸 方法扩增获得一个与
预期片段大小相符的条带袁将其命名为 砸责郧杂栽员袁测
序结果显示该序列长 苑源园 遭责袁将此序列提交到 郧藻灶鄄
月葬灶噪袁获得登录号院运孕员怨圆愿缘园遥 根据 晕悦月陨 的 韵砸云
云蚤灶凿藻则分析发现袁该序列包含一个 远缘员 遭责 开放阅读
框袁编码 圆员远 个氨基酸袁起始密码子为 粤栽郧袁终止密
码子为 栽粤粤渊图 员冤遥
通过 孕则燥贼责葬则葬皂分析该基因编码蛋白的理化性
质袁推测 砸责郧杂栽员 蛋白分子式为 悦员员园远匀员苑园怨晕圆苑猿韵猿员猿 杂苑袁
蛋白分子量为 圆源郾 园远 噪阅袁等电点为 远郾 圆园曰晕鄄端氨基
酸为蛋氨酸渊阅蕴鄄皂藻贼澡蚤燥灶蚤灶藻袁 酝冤袁半衰期大约 猿园 澡袁
不稳定系数为 圆怨郾 远缘袁蛋白质性质稳定渊标准院源园 以
下为稳定蛋白冤遥 负电荷总残基数渊粤泽责 垣 郧造怎冤为
圆缘袁正电荷总残基数渊粤则早 垣 蕴赠泽冤为 圆猿遥 亲水性平均
数为 原 园郾 园缘远袁预测该蛋白为亲水性蛋白袁其脂肪指
数为 怨猿郾 怨愿遥 对 砸责郧杂栽员 的氨基酸序列进行分析袁没
有跨膜结构域袁推测该蛋白不是跨膜蛋白遥 杂蚤早灶葬造孕
源郾 员 分析该基因没有信号肽袁是非分泌蛋白遥
圆郾 圆摇 砸责郧杂栽员 蛋白的二级结构域活性位点分析
将 砸责郧杂栽员 与其它昆虫 阅藻贼造葬 成员的蛋白质二
级结构以及活性位点进行比对袁砸责郧杂栽员 与 阅藻造贼葬 家
族的其它 郧杂栽泽一样袁包含 晕 末端和 悦 末端 圆 个保
守结构域遥 晕末端由 茁鄄琢鄄茁鄄琢鄄茁鄄茁鄄琢 苑 个结构基序
组成袁而 悦末端由 缘 个 琢 螺旋构成遥 琢 螺旋和 茁 折
叠内部没有插入和缺失渊图 圆冤遥
苑远远远 期 罗摇 晨等院 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的克隆尧序列分析及原核表达
图 员 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
云蚤早援 员 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶凿 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 砸责郧杂栽员 早藻灶藻 燥枣 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤
郧杂栽鄄云和 郧杂栽鄄砸为 孕悦砸扩增引物遥 鄢表示终止密码子遥 郧杂栽鄄云 葬灶凿 郧杂栽鄄砸 葬则藻 责则蚤皂藻则泽 枣燥则 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 泽贼燥责
糟燥凿燥灶 蚤泽 皂葬则噪藻凿 憎蚤贼澡 葬灶 葬泽贼藻则蚤泽噪援 摇
图 圆 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 蛋白与其它昆虫 郧杂栽泽的多序列比对
云蚤早援 圆 粤皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 砸责郧杂栽员 枣则燥皂 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤 葬灶凿 郧杂栽泽 枣则燥皂 燥贼澡藻则 蚤灶泽藻糟贼泽
郧杂栽泽序列的来源及 郧藻灶月葬灶噪 登录号分别为院 粤早郧杂栽员鄄远院 冈比亚按蚊袁 匝怨猿员员猿曰 粤凿郧杂栽阅员鄄源院 大劣按蚊袁 匝怨郧晕远园曰
粤凿郧杂栽阅员鄄猿院 大劣按蚊袁 匝怨郧晕耘怨曰 蕴糟郧杂栽院 铜绿蝇袁 孕源圆愿远园遥 黑色阴影表示相同氨基酸袁灰色阴影表示相似氨基酸遥 鄢尧郧和 匀
分别表示催化的丝氨酸残基尧谷胱甘肽结合位点渊郧鄄泽蚤贼藻冤和疏水位点渊匀鄄泽蚤贼藻冤遥 琢尧琢螺旋尧茁尧茁折叠尧二级结构元件和保守位点
参照冈比亚按蚊 粤早郧杂栽阅员鄄远进行标注遥 栽澡藻 燥则蚤早蚤灶 燥枣 郧杂栽泽 葬灶凿 贼澡藻蚤则 郧藻灶月葬灶噪 葬糟糟藻泽泽蚤燥灶 灶怎皂遭藻则泽院 粤早郧杂栽员鄄远院 粤灶燥责澡藻造藻泽 早葬皂遭蚤葬藻袁
匝怨猿员员猿曰 粤凿郧杂栽阅员鄄源院 粤灶燥责澡藻造藻泽 凿蚤则怎泽袁 匝怨郧晕远园曰 粤凿郧杂栽阅员鄄猿院 粤援 凿蚤则怎泽袁 匝怨郧晕耘怨曰 蕴糟郧杂栽院 蕴怎糟蚤造蚤葬 糟怎责则蚤灶葬袁孕源圆愿远园援 栽澡藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼泽
葬则藻 泽澡葬凿藻凿 怎泽蚤灶早 月燥曾泽澡葬凿藻 蚤灶 泽怎糟澡 葬 憎葬赠 贼澡葬贼 蚤凿藻灶贼蚤糟葬造 则藻泽蚤凿怎藻泽 葬则藻 泽澡葬凿藻凿 蚤灶 遭造葬糟噪 葬灶凿 糟燥灶泽藻则增藻凿 燥灶藻泽 蚤灶 早则葬赠援 栽澡藻 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 则藻泽蚤凿怎藻
杂藻则 蚤泽 皂葬则噪藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 葬泽贼藻则蚤泽噪援 砸藻泽蚤凿怎藻泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 遭蚤灶凿蚤灶早 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 渊郧鄄泽蚤贼藻冤 葬则藻 皂葬则噪藻凿 憎蚤贼澡 郧 葬灶凿 贼澡燥泽藻 枣燥则皂蚤灶早 贼澡藻 澡赠凿则燥责澡燥遭蚤糟
泽蚤贼藻 渊匀鄄泽蚤贼藻冤 憎蚤贼澡 匀援 栽澡藻 泽藻糟燥灶凿葬则赠鄄泽贼则怎糟贼怎则藻 藻造藻皂藻灶贼泽 葬则藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻凿 葬灶凿 造葬遭藻造藻凿 渊琢鄄澡藻造蚤糟藻泽 泽贼葬则贼蚤灶早 憎蚤贼澡 琢 葬灶凿 茁鄄泽贼则葬灶凿泽 憎蚤贼澡 茁冤援
栽澡藻 造葬遭藻造蚤灶早 泽糟澡藻皂藻 枣燥则 泽藻糟燥灶凿葬则赠鄄泽贼则怎糟贼怎则藻 藻造藻皂藻灶贼泽 则藻枣藻则泽 贼燥 粤早郧杂栽阅员鄄远援 摇
愿远远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
圆郾 猿 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 蛋白系统发育树的构建
图 猿 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 蛋白与其它相关物种 郧杂栽蛋白的系统发育树
云蚤早援 猿 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻 燥枣 砸澡燥责葬造燥泽蚤责澡怎皂 责葬凿蚤 葬灶凿 燥贼澡藻则 泽责藻糟蚤藻泽 遭葬泽藻凿 燥灶 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 郧杂栽泽摇
为了进一步明确 砸责郧杂栽员 与其它昆虫 郧杂栽蛋白
之间的进化关系袁在 郧藻灶月葬灶噪 中对 郧杂栽 基因的氨基
酸序列进行 月蕴粤杂栽相似性搜索袁搜集了来自冈比亚
按蚊 粤灶燥责澡藻造藻泽 早葬皂遭蚤葬藻尧大劣按蚊 粤灶燥责澡藻造藻泽 凿蚤则怎泽尧黑
腹果蝇 阅则燥泽燥责澡蚤造葬 皂藻造葬灶燥早葬泽贼藻则尧豌豆蚜 粤糟赠则贼澡燥泽蚤责澡燥灶
责蚤泽怎皂尧家蚕 月燥皂遭赠曾 皂燥则蚤尧白背飞虱 杂燥早葬贼藻造造葬 枣怎则糟蚤枣鄄
藻则葬尧隐尾蠊 悦则赠责贼燥糟藻则糟怎泽 责怎灶糟贼怎造葬贼怎泽尧柑橘凤蝶 孕葬责蚤造蚤燥
曾怎贼澡怎泽尧西方蜜蜂 粤责蚤泽 皂藻造造蚤枣藻则葬尧小菜蛾 孕造怎贼藻造造葬 曾赠造燥泽鄄
贼藻造造葬尧二斑叶螨 栽藻贼则葬灶赠糟澡怎泽 怎则贼蚤糟葬藻 等物种 阅藻造贼葬 家族
的 郧杂栽基因氨基酸序列袁并结合禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员
基因的氨基酸序列袁利用 酝藻早葬 缘郾 园 软件构建 郧杂栽蛋
白的系统发育树袁结果表明该蛋白与豌豆蚜 阅藻造贼葬
家族 郧杂栽阅员 蛋白的亲缘关系最近渊图 猿冤遥
圆郾 源 砸责郧杂栽员 基因原核表达载体的构建及鉴定
利用 月葬皂匀 陨和 杂葬糟 陨双酶切 责耘栽鄄猿圆葬空载体和
责郧酝鄄砸责郧杂栽载体袁分别获得含有相同酶切位点的线
性化 责耘栽鄄猿圆葬空载体和目的基因片段袁经 栽源 阅晕粤
连接酶 员远 益连接过夜袁转化大肠杆菌 阅匀缘琢袁获得
责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽原核表达载体遥 对重组质粒进行双
酶切鉴定袁结果显示切出一条长约 苑园园 遭责 左右的目
的基因片段及 缘 怨园园 遭责 左右的 责耘栽鄄猿圆葬 序列袁将阳
性克隆测序袁序列比对结果正确袁表明 责耘栽猿圆葬鄄
砸责郧杂栽原核表达载体已经构建成功遥 将酶切鉴定
怨远远远 期 罗摇 晨等院 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的克隆尧序列分析及原核表达
正确的质粒转化到大肠杆菌表达菌株 月蕴圆员渊阅耘猿冤
中袁进行蛋白诱导表达遥
圆郾 缘 砸责郧杂栽员 基因重组蛋白的表达
与对照相比袁责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽 转化菌经 陨孕栽郧 诱
导后袁在大约 源缘 噪阅处出现了特异的融合蛋白渊目的
蛋白约 圆源 噪阅袁标签蛋白 圆园郾 源 噪阅冤袁并且随诱导时间
增加其蛋白含量逐渐增加袁表明重组质粒 责耘栽猿圆鄄
砸责郧杂栽在大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤中成功诱导表达了
砸责郧杂栽员 蛋白渊图 源冤遥 将诱导后的含有重组质粒的
大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤超声破碎后袁经 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电
泳检测上清和沉淀袁结果表明目的蛋白在上清和包
涵体中均有表达渊图 缘冤遥 为了进一步鉴定表达产物
是否为含有 远 伊 匀蚤泽表达标签的融合蛋白袁对表达产
物进行宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早检测袁结果表明经 陨孕栽郧诱导
产生的约 源缘 噪阅蛋白与 远 伊 匀蚤泽 抗体发生很强的交
叉反应袁表明融合蛋白得到表达渊图 远冤遥
摇 图 源 砸责郧杂栽员 基因融合蛋白诱导表达的
杂阅杂鄄孕粤郧耘结果
云蚤早援 源 杂阅杂鄄孕粤郧耘 燥枣 蚤灶凿怎糟藻凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 砸责郧杂栽员
早藻灶藻 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶
酝院 蛋白质分子质量标准曰 员院 未加 陨孕栽郧 诱导的空
载体对照曰 圆院 加 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴 陨孕栽郧诱导 源 澡的空载体对
照曰 猿院 未加 陨孕栽郧诱导的重组菌曰 源 耀 愿院 加 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴
陨孕栽郧分别诱导 员尧圆尧猿尧源 和 缘 澡 的重组菌遥 酝院 孕则燥贼藻蚤灶
皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则曰 员院 贼澡藻 糟燥灶贼则燥造 憎蚤贼澡燥怎贼 陨孕栽郧 蚤灶鄄
凿怎糟贼蚤燥灶曰 圆院 贼澡藻 糟燥灶贼则燥造 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴 陨孕栽郧 枣燥则
源 澡曰 猿院 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 泽葬皂责造藻 憎蚤贼澡燥怎贼 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶曰 源
原 愿院 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 泽葬皂责造藻 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 园郾 缘 皂皂燥造 辕 蕴
陨孕栽郧 枣燥则 员袁 圆袁 猿袁 源 葬灶凿 缘 澡袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
摇
猿 讨论
昆虫对杀虫剂产生抗性的机制主要包括表皮穿
透率下降尧作用靶标敏感性降低和解毒代谢作用增
强 猿 个方面袁其中解毒代谢作用增强是昆虫抗药性
的主要机制咱员愿暂 遥 谷胱甘肽鄄杂鄄转移酶是由多基因家
族编码的多功能蛋白酶袁能够催化谷胱甘肽与有毒
图 缘 责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽重组蛋白的可溶性检测
云蚤早援 缘 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 泽燥造怎遭造藻 责耘栽猿圆鄄砸责郧杂栽
责则燥贼藻蚤灶 葬枣贼藻则 怎造贼则葬泽燥灶蚤糟葬贼蚤燥灶
酝院 蛋白质分子质量标准曰 员院 超声破碎后的上清曰 圆院
包涵体遥 酝院 孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则曰 员院 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼
葬枣贼藻则 怎造贼则葬泽燥灶蚤糟葬贼蚤燥灶曰 圆院 蚤灶糟造怎泽蚤燥灶 遭燥凿赠援 摇
图 远 重组质粒 责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽表达产物的
宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早分析
云蚤早援 远 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 燥枣 藻曾责则藻泽泽藻凿 责则燥凿怎糟贼 燥枣 贼澡藻
则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽
酝院 蛋白质分子质量标准曰 员院 未诱导的重组质粒曰
圆院 诱导后的重组质粒遥 酝院 孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪鄄
藻则曰 员院 怎灶蚤灶凿怎糟藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽曰 圆院
蚤灶凿怎糟藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责耘栽猿圆葬鄄砸责郧杂栽援
摇
化学物结合袁产生易溶于水的复合物而排出体外曰对
多种有毒的内源性和外源性亲电物质解毒袁参与毒
素的分解代谢过程袁耘灶葬赠葬贼蚤 等咱员怨暂证明 郧杂栽 可作为
杀虫剂的 猿 大解毒代谢酶系之一遥 本研究根据豌豆
蚜的 郧杂栽 基因 糟阅晕粤 序列在禾谷缢管蚜 耘杂栽 数据
库中进行检索袁获得了多个 郧杂栽 同源序列袁并对这
些序列进行拼接袁通过 砸栽鄄孕悦砸 方法克隆得到禾谷
缢管蚜 郧杂栽基因序列袁该序列长 苑源园 遭责袁开放阅读框
远缘员 遭责袁编码 圆员远 个氨基酸遥 该基因编码的蛋白质
与豌豆蚜 阅藻造贼葬 家族的 郧杂栽 基因的亲缘关系最近袁
因此该基因属于昆虫特异性的 阅藻造贼葬 家族袁而 阅藻造贼葬
园苑远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
家族与昆虫杀虫剂抗性相关咱苑暂 袁在昆虫抗药性等逆
境中发挥着重要作用咱圆园暂 遥 目前已有 源 个 阅藻造贼葬 家族
的蛋白质晶体结构被解析咱缘袁 圆员 原 圆圆暂 袁而对于 郧杂栽活性
与昆虫抗药性关系的研究主要集中在生理生化和
皂砸晕粤两方面袁但有关禾谷缢管蚜报道尚少遥 小菜
蛾 孕造怎贼藻造造葬 曾赠造燥泽贼藻造造葬的 孕曾郧杂栽猿 基因编码的酶可以降
解有机磷杀虫剂袁其表达量增加与抗性有关咱圆猿暂 遥 家
蝇的 酝凿郧杂栽远粤基因在有机磷杀虫剂抗性品系中过
量表达咱圆源暂 遥 砸葬灶泽燥灶 等咱圆缘暂研究发现在冈比亚按蚊
粤灶燥责澡藻造藻泽 早葬皂遭蚤葬藻抗性品系中芋类 郧杂栽泽 葬早早泽贼猿圆圆 基
因过量表达 缘 倍袁表达的重组酶可以降解 阅栽栽遥 表
明昆虫 郧杂栽 活性与抗药性之间具有密切的关系遥
因此袁本课题下一步将采用实时荧光定量 孕悦砸方法
研究杀虫剂处理后禾谷缢管蚜体内 郧杂栽 基因的表
达水平遥
本研究构建了禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的重组
原核表达载体袁并将其转化到大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤
中袁通过 陨孕栽郧诱导成功表达出禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员
基因融合蛋白袁宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早 分析表明融合蛋白
表达正确袁而且随着诱导时间增加袁目的蛋白表达量
逐渐增加袁诱导表达 缘 澡时袁目的蛋白的表达量已能
满足下一步的蛋白纯化需求遥 真核生物基因的原核
表达受表达载体尧温度尧陨孕栽郧 浓度尧宿主菌尧诱导时
间等因素影响咱圆远暂 遥 本试验采用 责耘栽 大肠杆菌表达
系统进行原核表达袁该系统能与 栽葬早 连接进行融合
蛋白表达袁目的蛋白易于纯化袁并且具有操作方便尧
表达量大等优点咱圆苑暂 遥
综上所述袁本研究首次成功克隆了禾谷缢管蚜
砸责郧杂栽员 基因袁进行了相关的生物信息学分析袁构建
了原核表达载体袁并成功诱导表达出目的蛋白袁经
杂阅杂鄄孕粤郧耘和 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早 鉴定袁砸责郧杂栽员 蛋白得
到正确表达袁这为下一步制备单克隆抗体尧免疫荧光
定位 砸责郧杂栽员 在禾谷缢管蚜中的作用部位及其生理
功能奠定了基础袁同时也为研究禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员
的功能奠定了基础遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 杂澡藻藻澡葬灶 阅袁 酝藻葬凿藻 郧袁 云燥造藻赠 灾 酝袁 藻贼 葬造援 杂贼则怎糟贼怎则藻袁 枣怎灶糟贼蚤燥灶
葬灶凿 藻增燥造怎贼蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽院 蚤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 枣燥则 糟造葬泽泽蚤鄄
枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 灶燥灶鄄皂葬皂皂葬造蚤葬灶 皂藻皂遭藻则泽 燥枣 葬灶 葬灶糟蚤藻灶贼 藻灶扎赠皂藻 泽怎责藻则鄄
枣葬皂蚤造赠援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造袁 圆园园员袁 猿远园渊员冤院 员 原 员远
咱圆暂 酝燥贼燥赠葬皂葬 晕袁 阅葬怎贼藻则皂葬灶 宰 悦援 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽院
贼澡藻蚤则 则燥造藻 蚤灶 贼澡藻 皂藻贼葬遭燥造蚤泽皂 燥枣 燥则早葬灶燥责澡燥泽责澡燥则怎泽 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽援
砸藻增蚤藻憎 蚤灶 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 栽燥曾蚤糟燥造燥早赠袁 员怨愿园袁 圆院 源怨 原 远怨
咱猿暂 悦造葬则噪 粤 郧袁 杂澡葬皂葬葬灶 晕 粤援 耘增蚤凿藻灶糟藻 贼澡葬贼 阅阅栽鄄凿藻澡赠凿则燥糟澡造燥则蚤鄄
灶葬泽藻 枣则燥皂 贼澡藻 澡燥怎泽藻 枣造赠 蚤泽 葬 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻援 孕藻泽贼蚤糟蚤凿藻
月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨愿源袁 圆圆渊猿冤院 圆源怨 原 圆远员
咱源暂 灾燥灶贼葬泽 允 郧袁 杂皂葬造造 郧 允袁 匀藻皂蚤灶早憎葬赠 允援 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬鄄
泽藻泽 葬泽 葬灶贼蚤燥曾蚤凿葬灶贼 凿藻枣藻灶糟藻 葬早藻灶贼泽 糟燥灶枣藻则 责赠则藻贼澡则燥蚤凿 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶
晕蚤造葬责葬则增葬贼葬 造怎早藻灶泽援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造袁 圆园园员袁 猿缘苑渊员冤院 远缘 原
苑圆
咱缘暂 悦澡藻灶 蕴袁 匀葬造造 孕 砸袁 在澡燥怎 载 耘袁 藻贼 葬造援 杂贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 葬灶 蚤灶泽藻糟贼 凿藻造鄄
贼葬鄄糟造葬泽泽 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 枣则燥皂 葬 阅阅栽鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 燥枣
贼澡藻 皂葬造葬则蚤葬 增藻糟贼燥则 粤灶燥责澡藻造藻泽 早葬皂遭蚤葬藻援 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 悦则赠泽贼葬造造燥早则葬鄄
责澡赠袁 圆园园源袁 缘怨渊员圆冤院 圆圆员员 原 圆圆员苑
咱远暂 运藻贼贼藻则皂葬灶 粤 允袁 杂葬蚤泽葬憎葬灶早 悦袁 宰燥灶早泽葬灶贼蚤糟澡燥灶 允援 陨灶泽藻糟贼 早造怎贼葬贼澡蚤鄄
燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽援 阅则怎早 酝藻贼葬遭燥造蚤泽皂 砸藻增蚤藻憎泽袁 圆园员员袁 源猿 渊 圆 冤院
圆缘猿 原 圆远缘
咱苑暂 悦澡藻造增葬灶葬赠葬早葬皂 郧袁 孕葬则噪藻则 酝 宰袁 月燥葬则凿 孕 郧援 云造赠 枣蚤泽澡蚤灶早 枣燥则
郧杂栽泽院 葬 怎灶蚤枣蚤藻凿 灶燥皂藻灶糟造葬贼怎则藻 枣燥则 皂葬皂皂葬造蚤葬灶 葬灶凿 蚤灶泽藻糟贼 早造怎贼葬鄄
贼澡蚤燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽援 悦澡藻皂蚤糟燥鄄月蚤燥造燥早蚤糟葬造 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆园员员袁
员猿猿院 圆缘远 原 圆远园
咱愿暂 鲁艳辉袁杨婷袁高希武援 禾谷缢管蚜和麦长管蚜玻璃管药膜
法敏感毒力基线的建立援 昆虫学报袁 圆园园怨袁 缘圆渊员冤院 缘圆 原 缘愿
咱怨暂 运怎 悦 悦袁 悦澡蚤葬灶早 云 酝袁 匀泽蚤灶 悦 再袁 藻贼 葬造援 郧造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻
蚤泽燥扎赠皂藻泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 燥枣 凿蚤葬皂燥灶凿遭葬糟噪 皂燥贼澡
造葬则增葬藻援 孕藻泽贼蚤糟蚤凿藻 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨源袁 缘园渊猿冤院
员怨员 原 员怨苑
咱员园暂 孕则葬责葬灶贼澡葬凿葬则葬 蕴袁 孕则燥皂贼藻贼 晕袁 运燥燥贼贼葬贼澡藻责 杂袁 藻贼 葬造援 陨泽燥藻灶扎赠皂藻泽
燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 枣则燥皂 贼澡藻 皂燥泽择怎蚤贼燥 粤灶燥责澡藻造藻泽 凿蚤则怎泽
泽责藻糟蚤藻泽 月院 贼澡藻 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶袁 责葬则贼蚤葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 蚤灶贼藻则鄄
葬糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 增葬则蚤燥怎泽 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽援 陨灶泽藻糟贼 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 酝燥鄄
造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园园袁 猿园渊缘冤院 猿怨缘 原 源园猿
咱员员暂 砸藻蚤凿赠 郧 云袁 砸燥泽藻 匀 粤袁 灾蚤泽藻贼泽燥灶 杂袁 藻贼 葬造援 陨灶糟则藻葬泽藻凿 早造怎贼葬贼澡蚤鄄
燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬灶凿 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 糟燥灶贼藻灶贼 蚤灶 葬灶 蚤灶泽藻糟贼蚤鄄
糟蚤凿藻鄄则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽贼则葬蚤灶 燥枣 栽则蚤遭燥造蚤怎皂 糟葬泽贼葬灶藻怎皂 渊匀藻则遭泽贼冤援 孕藻泽贼蚤鄄
糟蚤凿藻 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员怨怨园袁 猿远渊猿冤院 圆远怨 原 圆苑远
咱员圆暂 蕴葬早葬凿蚤糟 蕴袁 悦怎葬灶赠 粤袁 月藻则早佴 允 月袁 藻贼 葬造援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 责葬则贼蚤葬造
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 枣则燥皂 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻鄄
则藻泽蚤泽贼葬灶贼 葬灶凿 造蚤灶凿葬灶藻鄄蚤灶凿怎糟藻凿 泽怎泽糟藻责贼蚤遭造藻 杂责燥凿燥责贼藻则葬 造蚤贼贼燥则葬造蚤泽
渊月燥蚤泽凿援 冤 造葬则增葬藻援 陨灶泽藻糟贼 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁
员怨怨猿袁 圆猿渊源冤院 源远苑 原 源苑源
咱员猿暂 云藻灶早 匝袁 阅葬增藻赠 运 郧袁 孕葬灶早 粤 杂 阅袁 藻贼 葬造援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼葬造 藻曾鄄
责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 泽贼则藻泽泽 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 蚤灶 贼澡藻
泽责则怎糟藻 遭怎凿憎燥则皂袁 悦澡燥则蚤泽贼燥灶藻怎则葬 枣怎皂蚤枣藻则葬灶葬援 允燥怎则灶葬造 燥枣 陨灶泽藻糟贼
孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园员袁 源苑渊员冤院 员 原 员园
咱员源暂 栽葬灶早 粤 匀袁 栽怎 悦 孕援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 阅则燥泽燥责澡蚤造葬
早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 阅员 葬灶凿 阅圆员援 栽澡藻 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤鄄
糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨源袁 圆远怨渊源缘冤院 圆苑愿苑远 原 圆苑愿愿源
咱员缘暂 匀藻皂蚤灶早憎葬赠 允袁 酝蚤赠葬皂燥贼燥 允袁 匀藻则葬贼澡 孕 砸 允援 粤 责燥泽泽蚤遭造藻 灶燥增藻造
造蚤灶噪 遭藻贼憎藻藻灶 燥则早葬灶责澡燥泽责澡燥则怎泽 葬灶凿 阅阅栽 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
早藻灶藻泽 蚤灶 粤灶燥责澡藻造藻泽院 泽怎责责燥则贼蚤灶早 藻增蚤凿藻灶糟藻 枣则燥皂 枣藻灶蚤贼则燥贼澡蚤燥灶 皂藻鄄
贼葬遭燥造蚤泽皂 泽贼怎凿蚤藻泽援 孕藻泽贼蚤糟蚤凿藻 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁
员怨怨员袁 猿怨渊员冤院 源怨 原 缘远
咱员远暂 砸葬灶泽燥灶 匀袁 砸燥泽泽蚤贼藻则 蕴袁 韵则贼则造造蚤 云袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 灶燥鄄
员苑远远 期 罗摇 晨等院 禾谷缢管蚜 砸责郧杂栽员 基因的克隆尧序列分析及原核表达
增藻造 糟造葬泽泽 燥枣 蚤灶泽藻糟贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 杂鄄贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 则藻泽蚤泽贼鄄
葬灶糟藻 贼燥 阅阅栽 蚤灶 贼澡藻 皂葬造葬则蚤葬 增藻糟贼燥则 粤灶燥责澡藻造藻泽 早葬皂遭蚤葬藻援 月蚤燥鄄
糟澡藻皂蚤糟葬造 允燥怎则灶葬造袁 圆园园员袁 猿缘怨渊圆冤院 圆怨缘 原 猿园源
咱员苑暂 吕娟娟袁 王进军袁 张寿芳袁 等援 二斑叶螨抗螺螨酯品系
郧杂栽基因的克隆与表达分析援 昆虫学报袁 圆园员猿袁 缘远 渊源冤院
源猿愿 原 源源缘
咱员愿暂 匀藻皂蚤灶早憎葬赠 允袁 匀葬憎噪藻泽 晕 允袁 酝糟悦葬则则燥造造 蕴袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 皂燥造藻糟怎鄄
造葬则 遭葬泽蚤泽 燥枣 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 皂燥泽择怎蚤贼燥藻泽援 陨灶泽藻糟贼 月蚤燥鄄
糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园源袁 猿源渊苑冤院 远缘猿 原 远远缘
咱员怨暂 耘灶葬赠葬贼蚤 粤 粤袁 砸葬灶泽燥灶 匀袁 匀藻皂蚤灶早憎葬赠 允援 陨灶泽藻糟贼 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻
贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 葬灶凿 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻援 陨灶泽藻糟贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥鄄
早赠袁 圆园园缘袁 员源渊员冤院 猿 原 愿
咱圆园暂 蕴怎皂躁怎葬灶 晕袁 砸葬躁葬贼蚤造藻噪葬 杂袁 悦澡葬灶早泽燥皂 阅袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 则燥造藻 燥枣 贼澡藻
粤藻凿藻泽 葬藻早赠责贼蚤 耘责泽蚤造燥灶 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻泽 蚤灶 糟燥灶枣藻则则蚤灶早 则藻鄄
泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 阅阅栽 葬灶凿 责赠则藻贼澡则燥蚤凿 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽援 陨灶泽藻糟贼 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽鄄
贼则赠 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 圆园员员袁 源员渊猿冤院 圆园猿 原 圆园怨
咱圆员暂 宰蚤造糟藻 酝 悦袁 月燥葬则凿 孕 郧袁 云藻蚤造 杂 悦袁 藻贼 葬造援 悦则赠泽贼葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 葬
贼澡藻贼葬鄄糟造葬泽泽 早造怎贼葬贼澡蚤燥灶藻 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻援 栽澡藻 耘酝月韵 允燥怎则灶葬造袁 员怨怨缘袁
员源渊员园冤院 圆员猿猿 原 圆员源猿
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