全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（６）： ８９２ － ８９８ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００５
基金项目：国家现代农业（玉米）产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃０２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｊｉｅｃｈｅｎ５９＠ ｓｊｔｕ． ｅｄｕ． ｃｎ， Ｔｅｌ： ０２１ － ３４２０６１４１
收稿日期： ２０１５ － ０７ － １０
玉米矮化病株及其根际土壤内线虫的分离与分子鉴定
余传金１，２ 　 孙佳楠１，２ 　 傅科鹤１，２ 　 窦　 恺１，２ 　 岑佳美１ 　 陈　 捷１，２∗
（１．上海交通大学农业与生物学院， 农业部都市农业（南方）重点实验室， 上海 ２００２４０；
２．上海交通大学， 微生物代谢国家重点实验室， 上海 ２００２４０）
摘要： 为探究玉米矮化病的病原，采用 Ｌｕｄｏｘ ＴＭ悬浮法对从吉林和辽宁采集的玉米矮化病株及其
根际土壤和健康株根际土壤分离的线虫进行了鉴定和种群比较，并对矮化病株茎基组织 ＰＣＲ产物
进行测序分析。 结果表明：玉米健康株根际土壤分离出 ２９ 属线虫，特有线虫是角咽线虫属
Ａｃｔｉｎｏｌａｉｍｕｓ和木盾移线虫属 Ｐｅｌｔａｍｉｇｒａｔｕｓ，矮化玉米病株根际土壤分离出 ２８ 属线虫，特有线虫为
锥线虫属 Ｄｏｌｉｃｈｏｒｕｓ，二者相同的线虫属有 ２７ 个。 矮化玉米病株根际土壤中植物线虫种类和数量
明显比健康株根际土壤中高，线虫种群数量差异明显的主要是矮化线虫属 Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、短体
线虫属 Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ和刺线虫属 Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ，病株根际土壤中这 ３ 个属线虫总数约占病株土壤分
离线虫总数的 ２０􀆰 ２３％ 、１１􀆰 ２７％和 １０􀆰 ４０％ 。 玉米矮化病株茎基组织中短体线虫属和矮化线虫属
数量占优势，２ 个属的线虫数量分别占测序总数的 ２２％ 、１４％ （吉林长岭）和 １６％ 、２０％ （辽宁黑
山）。 表明玉米矮化病的发生与植物线虫相关，很可能是多种线虫共同引起的病害。
关键词： 玉米矮化病； 线虫； 分子鉴定
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｏｆ ｍａｉｎ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ
ｉｎ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌｓ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ
Ｙｕ Ｃｈｕａｎｊｉｎ１，２ 　 Ｓｕｎ Ｊｉａｎａｎ１，２ 　 Ｆｕ Ｋｅｈｅ１，２ 　 Ｄｏｕ Ｋａｉ１，２ 　 Ｃｅｎ Ｊｉａｍｅｉ１ 　 Ｃｈｅｎ Ｊｉｅ１，２∗
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｕｒｂａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ （Ｓｏｕｔｈ）， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ； Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ， Ｌｕｄｏｘ ＴＭ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ
ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｒｎ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｉｌｉｎ ａｎｄ Ｌｉａｏｎｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ； ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒｏｍ ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ２９
ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｒｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ｗｈｅｒｅ ｓｐｅｃｉａｌ
ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａ Ａｃｔｉｎｏｌａｉｍｕｓ ａｎｄ Ｐｅｌｔａｍｉｇｒａｔｕｓ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ２８ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ， ｗｈｅｒｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａ Ｄｏｌｉｃｈｏｒｕｓ． Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ
ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｏｒｎ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ， ２７ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ． Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ
ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ
ｓｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｔｗｏ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａ
Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ， Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ａｎｄ Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｉｎ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ
２０􀆰 ２３％ ， １１􀆰 ２７％ ａｎｄ １０􀆰 ４０％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａ Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ａｎｄ
Ｔｒｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ， ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ２２％ ，
１４％ （Ｃｈａｎｇｌｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ） ａｎｄ １６％ ， ２０％ （Ｈｅｉｓｈａｎ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ） ｏｆ ｔｈｅ
ｔｏｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ｗａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ
ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｍａｎｙ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｄｗａｒｆ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ； ｎｅｍａｔｏｄｅ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 玉米矮化病是玉米上一种重要的病害，给农业
生产带来了巨大的经济损失（刘国镕等，１９６４）。 矮
化病发病植株很像君子兰，所以又被叫做“君子兰”
苗，到 ４ ～ ５ 叶时吸收肥料和水分异常，不能正常发
育生长，矮化明显，株高一般不会超过健康株的一
半，叶片背面、叶鞘和苞叶叶脉上产生粗细不一的蜡
白色条状突起物且比较粗糙，少数玉米雄穗结少量
几颗发育不良的小玉米粒，大部分植株不结果或者
早衰死亡（张秀文等，１９９８；宗连平，２００５）。 近几年
该病相继在吉林、辽宁和北京地区发现，同时在河北
和东北地区发病有所加重，表明玉米矮化病在我国
北方春玉米区危害范围在逐渐扩大 （张静慧等，
２０１０；岳瑾等，２０１５）。 因此明确玉米矮化病的病原
已成为对该病进行有效防治的当务之急。
长期以来人们对玉米矮化病病原有不同的研究
结论，其复杂性在于其危害症状类似于蛀茎类虫害，
而且土壤内土传病原菌和土栖害虫种类很多，也可
在病害或虫害发生后期造成其它有害生物引起次生
侵染或腐生性感染，这势必导致矮化病病原鉴定的
复杂性和难度。 苏前富等（２０１５）指出东北地区玉
米矮化病发生较严重，用种衣杀虫剂克百威对矮化
病具有较好的防治效果，这也暗示了矮化病更倾向
于虫害。 杀虫剂，如丙硫克百威、噻唑磷等包衣玉米
种子也能有效控制矮化病 （孔德龙，２０１４；林红，
２０１４），进一步说明矮化病的发生可能与线虫相关。
玉米线虫病如根腐线虫病和根结线虫病等已有报导
（张杰等，２０１４；李秀花等，２０１５），但所引起的症状
与我国发现的玉米矮化病症状不同。 矮化病病原侵
染部位主要为幼苗茎基部，引起组织对称开裂孔口。
国家现代农业（玉米）产业技术体系团队于 ２００８ 年
在吉林和辽宁矮化病株根际土壤中分离到线虫、镰
刀菌和细菌等潜在的病原物，这些都可能引致玉米
矮化病。 岳瑾等（２０１５）在北京延庆县矮化病危害
严重的田间分离并鉴定了马舒德矮化线虫 Ｔｙｌｅｎ⁃
ｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍａｓｈｈｏｏｄｉ为潜在病原。 不足之处是没
有回接到植物上进行科赫法则验证，并且只鉴定到
１ 种可能的线虫，数量单一不具有群体效应。 为此
本研究对采集自吉林和辽宁省玉米矮化病病株及健
康玉米自然株根际周围土壤的病原线虫进行比较分
析，同时直接对病株茎基内的线虫进行分子鉴定，从
线虫种群与矮化病发生相关性角度进行探索，以期
从中发现关键致病相关线虫种类，为有针对性地防
治该病害和科学指导玉米生产提供理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试土壤及病株样品：分别于 ２０１３ 年 ６ 月 ５ 日
和 ２０１４ 年 ５ 月 ２４ 日在吉林省长岭县和辽宁省黑山
县采集矮化病发生田的玉米病株根际土壤及健康自
然株根际土壤，土样进行 ９ 点取样，采集 ０ ～ ２０ ｃｍ
土层土样，采集后封装并立即带回实验室 ４℃保存。
分别取 ２ 种土壤样品，过 ２ ｍｍ 筛后用于线虫分析。
同时将矮化玉米病株带回实验室，取侵染部位的茎
基组织样品进行线虫的分子鉴定。
培养基：ＬＢ 液体（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ，ＬＢ）培养
基：胰蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ、酵母提取物 ５ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ ／
Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０。 ＬＡ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ ａｇａｒ，ＬＡ）培养基：ＬＢ
培养基中添加 １􀆰 ５％琼脂粉，即为 ＬＡ固体培养基。
试剂及仪器：ｐＭＤ＠ １８⁃Ｔ 载体、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚
合酶和 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，宝生物工程（大连）有限公司；
ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ、ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α，北
京全式金生物技术有限公司，其它试剂为国产分析
纯。 ＺＨＷＹ⁃２００Ｄ恒温摇床、ＺＤＰ⁃２１２０ 电热恒温培
养箱，上海智诚科技有限公司；Ｌｅｉｃａ ＤＭ２５００ 荧光
显微镜，莱卡微系统公司；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ ２２３３１ Ｈａｍ⁃
ｂｕｒｇ ＰＣＲ仪，德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 玉米矮化病株症状的观察
２０１３年吉林长岭县玉米种植区和 ２０１４年辽宁黑
山县玉米种植区玉米矮化病发生严重，在当年 ５ 月份
到发病田间进行调查，病变玉米株矮化明显，株高只
有健康株的一半，且叶片上有黄色褪绿或白色失绿纵
向条纹，小心拔出这些症状明显的病变苗，去掉根系
３９８６ 期 余传金等： 玉米矮化病株及其根际土壤内线虫的分离与分子鉴定
土壤、洗净拍照，并将发病植株茎组织和发病根际土
壤带回实验室作为相关病原鉴定材料进行分析。
１􀆰 ２􀆰 ２ 玉米根际土壤中线虫的分离
根际土壤样品的线虫采用硅石液胶 Ｌｕｄｏｘ ＴＭ
悬浮法分离提取（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９０）。 Ｌｕｄｏｘ ＴＭ
原液用蒸馏水稀释使其比重为 １􀆰 １５ 待用；分别将健
康玉米根际土和病变玉米根际土各 ２００ ｇ 土样过
５００ μｍ大孔网筛筛去土样中大型动物，将通过网筛
的样品在 ４５ μｍ 网筛上用清水筛洗；再次用比重
１􀆰 １５ 的 Ｌｕｄｏｘ ＴＭ溶液清洗留在孔径 ４５ μｍ网筛中
的样品到 ５００ ｍＬ烧杯中，并加入比重 １􀆰 １５ 的 Ｌｕｄｏｘ
ＴＭ溶液 ２００ ｍＬ，混匀后静置 １ ｈ，待线虫等动物悬
浮后，上清过 ４５ μｍ 小网筛，将线虫等小型土壤动
物留在网筛上；最后将滤下的 Ｌｕｄｏｘ ＴＭ溶液重新倒
入烧杯并混合均匀，静置后按上述方法过滤，重复 ３
次。 线虫等小型土壤动物基本上可全部收集。 线虫
数量通过解剖镜计数，并依据土壤含水量将土壤线
虫数量折算成每 ２００ ｇ干土含有线虫的数量。 每处
理 ３ 次重复。 然后将每个样品中的线虫放入甘油、
酒精和水的混合溶液（１ ∶ ４ ∶ １５）中，脱水 ２ 周后制
片，显微镜下鉴定到属并计数。
１􀆰 ２􀆰 ３ 矮化病株内线虫的分子鉴定
随机从吉林长岭（２０１３ 年）和辽宁黑山（２０１４
年）挑选出 １０ 株矮化病病株，选取发病株茎基组
织，剪细后在液氮下研磨成粉，然后按照 ＥａｓｙＰｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ 的方法提取玉米组织的总
ＤＮＡ。 使用线虫通用引物 １８ｓ⁃Ｆ： ５′⁃ＣＧＣＧＡＡＴ
ＲＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣ⁃３′ 和 １８Ｓ⁃Ｒ： ５′⁃ＧＧＧＣＧＧ⁃
ＴＡＴＣＴＧＡＴＣＧＣＣ⁃３′（Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ． ，２００５）进行 ＰＣＲ扩
增，ＰＣＲ 体系为：Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ｄＮＴＰ ５ μＬ、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ １８Ｓ⁃Ｆ ／ Ｒ 引物各 １􀆰 ５ μＬ、总
ＤＮＡ模板 １􀆰 ５ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ聚合酶 １ μＬ，加入 ｄｄＨ２Ｏ
至 ５０ μＬ。 ＰＣＲ 扩增步骤为：９５℃预变性 １ ｍｉｎ，
９５℃ ２５ ｓ，５６℃ ３０ ｓ，７２℃ ６０ ｓ，３５ 个循环，７２℃ ５
ｍｉｎ，扩增产物在 １􀆰 ４％ 琼脂糖凝胶上电泳后用
ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 回收，回收后的片
段连到 ｐＭＤ１８⁃Ｔ载体上，连接体系为 ３０ ｎｇ ／ μＬ ＰＣＲ
产物 ４􀆰 ５ μＬ、ｐＭＤ １８⁃Ｔ ０􀆰 ５ μＬ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ ５ μＬ 在
２５０ μＬ薄壁管内 ４℃连接过夜。 次日将所有连接产
物转化到感受态细胞 ＤＨ５α内，３７℃在含有 １００ μｇ ／
ｍＬ氨苄青霉素抗性 ＬＡ平板上培养 １４ ｈ，随机挑选
长出的单菌落作菌液 ＰＣＲ。 产物在 １􀆰 ４％琼脂糖凝
胶上电泳，鉴定为阳性的 １ 份 ＰＣＲ产物送上海博尚
生物技术有限公司测序，测序结果在 ＮＣＢＩ 进行
ＢＬＡＳＴ⁃Ｎ比对；另 １ 份用 ＭｓｅⅠ酶切进行分型分析。
１􀆰 ３ 数据分析
所有试验数据使用 Ｅｘｃｅｌ ２０１０ 进行处理分析，
计算各处理组的均值及其标准偏差。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 玉米矮化病的症状观察
健康玉米茎组织光泽平滑无任何发病症状（图
１⁃ａ），而矮化病病株矮缩，顶端生长受到严重抑制，
外观下部茎节膨大；根系不发达，新生气生根扭曲变
形；叶片一侧沿叶脉有黄色或白色失绿纵向条纹，发
病初期仅在茎基部内侧组织可见小黑点，外侧叶鞘
无症状，剥开外部 ２ ～ ３ 层叶鞘，基部可见明显褐色
病斑，病斑呈纵向扩展；再剥开 １ ～ ２ 片叶，可见叶鞘
和茎杆上有纵向或横向的组织开裂，似“虫道”状，
部分发病的大苗叶鞘边缘发生锯齿状缺刻（图 １⁃
ｂ）。 在茎基部秆上形成的孔洞先变色，然后腐烂，
接着形成病斑，随着茎秆节间的迅速生长，因病斑处
坏死组织不能平行生长，茎秆被撕裂，形成孔洞，孔
洞周围组织呈现对合状，边缘没有害虫啃食后组织
破碎的痕迹，孔口或孔内一般较干燥（图 １⁃ｃ）。
图 １ 玉米健康株幼苗和矮化病株的对比
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｐｈｏｔｏ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ
ａ： 健康株； ｂ ～ ｃ： 矮化病株。 ａ： Ｈｅａｌｔｈｙ ｓｅｅｄｌｉｎｇ；
ｂ － ｃ： ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ．
　
２􀆰 ２ 健康株土壤和矮化病土壤线虫的分离比较
健康株根际土壤分离出 ２９ 属线虫，特有属是角
咽线虫属 Ａｃｔｉｎｏｌａｉｍｕｓ 和木盾移线虫属 Ｐｅｌｔａｍｉｇｒａ⁃
ｔｕｓ，矮化病株根际土壤分离出 ２８ 属线虫，特有属为
锥线虫属 Ｄｏｌｉｃｈｏｒｕｓ，二者共有线虫属 ２７ 个，分别为
矮化线虫属 Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、短体线虫属 Ｐｒａｔｙｌｅｎ⁃
ｃｈｕｓ、刺线虫属 Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ、头叶线虫属 Ｃｅｐｈａｌｏ⁃
ｂｕｓ、潜根线虫属 Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ、真头叶线虫属
Ｅｕｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ、轮线虫属 Ｃｒｉｃｏｎｒｍｏｉｄｅｓ、垫刃线虫属
４９８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
Ｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、环线虫属 Ｃｒｉｃｏｎｅｍａ、毛刺线虫属 Ｔｒｉ⁃
ｃｈｏｄｏｒｕｓ、板唇线虫属 Ｃｈｉｌｏｐｌａｃｕｓ、柄瑞球线虫属
Ｐａｕｒｏｄｏｎｔｕｓ、扁腔线虫属 Ｓｅｃｔｏｎｅｍａ、丽突线虫属 Ａｃ⁃
ｒｏｂｅｌｅｓ、滑刃线虫属 Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ、拟矛线虫属 Ｄｏｒｙ⁃
ｌａｉｍｏｉｄｅｓ、头垫刃线虫属 Ｔｅｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、小杆线虫属
Ｒｈａｂｄｉｔｉｓ、拟毛刺线虫属 Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ、中矛线虫
属 Ｍｅｓｏｄｏｒｙｌａｉｍｕｓ、真滑刃线虫属 Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ、鹿角
唇线虫属 Ｃｅｒｖｉｄｅｌｌｕｓ、穿咽线虫属 Ｎｙｇｏｌａｉｍｕｓ、盘咽
线虫属 Ｄｉｓｃｏｌａｉｍｕｓ、大矛线虫属 Ｅｎｃｈｏｄｅｌｕｓ、无咽线
虫属 Ａｌａｉｍｕｓ、垫咽线虫属 Ｔｙｌｅｎｃｈｏｌａｉｍｕｓ。 健康株根
际土壤中排前 ３ 位的优势种类为扁腔线虫属、鹿角
唇线虫属和真头叶线虫属，占分离总数的 ８􀆰 ９２％ 、
８􀆰 ０３％和 ７􀆰 ７３％ 。 病株根际土壤中优势线虫种类
为矮化线虫属、短体线虫属和刺线虫属，占分离总数
的 ２０􀆰 ２３％ 、１１􀆰 ２７ 和 １０􀆰 ４０％ ，三者之和达 ４１􀆰 ９％ ，
但在健康株土壤中分别仅为 ２􀆰 ６８％ 、 １􀆰 １９％ 和
０􀆰 ８９％ （图 ２）。 说明玉米矮化病与这些植物寄生线
虫相关，至少表明有线虫参与了玉米矮化病的形成。
图 ２ 健康和病变玉米幼苗根际土壤分离的线虫属种类（吉林长岭）
Ｆｉｇ． ２ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｏｒｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ （Ｃｈａｎｇｌｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）
１： 矮化线虫属； ２： 短体线虫属； ３： 刺线虫属； ４： 头叶线虫属； ５： 潜根线虫属； ６： 真头叶线虫属； ７： 轮线虫属； ８：
垫刃线虫属； ９： 环线虫属； １０： 毛刺线虫属； １１： 板唇线虫属； １２： 柄瑞球线虫属； １３： 扁腔线虫属； １４： 丽突线虫属； １５：
滑刃线虫属； １６： 拟矛线虫属； １７： 头垫刃线虫属； １８： 小杆线虫属； １９： 拟毛刺线虫属； ２０： 中矛线虫属； ２１： 真滑刃线虫
属； ２２： 鹿角唇线虫属； ２３： 穿咽线虫属； ２４： 盘咽线虫属； ２５： 大矛线虫属； ２６： 锥线虫属； ２７： 无咽线虫属； ２８： 垫咽线
虫属； ２９： 角咽线虫属； ３０： 木盾移线虫属。 １： Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ； ２： Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ； ３： Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ； ４： Ｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ； ５： Ｈｉｒ⁃
ｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ； ６： Ｅｕｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ； ７： Ｃｒｉｃｏｎｒｍｏｉｄｅｓ； ８： Ｔｙｌｅｎｃｈｕｓ； ９： Ｃｒｉｃｏｎｅｍａ； １０： Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ； １１： Ｃｈｉｌｏｐｌａｃｕｓ； １２： Ｐａｕｒｏｄｏｎ⁃
ｔｕｓ； １３： Ｓｅｃｔｏｎｅｍａ； １４： Ａｃｒｏｂｅｌｅｓ； １５： Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ； １６： Ｄｏｒｙｌａｉｍｏｉｄｅｓ； １７： Ｔｅｔｙｌｅｎｃｈｕｓ； １８： Ｒｈａｂｄｉｔｉｓ； １９： Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ；
２０： Ｍｅｓｏｄｏｒｙｌａｉｍｕｓ； ２１： Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ； ２２： Ｃｅｒｖｉｄｅｌｌｕｓ； ２３： Ｎｙｇｏｌａｉｍｕｓ； ２４： Ｄｉｓｃｏｌａｉｍｕｓ； ２５： Ｅｎｃｈｏｄｅｌｕｓ； ２６： Ｄｏｌｉｃｈｏｒｕｓ； ２７：
Ａｌａｉｍｕｓ； ２８： Ｔｙｌｅｎｃｈｏｌａｉｍｕｓ； ２９： Ａｃｔｉｎｏｌａｉｍｕｓ； ３０： Ｐｅｌｔａｍｉｇｒａｔｕｓ．
　
２􀆰 ３ 玉米矮化病株中线虫的分子鉴定
２􀆰 ３􀆰 １ 矮化病变茎组织的 ＰＣＲ鉴定
为进一步确认玉米矮化病与植物寄生线虫具有
相关性，使用线虫通用引物对吉林长岭和辽宁黑山
发病茎基组织进行分子鉴定，ＰＣＲ 产物均为 ９００ ｂｐ
条带（图 ３），表明 ２ 个地方玉米病株中确实存在线
虫，很可能与矮化病发生有关。
２􀆰 ３􀆰 ２ 线虫片段酶切分型和线虫属鉴定
将吉林长岭病株茎基组织扩增的 ９００ ｂｐ 纯化
ＰＣＲ产物连接到 ｐＭＤ １８⁃Ｔ 载体并转入大肠杆菌
中，获得的 １５ 个随机阳性克隆菌落 ＰＣＲ产物用 Ｍｓｅ
Ⅰ酶切后，电泳图特征表明这些检测的线虫有 ５ 种
　 　 　
图 ３ 玉米矮化病病株茎基组织中线虫的 ＰＣＲ分析
Ｆｉｇ． ３ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ １８Ｓ ＲＮＡ ＰＣＲ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔａｌｋ ｂａｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ
Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １： 吉林长岭； ２： 辽宁黑山。 Ｍ：
ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １： Ｃｈａｎｇｌｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ； ２： Ｈｅ⁃
ｉｓｈａｎ Ｃｏｕｎｔｒｙ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． 　
５９８６ 期 余传金等： 玉米矮化病株及其根际土壤内线虫的分离与分子鉴定
不同分型，泳道 １ 为第 １ 种，泳道 ２、３、５、１２、１３ 和 １５
为第 ２ 种，泳道 ４ 为第 ３ 种，泳道 ６ ～ １１ 为第 ４ 种，
泳道 １４ 为第 ５ 种（图 ４）。 说明矮化病的产生可能
不是单一线虫作用，而是多种线虫共同作用产生的
综合症。 吉林长岭病株茎基组织中鉴定出 ９ 个线虫
属，分别为短体线虫属、穿刺线虫属、矮化线虫属、拟
丽突线虫属、腐烂茎线虫属 Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、头叶线虫
属、剑线虫属 Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ、滑刃线虫属和垫咽线虫属，
其中短体线虫属、穿刺线虫属、矮化线虫属为优势线
虫属，分别占总数的 ２２％ 、１６％和 １４％ ，三者之和为
５２％ 。 辽宁黑山矮化病茎基组织中鉴定出 １０ 个属
的线虫，比吉林长岭多了鞘线虫属 Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ
和矛线虫属 Ｄｏｒｙｌａｉｍｕｓ，但没有头叶线虫属，除此之
外还有部分不能培养线虫，无法鉴定到属；主要优势
种群为矮化线虫属、短体线虫属和鞘线虫属，分别占
总数的 ２０％ 、１６％和 １４％ （图 ５）。 分子鉴定结果与
矮化病病株根际土壤分离的线虫属统计结果非常吻
合，其中短体线虫属和矮化线虫属都是优势种群。
这进一步证实玉米矮化病与线虫确实相关。
图 ４ 玉米矮化病株茎基组织线虫 ＰＣＲ扩增产物 ＭｓｅⅠ酶切后电泳分型分析（吉林长岭）
Ｆｉｇ． ４ Ｎｅｍａｔｏｄｅ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｓｅⅠｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ （Ｃｈａｎｇｌｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）
Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １ ～ １５： １５ 个随机阳性 ＰＣＲ片段酶切产物； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １ － １５： １５ ｒａｎｄｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｓｅⅠ．
　
图 ５ 吉林长岭和辽宁黑山玉米矮化病病株茎基组织中的主要线虫属
Ｆｉｇ． ５ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｔａｌｋ ｏｆ ｃｏｒｎ ｄｗａｒｆ ｉｎ Ｃｈａｎｇｌｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
ａｎｄ Ｈｅｉｓｈａｎ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
１： 矮化线虫属； ２：短体线虫属； ３：鞘线虫属； ４：穿刺线虫属； ５：腐烂茎线虫属； ６：拟丽突线虫属； ７：剑线虫属； ８：
矛线虫属； ９： 垫咽线虫属； １０： 滑刃线虫属； １１： 头叶线虫属； １２： 不能培养线虫。 １： Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ； ２： Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ；
３： Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ； ４： Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ； ５： Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ； ６： Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ； ７： Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ； ８： Ｄｏｒｙｌａｉｍｕｓ； ９： Ｔｙｌｅｎｃｈｏｌａｉｍｕｓ； １０： Ａｐｈ⁃
ｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ； １１： Ｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ； １２： ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．
　
３ 讨论
本研究通过对玉米健康株和矮化病株根际土壤
内线虫进行分离比较，并对病株组织内线虫进行分
子鉴定，明确了玉米矮化病的发生与植物寄生线虫
关系密切。 由于目前国际上已发生的玉米线虫病害
６９８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
基本上均是以侵染根系为主，而我国玉米矮化病显
症部位却主要是在茎基或者茎基与主根连接部位，
而非根系上显症，且侵染点是从组织内向外发展，其
侵染规律与已知的玉米线虫病明显不同（Ｋｏｅｎｎｉｎｇ
ｅｔ ａｌ． ，１９９９；Ｓｋａｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． ，２０１２），但关于玉米矮化
病线虫侵染规律还需系统研究。 本研究中，健康株
和矮化病株根际土壤分离到的线虫种类存在差异，
前者分离到大量的非植物线虫或腐生线虫，其中特
有的角咽线虫属和木盾移线虫属线虫在病株土壤中
未分离到。 谢钦铭和张选辉（２００２）研究表明土壤
中角咽线虫属线虫能够捕食病原昆虫和病原线虫，
并且在调节土壤线虫和昆虫密度方面发挥着作用，
这与本研究中病株土壤中没有分离出角咽线虫属线
虫是一致的，其原因可能是发病土壤环境发生剧烈
变化，导致角咽线虫属等捕食性线虫数量急剧下降，
从而使得矮化线虫属和短体线虫属等病原线虫数量
上升导致发病，这与健康株土壤中短体线虫属和矮
化线虫属分离频率很低的结果也是吻合的。 病株根
际土壤中除矮化线虫属和短体线虫属外，刺线虫属、
潜根线虫属、头叶线虫属、轮线虫属、环线虫属、毛刺
线虫属和丽突线虫属分离比例较健康株土壤高，说
明病株根际土壤中线虫种群平衡发生了变化，其生
物或非生物环境有利于植物寄生线虫占领，也可能
与植物寄生线虫在土壤内分布不均匀有关，病株根
际土壤内植物寄生线虫种群分布多，易造成侵染。
杨意伯（２０１３）研究也指出短体线虫属、环线虫科、
剑线虫属和毛刺线虫科等线虫对龙眼、荔枝等果树
具有重要或潜在危害性。
本试验中，矮化病株组织和病株根际土壤各自
的 ３ 种优势属中，有 ２ 种是相同的，即矮化线虫属和
短体线虫属。 岳瑾等（２０１５）在北京延庆县玉米矮
化病严重的田间成功分离并鉴定的马舒德矮化线虫
为玉米矮化病主要的病原，这与本研究分离到矮化
线虫属为优势属的结果是一致的，同时还发现短体
线虫属和刺线虫属分离频率也很高，可能与玉米矮
化病的发生有关。 但从病原组织和病株根际土壤中
分离到的线虫优势种类排序不同，在病组织中辽宁
黑山检测频率最高的是矮化线虫属，其次为短体线
虫属和鞘线虫属，吉林长岭检测频率最高的是短体
线虫属，其次为穿刺线虫属和矮化线虫属，且前 ３ 个
属之和分别占各自分离线虫总数的 ５０％和 ５２％ ；而
在病株根际土壤中以矮化线虫属最高，其次是刺线
虫属和短体线虫属，这些差异可能与不同属线虫寄
生能力的差异以及植物组织和根际土壤的环境条件
差异有关。 郭宁和石洁（２０１２）对北方玉米根际土
壤中寄生线虫种类进行了全面分析，并指出矮化线
虫属占样本总数的大部分，东北地区为优势属，而短
体线虫属在辽宁和河南 ２ 省丰富，这与本研究结果
一致，发病土壤和病原组织中都鉴定到了这 ２ 个属，
极可能玉米病变使得根际生态环境发生了变化，引
起矮化线虫属和短体线虫属等的线虫数量增加，并
参与了矮化病的发生。
本研究仅从线虫种群数量分布与玉米矮化病的
关系上进行了分析，需要进一步通过人工接种分离
和鉴定出的优势线虫属到玉米植株上进行验证，并
需结合优势线虫及其种群特性和土壤条件才能判定
引起玉米矮化病的线虫种类。 因为人工接种的条件
与田间自然发病的条件相差很大，很难完全复制出
田间的症状，所得结果容易引起争议，这在本课题组
初步人工接种试验中得到了证实。 由于土传病害涉
及的因素相当复杂，不同地区该病的发生优势线虫
种类和发生条件是否一致尚不明确，是否存在多种
线虫复合侵染也需进一步研究（郑俊强等，２００５）。
因此在这种情况下，可以考虑在全国多个地点对自
然病株进行定点系统取样，在对多种可能的有害生
物进行分离、接种的同时，开展自然病株组织的显微
和超微观察、病组织分子与免疫学鉴定，多种方法结
果相互比较和印证之后才可能确定一种或者几种最
有可能的病原物。 由于玉米矮化病线虫侵染玉米茎
基组织的途径和最佳时期不明确，传统的组织分离
方法较难取得结果，因此通过分子鉴定寻找线虫侵
染玉米组织的证据和途径是一种有效的方法。 采用
自然病株超显微观察和荧光定量检测等技术可避免
病原分离和接种过程中人为主观因素干扰的不足，
结果更为接近自然情况，可作为研究玉米矮化病的
重要辅助工具（宋志强等，２０１３；卜艳珍等，２０１４）。
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（责任编辑：李美娟）
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