全 文 ：收稿日期：!""#$"%$"& 接受日期：!""#$’!$!(
基金项目：国家“)*+”项目（!""%,-’!")"+）；国家自然科学基金（+"&*’!+(）；中国博士后资助基金（!""%"+**+(）资助。
作者简介：王松伟（’)#’—），男，河南叶县人，硕士研究生，主要从事植物营养学研究。./0："!%$#(+)&’’(，123450：!""%’"+")’67849: /;9: <7 !通讯作者 ./0："!%$#(+)&+)+，123450：=5=>7?’)*+67849: /;9: <7
铵、硝营养对水稻叶细胞膜 ! " #$%&’()和 质子泵活性的影响 王松伟，朱毅勇!，狄廷均，曾后清，沈其荣，徐国华 （南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 !’"")%） 摘要：用两相法分离铵态氮（@AB( 2@）和硝态氮（@C$+ 2@）培养的水稻苗期叶细胞膜，并测定了细胞膜 AB 2D.E4F/水
解活性和质子泵活性，以期阐明铵、硝营养对水稻叶细胞膜 AB 2D.E4F/的影响。结果表明，叶细胞膜 AB 2D.E4F/活
性最佳 GA值均为 &H!。@C$+ 2@培养的水稻叶细胞膜 AB 2D.E4F/的水解活性、!34I和 "3均显著高于 @AB( 2@培养的 水稻叶；J/FK/L7 -0>K分析结果看出，@C$+ 2@培养的水稻叶细胞膜 AB 2D.E4F/酶浓度也高于 @AB( 2@培养的水稻叶，
说明 @C$+ 2@培养的水稻叶中单位细胞膜上的 AB 2D.E4F/酶分子数量大于 @AB( 2@培养的水稻叶，这与细胞膜上 AB 2D.E4F/蛋白的表达量升高有关。此外，@C$+ 2@培养的水稻叶质子泵初速度和膜囊体内外 AB浓度梯度均高于
@AB( 2@培养。由于 @C$+ 的跨膜运输是与细胞膜上 AB 2D.E4F/紧密联系的主动运输过程，@C$+ 2@培养的水稻叶片
细胞膜 AB 2D.E4F/活性和质子泵活性高可能与水稻叶细胞吸收大量 @C$+ 有关。 关键词：水稻；细胞膜 AB 2D.E4F/；铵态氮；硝态氮 中图分类号：M%’’H"’ 文献标识码：D 文章编号：’""#$%"%N（!"")）"($"*(($"&
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G047KF P4F X5?X/L KX47 KX4K >] @AB( 2@ ]/; G047KF : .X/F/ L/F90KF 57;5<4K/ KX4K KX/ X5?X/L 4] AB 2D.E4F/ ]L>3 L50/4[/F >] @C$+ 2@ ]/; G047KF 5F L/F90K/; ]L>3 KX/ 57] AB 2D.E4F/ 975KF G/L 3/3\L47/ 4L/4 47; 9G2L/?92
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L57 5F 57;9] 04L?/ 43>97K @C$+ 2@ 57 K> KX/ 0/4] 00F :<br9#: ;’/.&：L5；G04F34 3/3\L47/ AB 2D.E4F/；4337593；75KL4K/ 植物营养与肥料学报 !"")，’%（(）：*(($*()
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E047K @9KL5K5>7 47; a/LK505^/L M<5/7铵态氮（!"#$%!）与硝态氮（!&’( %!）是植物吸收 与利用的两种主要氮素形态。尽管在淹水栽培条件 下的水稻主要以吸收铵态氮为主［)’*］，但在实践中 发现，增加 !&’( %!营养可以促进水稻生长和提高产 量［(］。有报道认为，水稻体内不仅存在铵转运系 统［*］，还存在硝酸盐转运系统［$］。!"#$或 !&’( 的 跨膜 运 输 均 与 细 胞 膜 上 的 "# %+,-./0（ 12 (343)3(5）在膜两侧形成的 "#浓度梯度和电化学势 有关［5’4］。已有研究表明，大麦根系吸收 !"#$ %!时，
其质膜 "# %+,-./0 活性升高［6］；玉米根系吸收
!&’( %! 时，其中两个 "# %+,-./0 基因 !"#$和 !"#% 受诱导表达［7］，而且其吸收 !&’( %!能力的差 异与 !"#& 的表达强弱有关［8］。 我们研究表明，!"#$ %!培养的水稻根系细胞膜
"# %+,-./0活性大于 !&’( %!培养的［)9］，原因主要是
根系吸收 !"#$后引起根际 :"值剧烈下降（!"#$ %!
培养后营养液 :"为 (39，!&’( %!为 435），从而诱导
细胞膜 "# %+,-./0 的活性升高［))］。由于根系吸收
的氮素绝大部分进入叶细胞中参与各种生理代谢，
而叶细胞质外体在植物吸收 !"#$%! 后 :"降低不 显著［)*］，并且在活的植物体内存在着 :" 调节系 统［)(］。不同形态氮素在跨膜运输时对叶片细胞膜 "# %+,-./0的影响是否与根系中相同，目前仍不清 楚；同时，氮素在地上部分的跨膜运输直接涉及到 植物体内能量的消耗与转换［4］。因此，探讨在 !"#$ %!和 !&’( %!营养下水稻叶质膜 "# %+,-./0的
水解活性和质子泵活性及其原因，对于进一步研究
质膜 "# %+,-./0在氮素营养在地上部分的吸收和转
运过程中所起的作用具有重要意义。
! 材料与方法
!"! 水稻植株培养
供试水稻（ ’()*+ ,+-./+ ;<）品种为日本晴
（0+123.4+ //:< => < !?::@AB.C0）。种子用 )9D "*&*
消毒 (9 E?A，以去离子水浸泡后置于 *5F恒温光照
培养箱中催芽 * G，6 G后幼苗转移至 5 ;周转箱中，
于人工气候室中培养。)$G后用营养液处理。营养 液采用国际水稻研究所（HIIH）常规配方，略作修改， 即在营养液中不加入硅酸盐，以避免营养液中 :" 剧烈下降。试验设 * 个处理：!"#$ %!用（!"$）*J&$
配制；!&’( %!用 2.（!&(）*·$"*&配制，氮素浓度为$9 EK L ;。M0 以 M0%1N,+ 形式配制，浓度为 *9
EK L ;。每隔 * G更换营养液一次。处理 )9 G后取水
稻叶片分离细胞膜。独立试验重复 (次。
!"# 水稻叶片细胞膜分离
叶片细胞膜分离方法参照 O.A 等［)$］及狄廷均 等［)9］所用的方法，略加修改，即所用离心机为 P12QR+! 2&S;,1I &:T?EUE,R ;%79 V-，转头为 JW(* ,?。所有操作均在 9!$F下进行。
!"$测定指标及分析方法 )3(3) 叶片中游离 !"#$ %!、!&’( %!含量测定 叶
片中游离 !"#$、!&’( 含量测定根据李合生［)5］的方 法。称取新鲜水稻叶片 )399 K左右置于研钵中，加 入适量去离子水及少量石英砂研磨成匀浆后转入 *5 E;刻度试管中，密封后放在沸水浴 (9 E?A，定容 到 )99 E;，再加入 )399 K 活性碳并充分振荡以脱 色，过滤后用流动注射分析仪（+UT@+E.XYZ0C/ (，PC.A # ;U0BB0 [EB"，[0CE.AY）测定游离 !"#$ 和 !&’(
含量。
)3(3* 膜蛋白质含量测定 用 PC.G\@CG（[*59）染色
法［)4］测定，PJ+（牛血清蛋白）为标准蛋白。
)3(3( 细胞膜 "# %+,-./0水解活性的测定 测定
细胞膜 "# %+,-./0 水解活性时，反应体系参照 O.A
等［)$］的方法，显色过程参照 &]A?/]? 等［)6］的方法。 反应体系体积为 9359 E;，含有 (9 EE@X L ; P,- L R1J 缓冲液、5 EE@X L ; RKJ&$、59 EE@X L ; Q2X、59 EE@X L ;
Q!&(、) EE@X L ; !.*R@&$、) EE@X L ; !.!(、939*D （WL ^）PC?_ 57（J?KE.）、5 EE@X L ; !.*’+,-。加入 (9 !;膜蛋白（蛋白含量 )!*!K）启动反应，(9F下保 温 (9 E?A，然后加入中止液 *359 E;，* E?A后再加入 显色剂 93*5 E;，(9F下保温 (9 E?A后测定波长 6*9 AE处光吸收值。另在相同的条件下，以测定煮沸 (9 E?A后失去活性的膜蛋白为空白。水解活性根据 单位时间内每毫克膜蛋白释放的磷含量减去空白值 计算。 )3(3$ 细胞膜蛋白凝胶电泳和免疫印迹试验 细
胞膜蛋白凝胶电泳和免疫印迹试验参照陈熙等［)7］
及狄廷均［)9］所用的方法。植物细胞膜 "# %+,-./0
多克隆抗体为丹麦皇家兽医与农业大学（,]0 I@Y.X
^0T0C?A.CY .AG +KC?=UXTUC.X SA?>0C/?TY）-.XEKC0A教授惠
赠。
)3(35 细胞膜质子泵活性测定 参照 O.A等［)$］所 用的方法。根据吖啶橙（+=C?G?A0 &C.AK0，+&）在$8*
AE处吸光值的猝灭鉴定细胞微囊体内外形成的跨
质膜 :"梯度。+&的猝灭变化用连续分光光度计
测定。加入 RK%+,-（将 RKJ&$和 !.* ’+,-混合，:" 435）启动反应，反应液中 +,- 的最终浓度为 5 5$6$期 王松伟，等：铵、硝营养对水稻叶细胞膜 "# %+,-./0和质子泵活性的影响 !!"#$ %。反应温度为 &’(。当猝灭值达到稳定时
加入 )*!% &’+) !!"# $% ,-./01抑制泵活性，最后加 入 )*!% 2’’!!"#$ % 3
4通道试剂短菌杆肽 5（67-!8
9:9;9<=）。根据猝灭值的变化计算质子泵的反应速率
及其造成的 34浓度梯度。
所有数据均为 .次独立试验的平均值 >标准误
差（?=-< > @A），并采用 @B@软件中 %@5（! C *+*’）
进行处理间双重比较。
! 结果与分析
!"# 叶中的游离 $%&’ 和$()* 含量
水稻生长到 &’ ;后，,0D. 8,培养的水稻叶中游
离 ,341 的含量为 ,341 8,培养的一半左右，这是因
为硝酸盐在叶片中被还原为 ,341［)E］。而 ,341 8,培
养的水稻叶中只检测到含量极低的游离 ,0D.（表
)）。
!"! 叶细胞膜囊体纯度检验
水稻叶片样品经葡聚糖两相系统分离后获得细
胞膜的微囊体，其中各种生物膜 BFG-H=的水解活性
测定结果表明（表 &），’* !!"# $% I,0. 对 ,341 8,和 ,0D. 8,培养的 34 8BFG-H=活性抑制程度均在 .J左 右，) !!"#$ % ,-,.对 34 8BFG-H=活性的抑制程度为
.J左右（,341 8,）和 )J左右（,0D. 8,），表明水稻叶
片膜微囊体中几乎没有受到液泡膜和线粒体膜的污
染；) !!"# $% ,-&?"01 抑制程度为 2J（,341 8,）和 KJ（,0D. 8,），说明膜微囊体中含有一定程度的酸 性磷酸酶。但是，*+) !!"#$ % ,-./01 对 34 8BFG-H=
活性的抑制程度分别达到 K&J（,341 8,）和 K.J
（,0D. 8,）左右，说明在膜微囊体中主要是以细胞膜
为主。为了避免线粒体膜、液泡膜上 34 8BFG-H=以
及酸性磷酸酶可能带来的影响，在测定细胞膜 34 8
BFG-H=水解活性的各种指标中均加入 ’* !!"# $% I,0.、) !!"#$ % ,-,. 和 ) !!"# $% ,-&?"01，以保证 测定结果的可靠性。 表 #$%&’ +$和$()* +$培养的水稻叶片中游离$%&’ 和
$()* 含量比较（!, - ,，./） 01234 # 054 67891:;<7= 7> ?;<<76;1@;A4$%&’ 1=? $()* 67=@4=@< 7> 341A4< 7>$%&’ +$7:$()* +$ >4? :;64
处理
F7=-L!=,341 含量
59HH":9-L9M= ,341
:",0D. 含量
59HH":9-L9M= ,0D.
:",341 8, &2*+.2 > ))+11 - N+)K > *+1& -
,0D. 8, )1.+&) > ’+.. O )))+)E > 2+N1 O
注（,"L=）：不同字母表示在 ! C *+*’水平上的显著性差异，下同
59PP=7=表 ! $%&’ +$与 $()* +$培养的水稻叶细胞膜微囊体中对不同抑制剂敏感的 %& +B0C1<4活性
01234 ! D=5;2;@7:+<4=<;@;A4 B0C1<4 16@;A;@E 1<<76;1@4? F;@5 931<81 8482:1=4 >:78 341A4< 7> $%&’ +$ 7: $()* +$ >4? :;64
处理 BFG酶活性 BFG-H= -:L9M9LU［G9!!"# $（!Q·!9<），V7"L=9<］
F7=-L!=WI *+’.N > *+*’E（)**J） *+K1) > *+*1K（)**J）
’* !!"# $% I,0. *+’&& > *+*’)（.J） *+K)E > *+*N*（.J） ) !!"#$ % ,-,. *+’&) > *+*N1（.J） *+K.’ > *+*1E（)J）
) !!"# $% ,-&?"01 *+1EN > *+*1’（2J） *+22& > *+*NN（KJ） *+) !!"#$ % ,-./01 *+*E2 > *+**1（K&J） *+)11 > *+*)’（K.J）
注（,"L=）：对抑制剂敏感的活性是指对照的活性减去加有抑制剂时的活性。括弧内为对抑制剂敏感的活性与对照活性的百分比。不同抑
制剂（包括对照）条件下的 34 8BFG-H=活性均于 V3 N+*下测定的。FS= 99< LS= V7=H=<:= "P 9O7-<= 34 8BFG-H= -:L9M9LU X<;=7 ;9PP=7=!"* $%&’ +$和 $()* +$培养的水稻叶细胞膜 %& +
B0C1<4水解活性比较
图 )看出，在离体条件下，测定所用缓冲液的
V3值为 ’+N!N+K 的范围内，,0D. 8,培养的水稻叶
细胞膜上 34 8BFG-H= 活性都高于 ,341 8, 培养的。
而且 2 组测定值之间差异均达显著水平（ ! C
*+*’）。此外，,341 8,和 ,0D. 8,培养的水稻叶细胞
膜 34 8BFG-H=最高 V3值均为 N+&。
!"’ $%&’ +$和 $()* +$培养的水稻叶细胞膜 %& +
B0C1<4的 !81G与 "8比较
在 *!1***!!"# $% BFG范围内，底物浓度达到 最高时，,341 8,和,0D. 8,培养的水稻叶细胞膜 N12 植 物 营 养 与 肥 料 学 报 )’卷 图 ! 不同 "#下$#%& ’$与$()* ’$培养的水稻叶细胞膜 #% ’+,-./0活性的比较 1234! 567".82/69 6: ;<0 "=./7. 707>8.90 #% ’+,-./0 .?;2@2;20/ 6:$#%& ’$68$()* ’$:0A 82?0 =0.@0/ B9A08 A2::0809; "# /6=B;269/ ［注（!"#$）：细胞膜 %& ’()*+,$活性为加入 - .."/ 0 1 !+!2，- .."/ 0 1 !+34"56和 78 .."/ 0 1 9!52 后于 28 :下测定的。);$ =>+?$%& ’()*+,$ +@#ABA#C D+, +?+/CE$F A? #;$ <>$,$?@$"G - .."/ 0 1 +EAF$，-
.."/ 0 1 ."/C=F+#$+?F 78 .."/ 0 1 ?A#>+#$，+# 28: H ］
%& ’()*+,$活性都接近饱合（图 3+），表明 %& ’()’ *+,$符合典型的米氏动力学特征。根据 I+FA$’%"G,’ #$$方程对数据加以转化后，%& ’()*+,$活性与相应
的 ()*浓度比之间存在着很好的线性关系。!%&6 ’
!处理 ! J 8KLM，!5N2 ’!处理 ! J 8KLL（图 3=）。
通过计算截距和斜率获得的最大反应速度 ".+O
和 #. 表明，!5N2 ’! 培养的水稻叶细胞膜 %& ’()’
*+,$的 ".+O值为 8KLL P 8K-7显著高于 !%&6 ’!培养 的 8K7L P 8K86，是 !%&6 ’! 培养的 -KQM 倍。而且， !5N2 ’!培养的水稻叶细胞膜 %& ’()*+,$的 #.（8K6R
P 8K83）也大于 !%&6 ’!培养的值（8K2M P 8K83）。
CDE $#%& ’$和 $()* ’$培养的水稻叶细胞膜 #% ’
+,-./0的免疫印迹
图 2看出，!5N2 ’!培养的水稻叶片细胞膜 %& ’
()*+,$的免疫印迹的深度显著高于 !%&6 ’!培养的， 说明单位膜蛋白中，!5N2 ’!培养的水稻叶细胞膜的 %& ’()*+,$ 酶浓度高于 !%&6 ’! 培养。这是其水解
活性比 !%&6 ’!培养高的一个主要原因。
图 C $#%& ’$和 $()* ’$培养的水稻叶细胞膜 #% ’+,-./0的动力学特征的比较
1234C 567".82/69 6: ;<0 F290;2?/ ?<.8.?;082/;2?/ 6: "=./7. 707>8.90 #% ’+,-./0 6: $#%& ’$ 68 $()* ’$ :0A 82?0 =0.@0/
［+H ()*+,$对 ()*的依赖性 S$<$?F$?@$"G ()*+,$ +@#ABA#C "? ()* @"?@$?#>+#A"?； =H 图 +经 I+FA$’%"G,# $$方程转换图 )>+?,G">.$F G>". TAUH3+ =C #;$ I+FA$’%"G,#$$ $VW+#A"?（ ! J 8KLM，!%&6 ’!；! J 8KLL，!5N2 ’!）］ 图 * 细胞膜 #% ’+,-./0的G0/;089 H=6;免疫分析 1234* I77B96A0;0?;269 6: ;<0 "=./7. 707>8.90 #% ’+,-./0 >J G0/;089’H=6; CDK$#%& ’$和$()* ’$培养的水稻叶细胞膜质子 泵活性比较 图 6表明，细胞膜微囊体中加入4U’()*启动反 应后，吖啶橙（(5）开始猝灭，!5N2 ’!培养的水稻叶 细胞膜质子泵猝灭速率（即质子泵的速率）和最大猝 灭程度（%&浓度梯度）显著大于 !%&6 ’!培养的。这 说明 !5N2 ’!培养的水稻叶细胞膜质子泵活性高于 !%&6 ’!培养的。 * 讨论 本试验采用葡聚糖两相法提取的细胞膜纯度在 M3X左右（表 3），膜囊体中只有少量的酸性磷酸酶， R6R6期 王松伟，等：铵、硝营养对水稻叶细胞膜 %& ’()*+,$和质子泵活性的影响
图 ! "#$! %"和 "&’( %"培养的水稻叶质子泵活性的比较 )*+,! -./ 012345*617 18 9./ #$ % 3:23 409*;*9< 18 "#$! %" 15 "&’( %" 8/= 5*0/ >/4;/6 但大部分的叶细胞膜保证了细胞膜 !" #$%&’()活性
测定的准确性。*+,- #* 培养的水稻叶细胞膜上
!" #$%&’() 水解活性明显高于 *!". #* 培养的（图 /）。这可能是其单位面积细胞膜上的$%&’() 的数
量增加，或是细胞膜上存在水解效率高的 $%&’()同 工酶，或两种情况同时发生所致［//］。0)(1)23#4561的 结果（图 -）表明，$%&’()酶蛋白浓度高是 *+,- #*培
养的水稻叶细胞膜上的 !" #$%&’(活性比 *!". #*培 养高的一个主要原因。由于细胞膜 !" #$%&’()由一
个多基因家族编码，也可能在外界环境的诱导下发
生特异性的表达。玉米在硝态氮诱导下，根系中两
个 !" #$%&’() 基因 !"#$ 和 !"#% 呈特异性表
达［7］；番茄叶片在菌根侵染时，其质膜 !" #$%&’() 同工酶发生改变［89］。从生理测定的结果来看， *+,- #*培养的水稻叶片细胞膜 !" #$%&’()的 &:值
明显大于 *!". #*培养（图 8）的，但二者 !" #$%&’() 活性的最佳 ;!都是 <=8（图 /）。说明两者的 !" #$%&’()同工酶的组成并没有发生变化（活性最佳 ;!
值未变），但是其比例可能有差异（因 &: 值有变
化）。由于水稻中有 /9个 !" #$%&’()基因［89］，进一 步的证实需要分析各个基因的表达情况。 本试验结果还表明，*+,- #*培养的水稻叶质子 泵活性明显高于 *!". #*培养的，但并未超越细胞膜 !" #$%&’()水解活性的增加程度。由于细胞膜 !" #
$%&’()的 >末端有一自抑制区域，受梭壳菌素等物 质刺激后发生转录后调控，从而提高 !" #$%&’()和
质子泵活性。具体特征表现为 ’:’?增加而 &: 降
低，最佳 ;!值偏向碱性范围［8/］。而质子泵活性变
化与此不符，这就排除了 !" #$%&’()的 >末端发生 变化的可能性（图 /、表 /、图 .）。因此可以认为， *+,- #*培养的水稻叶细胞膜质子泵活性高于 *!". # *可能是由于细胞膜 !" #$%&’()浓度高造成的（图
-）。
*+,- #*培养的水稻叶中 *+,- 含量是 *!". #*培
养的 /7倍左右。由于 *+,- 的运输是与细胞膜 !" #
$%&’()所产生的质子驱动力相偶联的主动运输［.］， 而 *!". 是与细胞膜 !" #$%&’()形成的膜电势相偶
联的被动运输［@］，转运 *+,- 比 *!". 需要更多的能
量。所以可以认为，正是由于 *+,- #*培养的水稻叶
片细胞膜 !" #$%&’()蛋白大量表达（图 -），以致其 水解活性和质子泵活性高于 *!". #*培养，这可能与 其吸收大量 *+,- #*有关。 参 考 文 献： ［/］$21A B，C2)3D)5 &E *F12FGFH’1F63 ’3I I)3F12FGFH’1F63 F3 1A) 2AFD6(;A)2) 6G
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