全 文 ：植物保护学报 !"#$%&"()&%*)$"*+,*-"%! ./01! 2."2#$115 41E: 678$ 0/90:3/.;<=,%>-=?@ABCA=./019/29/0.
基金项目$ 国家公益性行业"农业#科研专项"./0./:/5E#!重庆市自然科学基金",G*,./00"Q6!f./0.T0/0!Q6!f./02F//0#
!通讯作者"F#*B"$("$,"$+GH"%I+%,+#! JKL&-$ ?B"%M&%N,$-,=,% 收稿日期$ ./02 4/5 4/:
尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性
及 !MHD@!检测
陈洪明
0O王雪峰0O周O彦0O周常勇0O郭O俊.O李中安0!
"0=西南大学;中国农业科学院柑橘研究所! 重庆 2//50.
.=云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所! 保山 E53/.1#
摘要! 近年我国云南瑞丽市的一果园尤里克柠檬上出现一种引起叶片皱缩反卷或呈船形!叶背水
浸状侧脉脉明黄化的柑橘新病害" 为明确该病害的病原及其生物学特性!通过田间观察病样接
种电镜观察!并基于柑橘黄脉病毒$1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30 B/.#*!TcgTg&外壳蛋白基因设计引
物对病样进行ZYK)TZ检测" 结果表明!该病是一种嫁接传染性病害!能侵染柠檬和酸橙品种且症
状明显!并能摩擦接种到辣椒和豇豆等草本植物" 该病发病最适温度为 03 .^2p" 春梢嫩叶症状
表现明显!夏梢和秋梢基本不表现症状!而晚秋梢也表现出较春梢稍弱的典型症状" 引致该病的病
毒为$0: 0^1&%Lu$2// 0^ ///&%L大小的联合丝状病毒" ZYK)TZ扩增产物为 E02 AH!且其与
TcgTg外壳蛋白序列相似性达 D5e以上!表明该病害是由 TcgTg引起的柑橘黄脉病!并初步建
立了该病的ZYK)TZ检测技术"
关键词! 柠檬# 柑橘黄脉病# 生物学特性# 嫁接传播# ZYK)TZ
L+.B.A+&$B&$%$&,"%+U$,+.*$*(!MHD@!(","&,+.*./$ *"5(+#"$#"./G:%"V$ B"-.*
TB+% X"%ML-%M0O]&%MQ#+(+%M0O_B"# c&%0O_B"# TB&%MS"%M0OR#"!#%.OP-_B"%M&%0!
"0=T-*$#GZ+G+&$,B 8%G*-*#*+! ["#*B@+G*U%-V+$G-*S;TB-%+G+F,&I+LS"(FM$-,#*#$&[,-+%,+G! TB"%Mh-%M2//50.! TB-%& .=8%G*-*#*+"(Y$"H-,&&%I [#A*$"H-,&T&GB T$"HG! c#%%&% F,&I+LS
"(FM$-,#*#$&[,-+%,+G! W&"GB&% E53/.1! c#%%&% )$"V-%,+! TB-%&# 12#,%$&,$F%+@I-G+&G++H-I+L-,"% J#$+>&+L"% "1/$.#*"/9)3 "P=# W#$L=(=# @&GI-G,"V+$+I -% &% "$,B&$I "(Z#--T-*S-% c#%%&% )$"V-%,+=YB+I-G+&G+,&#G+I *SH-,&GSLH*"LG! -%,#I-%M+&V+
,$-%>+"$,#$K#H! &*+$&V+-% S+"@-%M&%I ,+&$-%M&M&-%G*-MB*! &%I @&*+$KG"&>+I &HH+&$&%,+@+$+
&G"G++% "% *B+&I&C-&G#$(&,+"(+&V+G=Y"I+*+$L-%+*B+,&#G&&M+%*&%I A-""M-,&(+&*#$+G"(*B+ I-G+&G+! ,"LH$+B+%G-V+I+*+,*-"% @+$+,&$-+I "#*! -%,#I-%M(-+I G#$V+S! -%I-,&*"$H&%*-%",#&*-"%!
*$&%GL-GG-"% ++,*$"% L-,$"G,"HS"AG+$V&*-"% &%I ZYK)TZ&GG&SAS#G-%M*B+H$-L+$GI+G-M%+I ($"L,"&* H$"*+-% M+%+"(1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30 B/.#*"TcgTg# M+%"L+=YB+$+G#*GGB"@+I *B&**B-GI-G+&G+
,"#I A+*$&%GL-GG-A+-% +L"% &%I G"#$"$&%M+"1=&#.&3$/#9# ASM$&(*-%MK-%",#&*-"%! &%I -% ,&HG-,#L"1&,*/4#9<.#$%*4%3*# &%I ,"@H+&"S/03& #30#/4#"&$&# AS$#AA-%MK-%",#&*-"%=YB+"H*-L#L
*+LH+$&*#$+("$*B-GI-G+&G+I+V+"HL+%*@&G03 4.2p=[SLH*"LG@+$+"AV-"#GS"AG+$V+I "% S"#%M +&V+G"(GH$-%MGB""*G! A#*+GG"AV-"#G"% G#LL+$&%I &#*#L% GB""*G! &%I$+&HH+&$+I "% &*+&#*#L% GB""*G=\-&L+%*"#GV-$#GH&$*-,+G"(&A"#*"0: 401# %L u "2// 40 ///# %L-% @-I*B &%I +%M*B @+$+L+&G#$+I @-*B *$&%GL-GG-"% ++,*$"% L-,$"G,"HS=ZYK)TZH$"I#,+I &% +CH+,*+I A&%I "(E02 AH ($"L&GSLH*"L&*-,G&LH+G&%I %#,+"*-I+G+h#+%,+GGB&$+I D5e G-L-&$-*S@-*B *B+>%"@% $+M-"% "( TcgTg$+(+$+%,+M+%"L+=W&G+I "% *B+G+&GG&SG! *B+%+@I-G+&G+"% +L"% L-MB*A+,&#G+I AS TcgTg! &%I *B+ZYK)TZL+*B"I @&G$+-&AS+G*&A-GB+I ("$I+*+,*-"% "(*B-GI-G+&G+= 3"4 5.%(#$ +L"% 1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30 B/.#* A-""M-,&,B&$&,*+$-?&*-"% *$&%GL-GG-"% ZYK)TZ
OO柠檬1/$.#*"/9)3 是芸香科柑橘属常绿小乔木! 在柑橘产业中占有重要地位) 世界柠檬主产国包括 阿根廷(美国(土耳其(西班牙和意大利!./0/ 年!阿 根廷的柠檬产量达 0009: 万 *!占世界总产量的 .2e) 我国柠檬年产量约 1/ 万 *!其中云南省瑞丽 市柠檬年产量在 : 万 *左右!是当地重要的经济作 物"邓秀新等!./00#) .//D 年 : 月!云南农业科学 院瑞丽柠檬研究所"现为云南省农业科学院热带亚 热带经济作物研究所#与中国农业科学院柑橘研究 所联合调查柑橘黄龙病时!在瑞丽勐卯镇户南毛一 个环境相对隔离的 1 年生尤力克柠檬"枳砧#果园 中发现了一种新的柑橘病害!症状表现为春梢叶片 皱缩(反卷!侧脉黄化(脉明!叶背水浸状!部分嫩梢 叶片不带叶柄脱落此外!老熟叶片黄化症状消褪并 转绿!但叶片皱缩症状没有恢复!且对光看黄脉依然 明显) 该病在果园中的发生率已超过 0/e!对树势 和产量造成了较大的影响) 采用本中心建立的柑橘 病毒病分子快速检测方法"周彦等!.//1高艳玲 等!.//E#对其检测!柑橘衰退病(裂皮病(碎叶病( 温州蜜柑萎缩病(黄龙病等病害的检测结果均为阴 性) 初步判断该病是我国柑橘上的一种新发病害) 上述新病害的症状与国外报道的柑橘黄脉病极 为相似) 柑橘黄脉病最早于巴基斯坦柠檬和酸橙上 被发现!并认为是由柑橘杂色病毒"1/$.#*B&./%0&$/)3 B/.#*!Tgg#引起的!但JP8[F检测结果为阴性!因此 认为这是一种未知的病毒性病害 "T&*&$&+*&=!
0D33#) W"V€将其命名为柑橘黄化脉明病"T-*$#G S+"@V+-% ,+&$-%MI-G+&G+!TcgT6# "T&*&$&+*&=! 0DD:#!随后!印度"FB&@&*!0DD5#(土耳其"…%+M+! .//.#等地也相继发现了该病害) 柑橘黄脉病的病 原为柑橘黄化脉明病毒"1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30
B/.#*!TcgTg# "R$-L&I-` T&*&$&!0DDEY-LL+$` a+%M+!.///FGB&L-+*&=!.//:#) 该病主要危害 柠檬春梢!导致光合作用降低!树势减弱!产量大幅 下降!同时也对周边其它柑橘品种构成了严重威胁) P","%G"++*&="./0.#通过深度测序技术!获 得了柑橘黄化脉明病毒的全基因组!该病毒由 5 1.D 个核苷酸的正义ZbF链组成!与印度柑橘环斑病毒 "D3-/&3 4/$.#*./30*,)$B/.#*!8TZ[g#的序列同源性最 高达 52e"Z#G*-,-+*&=!.//.#!推测它们同属于柑 橘病毒属 ;&3-&./B/.#*) 目前!尚缺乏 TcgTg的分 子检测技术!仍以柠檬和酸橙作为指示植物进行鉴 定) 为此!本研究对发生于云南瑞丽地区的疑似柑 橘黄脉病"暂定为柠檬黄化脉明病#进行品种敏感 性试验(寄主范围(适宜发病温度条件和病毒微粒电 镜观察等生物学特性研究!进一步确认该病害与柑 橘黄脉病的关联性!并建立该病的 ZYK)TZ检测技 术!以期为该病的防控提供技术支撑) 6 材料与方法 686 材料 供试植物$采集云南瑞丽勐卯镇户南毛果园带
有典型柠檬黄化脉明病的枝条!将其病芽嫁接于无
病毒的卡里佐枳橙 1=*/3%3*/*u!)34/.#*$./<)"/&$& 砧
木!获得的柠檬黄化脉明病病株作为供试材料用于
接种观察的健康材料包括柠檬品种尤力克(费米耐
劳(坎贝尔(菲诺(维拉弗兰卡(维尔托(库特迪肯(莫
纳切罗!以及马叙葡萄柚 1=,&.&-/*/(德威特桔橙
1=.%$/4#"&$& u1=*/3%3*/*(铜水 5.K0 甜橙 1=*/3%37
*/*(实生台湾椪柑 1=,))3%3*/*(摩洛哥酸橙 1=
.&3$/#9(代代酸橙1=&#.&3$/#9(墨西哥莱檬 1=
.&3$/<)"/&!共 01 个柑橘品种用于摩擦接种的 D 种草 本植物包括黄瓜 1#4#9/**&$/B#*(苦瓜 ;)9).-/4&
42&.&3$/&(辣椒 1&,*/4#9 <.#$%*4%3*(茄子 +)"&3#9
9%")30%3&(番茄 8(4),%.*/4#9%*4#"%3#9(本氏烟 F/47
)$/&3& A%3$2&9/&3&(豇豆 S/03& #30#/4#"&$&(白芝麻 +%*&9#9/3-/4#9(苋色藜12%3),)-/#9&9&.&3$/4)").
所有供试材料均由中国农业科学院柑橘研究所脱毒
中心保存并提供)
试剂及仪器$ZbF-G")#G提取试剂盒(Ha603K Yg+,*"$和感受态细胞 6X1!购于宝生物工程"大
连#有限公司一步法ZYK)TZ扩增试剂盒等购于美
国8%V-*$"M+% 公司聚乙二醇"E///#和磷钨酸购于 美国 [-ML&公司其余试剂购于生工生物工程"上 311 植O物O保O护O学O报 2. 卷 海#股份有限公司) X51// 透射电镜!日本 X-*&,B- 公司) 687 方法 68786 嫁接传染性及最适发病温度的确定 嫁接传染性试验是将柠檬黄化脉明病病株的芽 和皮嫁接接种于无病毒的柠檬植株上!接种 ./ I 后 检查成活情况并及时补接!. 个月后对植株进行适 当修剪!观察新梢发病情况) 最适发病温度试验是 将接种柠檬黄化脉明病的尤力克柠檬和摩洛哥酸橙 植株各 1 株放置于 03 .^2p(.2 :^/p(:/ :^Ep( :E 2^/p共 2 个不同的温度环境下!成活 . 个月后 适当修剪!观察新梢发病情况以确定最适发病温度) 68787 品种敏感性试验 为研究该病在不同柑橘品种上症状的差异! 将柠檬黄化脉明病病株枝条的皮和芽嫁接接种于 无病毒的 01 个柑橘品种上!每株接种 0 芽和 . 块 皮!并以接种无病毒尤力克柠檬皮(芽为对照!接 种 ./ I后检查成活情况并及时补接!. 个月后对 植株进行适当修剪!置于 03 .^2p下观察新梢的 发病情况) 68789 病毒汁液摩擦接种 病毒汁液摩擦接种结合了杨家珍"0DE:#和余 继华等".//.#的方法!即采集表现典型柠檬黄化脉 明病症状的柠檬病叶!按 0 M量加入 1 倍体积 /9/1 af.X)72!HX59/!磨成匀浆!用海绵块蘸取少许金 刚砂在供试植株叶面!从叶基到叶尖方向!重复轻刷 0 .^ 次!再取病毒汁液!在健康的尤力克柠檬及豇 豆(辣椒(番茄等 D 种草本植物叶面上摩擦接种!各 接种 0/ 株) 对照汁液来自健康尤力克柠檬叶片) 接种后用无菌水洗去叶面上残留接种物残渣等!: I 后开始观察植株新抽发叶片发病情况!之后每天观 察 0 次!并记录结果) 6878; 病毒微粒电镜观察 参照R$-L&I-` T&*&$&"0DDE#方法!将 0 M表现 典型柠檬黄化脉明病的柠檬病叶在液氮中研磨后! 加入 . LP抽提缓冲液"/90 af:)72(0e b&.[7: 和 /9/. a J6YF! HX 592 #) 再用 Ee聚乙二醇 "E///#和 /90.1 ab&T沉淀病毒颗粒后!用 /90 a(HX592 抽提缓冲液 .// "P悬浮沉淀后即为 TcgTg的粗提液) 病毒粗提液用 .e磷钨酸进行 染色!置于透射电镜下观察) 6878< 病毒回接试验 病毒回接试验在接种 . 年后进行!采集接种了 柠檬黄化脉明病毒的铜水 5.K0 甜橙(实生台湾椪 柑(马叙葡萄柚(德威特桔橙(尤里克柠檬(墨西哥莱 檬(摩洛哥酸橙的枝条!取其芽和皮嫁接接种于无病 毒的摩洛哥酸橙植株上!每个品种分别接种 1 株!接 种 ./ I后检查成活情况并及时补接!嫁接 . 个月后 对植株进行适当修剪!观察新梢发病情况) 6878= 病原ZYK)TZ检测与克隆测序 根据P","%G"++*&="./0.#报道的 TcgTg基 因组外壳蛋白序列!利用)$-L+$)$+L-+$:9/ 软件设 计引物) 上游引物$YFTTRTFRTYFYTTFYYYTT下
游引物$RTFRFFFYTTTRFFTTFTYF) 采用 ZbF-K G")#G提取来自云南瑞丽以及本研究中接种后的 各柑橘品种幼嫩叶片的总ZbF进行ZYK)TZ扩增) 反应体系为$2.p!:/ L-%D2p!. L-%!D2p!:/ G!
11p!:/ G!5.p!2/ G!2/ 个循环5.p!1 L-% 延伸)
)TZ产物纯化后连接到 Ha60DKY载体!并转化大肠
杆菌 6X1!感受态细胞!阳性克隆子送北京华大基
因公司测序) 采用 a+M&19/ 软件进行序列的比对
分析"Y&L#$&+*&=!./00#) 7 结果与分析 786 嫁接传染性及最适发病温度 通过嫁接传染性试验!发现无病毒尤力克柠 檬和酸橙在接种柠檬黄化脉明病毒后!其抽发的 新梢叶片上!出现了与云南瑞丽田间尤力克柠檬 黄化脉明病相同的症状"图 0KF \^#!即侧脉及其 附近脉明黄化!对光观察更为明显"图 0KT#叶背 侧脉处水浸状!部分叶片皱缩(反卷或呈船形"图 0KJ(\#嫩叶症状表现明显!随着气温的升高!夏 梢基本不表现症状!而秋梢表现出较春梢稍弱的 典型症状!表明柠檬黄化脉明病是一种具有嫁接 传染性的柑橘病毒病) 该病显症程度与温度密切相关!03 .^2p是最 适宜发病温度!发病率均达 0//e!且具黄化(脉明( 反卷(皱缩(水浸状等典型症状) .2 :^/p时尤力克 柠檬和摩洛哥酸橙显症率分别为 E/e和 3/e) 随 着温度升高!显症率逐渐下降!:/ :^Ep时显症率均 为 2/e!且症状轻微) 温度超过 :Ep!新梢基本不 显示任何症状) 787 品种敏感性试验 在适宜发病温度 03 .^2p下!所有参试柠檬和 酸橙品种都表现出了柠檬黄化脉明病的典型症状! 且酸橙上尤为严重"表 0#) 德威特桔橙(马叙葡萄 柚和甜橙铜水 5.K0 上的症状较轻"图 0KR 8^#!墨西 哥莱檬(实生台湾椪柑接种后不表现任何症状) D112 期 陈洪明等$ 尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性及ZYK)TZ检测
图 6 不同柑橘品种接种柠檬黄化脉明病毒后的症状表现
\-M=0 YB+GSLH*"LG"(I-(+$+%*,-*$#GGH+,-+GM$&(*+I @-*B S+"@V+-% V-$#GK-%(+,*+I A&$>G&%I A#IG F$ 尤力克柠檬 W$健康对照 T 6^$ 代代酸橙 J \^$摩洛哥酸橙 R X^$ 德威特桔橙 8$铜水 5.K0 甜橙) F$ J#K
$+>&+L"% W$ B+&*BSG++I-%M T46$6&-I&-G"#$"$&%M+ J4\$ a"$",,"G"#$"$&%M+ R4X$6@++**&%M"$ 8$Y"%MGB#-5.K0= O 表 6 不同柑橘属植物接种柠檬黄化脉明病毒的症状表现 Y&A+0 YB+GSLH*"LG"(I-(+$+%*,-*$#GGH+,-+G-%",#&*+I @-*B S+"@V+-% V-$#GK-%(+,*+I A&$>G&%I A#IG 品种 g&$-+*S
发病株数;
接种株数
6-G+&G+I H&%*G;
-%",#&*+I H&%*G
发病率
8%,-I+%,+
"e#
症状 [SLH*"L
黄脉
c+"@
V+-%
脉明
g+-%K
,+&$-%M 反卷 T$-%>-%M&%I
@&$H-%M 水浸状 XSM$"HB&%"#G
尤力克柠檬1="/9)3 0J#$+>&- 0/;0/ 0// lll lll lll lll 费米耐劳柠檬1="/9)3 0\+LL-%+"- 0/;0/ 0// lll lll lll lll 坎贝尔柠檬1="/9)3 0TL+S+$- 0/;0/ 0// lll lll lll lll
菲诺柠檬1="/9)3 0\-%"- 0/;0/ 0// lll lll lll lll
维拉弗兰卡柠檬1="/9)3 0g-&($&%,&- 0/;0/ 0// lll lll lll lll 维尔托柠檬1="/9)3 0g+$%&- 0/;0/ 0// lll lll lll lll
库特迪肯柠檬1="/9)3 0f#*I->+%- 0/;0/ 0// lll lll lll lll
莫纳切罗柠檬1="/9)3 0a"%&,B+"- 0/;0/ 0// lll lll lll lll
马叙葡萄柚1=,&.&-/*/0a&$GB- .;0/ ./ 4 l 4 4 德威特桔橙1=.%$/4#"&$&u1=*/3%3*/*06@++*- 3;0/ 3/ lll lll 4 lll 铜水 5.K0甜橙 1=*/3%3*/*0Y"%MGB#-5.K0- :;0/ :/ 4 l 4 4 实生台湾椪柑1=,))3%3*/* /;0/ / 4 4 4 4 墨西哥莱檬1=&#.&3$/<)"/& /;0/ / 4 4 4 4
代代酸橙1=&#.&3$/#906&-I&-- 0/;0/ 0// lll lll lll lll 摩洛哥酸橙1=&#.&3$/#90a"$",""- 0/;0/ 0// lll lll lll lll OOlll$ 症状严重 ll$症状较严重 l$ 症状轻微 4$无症状) lll$ [+V+$+ll$ G+$-"#Gl$ L-I4$GSLH*"L+GG= /E1 植O物O保O护O学O报 2. 卷 789 汁液摩擦接种结果 通过汁液摩擦接种表明!柠檬黄化脉明病毒不 能通过汁液摩擦接种侵染健康柠檬植株!也不能侵 染葫芦科的黄瓜(苦瓜!茄科的茄子(番茄(本氏烟! 胡麻科的白芝麻以及藜科的苋色藜植株!但柠檬黄 化脉明病毒可系统侵染茄科的辣椒以及豆科的豇 豆!分别引起辣椒叶片的皱缩!以及豇豆的缺刻(坏 死(皱缩(反卷等症状"表 .(图 .#) 78; 病毒微粒形态特征 通过病毒粗提液负染电镜观察显示!病毒微粒 为联合的丝状!大小约为 "0: 0^1# %Lu"2// ^ 0 ///# %L"图 :#) 表 7 供试草本植物接种柠檬黄化脉明病毒后的症状 Y&A+. YB+GSLH*"LG"(B+$A&,+"#GH&%*G&(*+$L+,B&%-,&-%",#&*-"% @-*B S+"@V+-% V-$#G
科
\&L-S
供试材料
a&*+$-& 发病株数; 接种株数 6-G+&G+I H&%*G; -%",#&*+I H&%*G 发病率 8%,-I+%,+ "e# 症状 [SLH*"L 皱缩 Z#M"G+ 反卷 ]&$H-%M
坏死
b+,$"G-G 缺刻 8%I+%*&*-"% 芸香科Z#*&,+&+ 尤力克柠檬1="/9)3 0J#$+>&- /;1 / 4 4 4 4
葫芦科T#,#$-A&,+&G 黄瓜1=*&$/B#* /;1 / 4 4 4 4
苦瓜;=42&.&3$/& /;1 / 4 4 4 4 茄科 ["&%&,+&+ 辣椒1=<.#$%*4%3* 2;1 3/ l ll 4 4
茄子 +=9%")30%3& /;1 / 4 4 4 4
番茄 8=%*4#"%3#9 /;1 / 4 4 4 4
本氏烟F=A%3$2&9/&3& /;1 / 4 4 4 4 豆科P+ML-%"G&+ 豇豆S=#30#/4#"&$& 1;1 0// ll ll ll ll
胡麻科JI&-&,+&+ 白芝麻 +=/3-/4#9 /;1 / 4 4 4 4
藜科TB+%"HI-&,+&+ 苋色藜1=9&.&3$/4)"). /;1 / 4 4 4 4 OOlll$ 症状严重 ll$症状较严重 l$ 症状轻微 4$无症状) lll$ [+V+$+ ll$ G+$-"#G l$ L-I 4$GSLH*"L+GG= 图 7 供试草本植物接种柠檬黄化脉明 病毒后的发病症状 \-M=. YB+GSLH*"LG"(B+$A&,+"#GH&%*G&(*+$L+,B&%-,& -%",#&*-"% @-*B S+"@V+-% V-$#G
F$豇豆接种后发病症状 W$ 豇豆健康对照 T$辣 椒接种后发病症状 6$ 辣椒健康对照) F$YB+GSLH*"L "% ,"@H+&&(*+$-%",#&*-"% W$B+&*BS,"@H+& T$ *B+
GSLH*"L"% H+HH+$&(*+$-%",#&*-"% 6$B+&*BSH+HH+$=
O
图 9 柠檬黄化脉明病毒微粒形态特征
\-M=: a"$HB""MS"(V-$-"%G"(S+"@V+-% V-$#G O 78< 回接试验#病原!MHD@!检测与序列分析 在健康摩洛哥酸橙进行回接试验后!除原已显 症的尤里克柠檬(摩洛哥酸橙(代代酸橙(德威特桔 橙(铜水 5.K0 甜橙(马叙葡萄柚表现出了柠檬黄化 脉明病典型症状外!原接种而未显症的实生台湾椪 柑(墨西哥莱檬在回接到摩洛哥酸橙后也同样表现 出了柠檬黄化脉明病典型症状) 表明柠檬黄化脉明 病毒也能使实生台湾椪柑(墨西哥莱檬等柑橘品种 带毒而不显症) 0E12 期 陈洪明等$ 尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性及ZYK)TZ检测
ZYK)TZ检测结果也证明!接种后的所有柑橘
品种幼嫩叶片以及来自云南瑞丽的毒源均能扩增出
E02 AH的目标片段"图 2#) 将获得的扩增产物进行
克隆测序!并在 bTW8数据库中进行 WPF[Y比对分
析发现!所选的云南柠檬黄化脉明病毒 : 个分离物!
登录号分别为 f!31DE5D(f!31DE3/ 和 f!31DE30!与
土耳其的 TcgTg分离株 c0"!Q/2/E:190#外壳蛋
白序列的相似性均超过 D5e)
图 ; 接种柠檬黄化脉明病毒后不同供试材料的
!MHD@!电泳图
\-M=2 6+*+,*-"% "(S+"@V+-% V-$#GASZYK)TZ 0 E^$ 尤里克柠檬(摩洛哥酸橙(代代酸橙(德威特
桔橙(铜水 5.K0 甜橙(马叙葡萄柚 5 3^$实生台湾椪柑 D 0^/$ 墨西哥莱檬 00 0^:(05 0^3$健康对照 02 ^ 0E$ 瑞丽毒源 0D$水对照 a$ 0// AH L&$>+$) 0 4E$J#$+>&+L"%! a"$",""G"#$"$&%M+! 6&-I&-G"#$"$&%M+! 6@++**&%M"$! Y"%MGB#-5.K0 G@++*"$&%M+! &%I a&$GB&
M$&H+($#-* 5 43$)"%>&% G++I-%M D 40/$ a+C-,&% -L+
00 40:! 05 403$B+&*BS,"%*$" 02 40E$+L"% ($"L
Z#-- 0D$@&*+$,"%*$" a$ 0// AH L&$>+$=O
9 讨论
本试验研究对象为云南柠檬黄化脉明病!其症
状与发生在印度(巴基斯坦(土耳其等国的 TcgT6
相同!T&*&$&+*&="0DD:#试验表明 TcgT6在柠檬 和酸橙上极易显症!在哈姆林(奈维林娜(凤梨甜橙 上仅出现轻微的斑点和类似的环斑症状!其它品种 均未出现症状!该病原物不能通过机械传播到柑橘 其它品种…%+M++*&="./0/#试验结果也表明 TcgT6可感染酸橙和柠檬品种!而对于甜橙类(宽 皮柑橘类(葡萄柚类(塔西提莱檬都没有典型症状! 本研究结果与之相似) 汁液摩擦接种能侵染豇豆等 "…%+M++*&=!./00#!但不能在柑橘品种间进行机 械传播"FGB(&h +*&=!.//2.//1#!这也与本研究结 果相同) TcgTg症状在春梢表现最为明显!秋梢和 晚秋梢次之!夏梢基本不表现症状 "W"V+!0DD1 …%+M++*&=!./00#!这与本研究观察结果一致) 且 本研究中病毒微粒形态特征也与 R$-L&I-` T&*&$& "0DDE#(FGB&L-+*&=".//:#的报道相似) 通过选 取TcgTg基因组中外壳蛋白基因部分序列作为 ZYK)TZ的靶标!对云南柠檬黄化脉明病分离物进 行扩增!序列分析表明该病原物与 TcgTg具有 D5e以上的相似性) 由此证明云南柠檬黄化脉明病 即为柑橘黄脉病"TcgT6#) 对于TcgTg的防控!目前尚无有效药剂) 但 由于 TcgTg对温度较为敏感!因此可通过热处理 与茎尖嫁接相结合的方式来脱除病株中的 TcgTg "陈洪明等!./02#) 由于本研究中柑橘黄脉病在春 梢上的症状最为明显!因此在田间进行病害普查时 应以春梢症状作为主要的判断依据!从而对田间的 发病情况进行评估!及时发现!及时铲除) 且 TcgTg还存在豆蚜 ?,2/*4.&44/B).&(绣线菊蚜 ?= *,/.&%4)"&"…%+M++*&=!./0/#以及其它潜在的昆虫 传播媒介) 因此!使用无病毒苗木!加强病虫害监 测!尤其对蚜虫(粉虱等田间重要疑似传毒昆虫进行 统防统控是防治该病的重要手段) TcgTg还可危 害辣椒(豇豆等作物!因此在果园附近应避免种植这 些作物!从而减少病害传播的可能) 因瑞丽发病果 园相对隔离!在发现黄脉病后第 : 年就将整个果园 柠檬植株全部挖除!成功阻止了该病害的蔓延) 此 外!实生台湾椪柑(墨西哥莱檬感染 TcgTg但不显 症的现象可能与不同柑橘品种对 TcgTg的抗性差 异有关!这将为选育抗病或耐病柑橘品种提供参考) 虽然柠檬和酸橙可作为指示植物进行 TcgTg 鉴定!但是检测周期较长) 本研究首次建立了 TcgTg的ZYK)TZ检测体系!该体系能够检测出带 毒而未显症的病株!且适用于不同柑橘品种的检测! 从而极大地缩短了检测时间!为柑橘黄脉病的有效 防控提供了重要的技术保障) 致谢!中国农业科学院柑橘研究所赵学源研究员(唐科志副 研究员!云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所岳建 强研究员对本研究给予了大力支持与帮助!特此致谢. 参 考 文 献 "Z+(+$+%,+G#
FB&@&*c[=0DD5=g-$#G! M$++%-%MA&,*+$-#L&%I V-$"-IG&GG",-&*+I
@-*B ,-*$#G"1/$.#*GH+,-+G# I+,-%+-% 8%I-&=8%I-&% !"#$%&"( FM$-,#*#$&[,-+%,+G! E5".#$ 10 415
FGB&L-FFF! FB&@&*c[! )&%*Z)=.//:=FB-*B+$*"#%$+H"$*+I S+"@V+-% ,+&$-%MI-G+&G+"(,-*$#G-% 8%I-&&%I -*GV-$&+*-""K
MS=8%I-&% )BS*"H&*B""MS! 1E"2#$2.. 42.5 FGB(&h a! 8(*>B&$c! a#MB&[a! fB&% aF=.//1=7,,#$+%,+! I-G*$-A#*-"% &%I *$&%GL-GG-"% "(S+"@ V+-% ,+&$-%MV-$#G "cgTg# "(+L"% -% \&-G&&A&I=)&>-G*&% !"#$%&"()BS*"H&K
*B""MS! 05"0#$0/0 40/2 FGB(&h a! a#MB&[a! 8(*->B&$c! fB&% aF! fB&% bF=.//2=
.E1 植O物O保O护O学O报 2. 卷
[*#IS"% B"G*$&%M+! G+$""MS&%I -%,#G-"% A"I-+G"(S+"@
V+-% ,+&$-%MV-$#G"cgTg# "(+L"%=)&>-G*&% !"#$%&"()BSK *"H&*B""MS! 0E"0#$ 0 42
W"V€!a=0DD1=g-$#G&%I V-$#GK->+I-G+&G+G"(,-*$#G-% *B+b+&$
J&G*$+M-"%=\F7$ Z"L+
T&*&$&F!F??&$"F!6&V-%"a! )"-??-R=0DD:=c+"@V+-% ,+&$K -%M"(+L"% -% )&>-G*&%=;;a"$+%")! I&R$&†&!g! Y-LL+$
P]=)$",++I-%MG"(*B+0.*B T"%(+$+%,+"(*B+8%*+$%&*-"%&7$K
M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G=Z-V+$G-I+! T&-("$%-&$8%*+$%&K
*-"%&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G! HH=:E2 4:E5 T&*&$&F! F??&$"F! a#MB&[a! fB&% 6F=0D33=g-$#G! V-$"-IG &%I H$">&$S"*-,I-G+&G+G"(,-*$#G-% )&>-G*&%=;;R"$+% Z!a+%K I+f=)$",++I-%MG"(*B+E*B 8%*+$%&*-"%&T-*$#GT"%M$+GG= Z+B"V"*! 8G$&+$W&&A&% )#A-GB+$G! HH=D15 4DE.
TB+% Xa! P-# fX! _B"# c! ]&%MQ\! _B"# Tc! P-_F=./02=
[*#IS"% *B+L+*B"I ("$V-$#GK+-L-%&*-"% "(1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30 B/.#*=["#*B TB-%&\$#-*G! 2:":#$ 50 45: "-% TB-K
%+G+# +陈洪明! 刘科宏! 周彦! 王雪峰! 周常勇! 李中安=
./02=柑桔黄脉病毒脱毒方法研究=中国南方果树! 2:
":#$50 45:, 6+%MQQ! _B"# Tc! _B&%MX[! ]# X!!)+%MP_!_B"%MRc! !-&" Wb! P# _X=./00=YB+A$-+(-%*$"I#,*-"% "(*B+D*B 8%*+$%&K
*-"%&T"%M$+GG"(T-*$#Gb#$G+$SL+% &%I +CH+$-+%,+"(*B+H&$K
*-,-H&%*G=TB-%&$#-*b+@G! .3"0/#$03 4.E "-% TB-%+G+# +邓秀新!周常勇!张洪松!吴厚玖!彭良志!钟广炎!焦必 宁! 卢志红=./00=第九届国际柑桔苗木大会简介及与会收 获=中国果业信息! .3"0/#$ 03 4.E,
R&"cP! _B"# Tc! ]&%MQ\! _B"# c! P-# c=.//E=ZYK)TZI+K
*+,*-"% "([&*G#L&I@&$(V-$#G=!"#$%&"()&%*)$"*+,*-"%! ::
".#$0:E 402/ "-% TB-%+G+# +高艳玲! 周常勇! 王雪峰! 周 彦! 刘英=.//E=应用ZYK)TZ检测温州蜜柑萎缩病毒=植 物保护学报! ::".#$ 0:E 402/,
R$-L&I-g! T&*&$&F=0DDE=FGG",-&*-"% "(&(-&L+%*"#GV-$#G@-*B S+"@V+-% ,+&$-%M"(+L"%=;;a"$+%")! I&R$&†&!g! Y-LK
L+$P]=)$",++I-%MG"(*B+0:*B T"%(+$+%,+"(*B+8%*+$%&*-"%K
&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G=Z-V+$G-I+! T&-("$%-&$ 8%K
*+$%&*-"%&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G! HH=:2: 4:21
P","%G"+R! …%+M+b! )"*+$+7! R-&LH+*$#??-F! W"?&% 7! [&*&$[! I+[*$&I-GF! [&V-%"g! c">"L-)f! [&H"%&$-a=./0.= 8I+%*-(-,&*-"% &%I ,B&$&,*+$-?&*-"% "(1/$.#*(%")@B%/3 4"%&./30
B/.#*!&H#*&*-V+%+@L+LA+$"(*B+M+%#G;&3-&./B/.#*=)BS*"K H&*B""MS! 0/."0.#$ 00E3 40051
…%+M+b=.//.=\-$G*$+H"$*"(S+"@V+-% ,+&$-%M"(+L"%G-%
Y#$>+S=YB+!"#$%&"(Y#$>-GB )BS*"H&*B""MS! :.$ 1: 411
…%+M+b! W"?&% 7! R{> a! [&*&[=./0/=c+"@V+-% ,+&$-%M"( +L"%G-% Y#$>+S=;;X-(aJ! Y-LL+$P]! a-%+ZR! I& R$&†&!g=)$",++I-%MG"(*B+05*B T"%(+$+%,+"(*B+8%*+$%&K *-"%&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G=Z-V+$G-I+! T&-("$%-&$8%*+$%&*-"%&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G! HH=..5 4..3 …%+M+b! [&*&$[! J-AiSi> …! W"?&% 7! f&LA+$"Mt# a=./00= Y$&%GL-GG-"% G*#I-+G"(T-*$#GS+"@V+-% ,+&$-%MV-$#G=;;)$"K
,++I-%MG"(*B+03*B T"%(+$+%,+"(*B+8%*+$%&*-"%&7$M&%-?&*-"% "(T-*$#Gg-$""M-G*G=B*H$;;@@@=-V-&=+G;-",V
Z#G*-,-R! a-%+ZR! F,,"*"R)=.//.=b#,+"*-I+G+h#+%,+! M+K
%"L+"$M&%-G&*-"% &%I HBS"M+%+*-,&%&SG-G"(8%I-&% ,-*$#G
$-%MGH"*V-$#G=F$,B-V+G"(g-$""MS! 025"00#$..01 4...2 Y&L#$&f! )+*+$G"% 6! )+*+$G"% b! [*+,B+$R! b+-a! f#L&$[=
./00=aJRF1$L"+,#&$+V"#*-"%&$SM+%+*-,G&%&SG-G#G-%M L&C-L#L->+-B""I! +V"#*-"%&$SI-G*&%,+! &%I L&C-L#LH&$K G-L"%SL+*B"IG=a"+,#&$W-""MS&%I JV"#*-"%! .3 "0/#$.5:0 4.5:D Y-LL+$P]! a+%M+!F=6-G+&G+G"(T-*$#G"1/$.#*GHH=#=B*H$;; @@@=&HG%+*="$M;H#A-,&*-"%G;,"LL"%%&L+G;)&M+G;T-*$#G=&GK HC="./// 400 4/3# c&%M!_=0DE:=YB+L+,B&%-,&-%",#&*-"% L+*B"I "($&H+V-$#G I-G+&G+=!"#$%&"(F%B#-FM$-,#*#$&[,-+%,+G! "1#$E. 4E: "-% TB-%+G+# +杨家珍=0DE:=油菜病毒病汁液摩擦接种方 法=安徽农业科学! "1#$ E. 4E:,
c# !X! _B&"P! TB+% Rd! P-% cW=.//.=W-""M-,&-I+%*-(-,&*-"%
"(+&$*#9& -@&.I#,*-"%=)&%*)$"*+,*-"% Y+,B%""MS&%I JC*+%G-"%! .. "D#$
:1 4:E "-% TB-%+G+# +余继华! 赵琳! 陈国庆! 林云彪=
.//.=温州蜜柑萎缩病毒生物鉴定及对引种处理的建议=
植保技术与推广! .."D#$:1 4:E, _B"# c! _B"# Tc! ]&%MQ\! Y&%Mf_=.//1=YB+H"SL"$HB-GL
"(1/$.#*$./*$%>& B/.#*-% TB"%Mh-%M! TB-%&=!"#$%&"()&%*
)$"*+,*-"%! :.".#$ 02: 4025 "-% TB-%+G+# +周彦! 周常勇!
王雪峰! 唐科志=.//1=重庆地区柑桔衰退病毒多态性研
究=植物保护学报! :.".#$02: 4025,$责任编辑%李美娟&
:E12 期 陈洪明等$ 尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性及ZYK)TZ检测