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,2016,36(5):0865-0873
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DENGYuqing,ZHAIYushan,PENGLei,DONGMeng,XUQian,
CHENGGuangyuan,LINYanquan,XUJingsheng
(FujianAgricultureandForestryUniversity/KeyLaboratoryofSugarcaneBiologyandGeneticBreeding,MinistryofAgricul
ture,Fuzhou350002,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Auxinbindingprotein(ABP)playsanimportantroleinauxinsignaltransductionandtheregula
tionofplantgrowthanddevelopment.Tostudythefunctionandexpressionfeaturesofthe犃犅犘genein
sugarcane,weclonedan犃犅犘genefromasugarcanecultivar(犅犪犱犻犾犪)usingRTPCR.Sequenceanalysis
showedthatitcontaineda615bpopenreadingframe(ORF)andencodedadeducedproteinof204amino
acids.Itwasdesignatedas犛犮犃犅犘4becauseofthemultiplesequencealignmentandphylogenetictreeanal
ysisresultsrevealedthatithadcloserrelationshipswith犃犅犘4in犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉and犣犲犪犿犪狔狊.Itwas
clonedintotheprokaryoticexpressionvectorpGEX6P1andexpresseda22.5kDproteinsuccessfulyin
犈.犮狅犾犻.SubcelularlocalizationassayshowedthatScABP4proteinislocatedinthereticularofcytoplasm
andonthecytomembrane;proteinstructurepredictionshowedthatithasasignalpeptide,speculateit
maybestoredintheendoplasmicreticulum,andexertitsfunctionontheplasmamembrane.qRTPCR
showedthat犛犮犃犅犘4expressedinbud,root,stemandleafinsugarcanewiththehighestexpressionlevel
inbud.犛犮犃犅犘4wasupregulatedbyIAAordarktreatmentsindicatedthat犛犮犃犅犘4mightparticipatein
sugarcaneresponsestoauxin,andinvolvedinlightsignalingpathway(s).Inaddition,theexpressionof
犛犮犃犅犘4insugarcanewasinducedbyABA,JA,SAandCuCl2butwasdownregulatedbyCdCl2.These
resultsindicatedthat犛犮犃犅犘4mightinvolveinthesugarcaneresistancetodisease,osmoticandheavymet
alstress,whichprovidesthebasisforfurtherstudyingthefunctionsof犛犮犃犅犘4.
犓犲狔狑狅狉犱狊:sugarcane;auxinbindingprotein;homologouscloning;expressionanalysis
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dtu.dk/Services/SignalP/)á÷ScABP4~[]
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1.2.3 犛犮犃犅犘4 ]^BC à÷[3[
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10mLLBå>ÜÄ7(!50mg·L-1Amp)37
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0.6;NÞOb1mmol·L-1[IPTG,37℃
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4℃、8000犵QR10minyÁP2>;NÞ30μL
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ú$¸Primer
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Forwardprimersequence(5′→3′)
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Reverseprimersequence(5′→3′)
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Strategy
ScABP4 GGAGAACATGGTGCGTGAACTAC GCAGGAAACACTTGTGACCTAGAG 7iGenecloning
ScABP4Q CTGCTGCCTCGTTCCTC TTCCCTCCCATAGTTGCT ÝÞÆÁ RealtimePCR
GAPDHQ CACGGCCACTGGAAGCA TCCTCAGGGTTCCTGATGCC ÝÞÆÁ RealtimePCR
ScABP4PE CGCGGATCCATGGTGCGTGAACTAC CCGCTCGAGGAGTTCATCTTTTGGTGC P»ª¼Prokaryoticexpression
ScABP4SL GCTCTAGAATGGTGCGTGAACTACC CGCGGATCCGAGTTCATCTTTTGGTG ÃÄÅÆÇSubcelularlocalization
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1.2.5 犛犮犃犅犘4,=BCK\ û Trizol$
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¾ÆÁPCR,ÙâØÚ3M*+tX。
!50 ℃ 2min(gÑaiìåNÞ
UNG{dÍ);95℃10min(,1犜犪狇DNAh
}{
);95℃">15s,60℃#$1min,40&J;
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1)。\ÿ÷¥U,7i ORFz
615bp,204 7¡(l2)。 NCBI
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(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[
BlastN9K£¤U,7iQ)(犛狅狉犵犺狌犿犫犻
犮狅犾狅狉)、®¯(犣犲犪犿犪狔狊)¥nV(犛犲狋犪狉犻犪犻狋犪犾犻犮犪)
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94%¥87%。ª«7iMNHz{|}~
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Bank,peKT880509。
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(Asp+Glu)22,Ò+qr7(Arg+Lys)17,¤v
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Predá÷ª«,ScABP4~Ñ2zÍ|ºù,¹
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Fig.1 PCRamplifiedproductsof犛犮犃犅犘4
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;ªOgV
l2 MN犛犮犃犅犘47i[cDNAí¹öe[ 7¡
Underlineindicatestranslationinitiationsite;indicatesstopcodon
Fig.2 Thenucleotideacidsequenceof犛犮犃犅犘4anditsdeducedaminoacidsequence
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BoxesA,BandCcorrespondtohighlyconserveddomainsamongalplantABP;KDEListheCterminalsequencewhichmay
functionasasignalforretainingtheproteininthelumenoftheER
Fig.3 SimilaritycomparisonofScABP4aminoacidsequencesamongsugarcaneandotherplantspecies
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l4 ¤($7É犃犅犘7i 7¡[?¦§¨©
Numbersabovebranchesontheleftindicatebootstrapvalues
of1000replicates;Thescalebarrepresentsgeneticdistance;
TheaccessionNo.isgiveninbrackets
Fig.4 Phylogenetictreeofaminoacidsequences
encodedby犃犅犘geneamongdifferentplantspecies
M1.15000+2000bpUVÁ~;M2.100bpUVÁ~;
1.tjÊDF{Eü/
l5 pGEX6P1ScABP4tjÊDF{EGÆ
M1.15000+2000bpmarker;M2.100bpmarker;
1.EnzymedigestionfractionsofpGEX6P1ScABP4
Fig.5 PCRidentificationofpGEX6P1ScABP4
with犅犪犿HI/犡犺狅I
96850 @AB,
:MNHz{|}~犛犮犃犅犘47i[Qª¼
13~20 7¡r7[BoxA、BoxB、BoxC3)
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induction;2.pGEX6P1afterinducingfor8h;3.pGEX6P
1ScABP4withoutinduction;4-7.pGEX6P1ScABP4after
inducingfor2,4,6and8h,respectively
Fig.6 AnalysisofexpressedproteinsbySDSPAGE
A.GFP¤í;B.GFP¨½[««;C.GFP¨½[â¬>;D.GFP¨½[N«;E.ScABP4GFP;F.ScABP4GFP[««;
G.ScABP4GFP[â¬>;H.ScABP4GFP[N«
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A.GFPcontrol;B.GFPvisionundernaturallight;C.Chlorophylof35SGFP;D.GFPoverlappedvisionofA,B,andC;
E.ScABP4GFP;F.ScABP4GFPvisionundernaturallight;G.Chlorophylof35SScABP4GFP;
H.ScABP4GFPoverlappedvisionofE,FandG
Fig.7 SubcelularlocalizationofScABP4fusedwithGFPintheepidermalcelsof犖.犫犲狀狋犺犪犿犻犪狀犪(bars=50μm)
078 ! " # $ % & 36ë
2.4 犛犮犃犅犘4>_`abcKàPsortõká÷,ScABP4~ÆÇÉØÊ
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Thedifferentsubscriptionswithdifferentlettersindicate
significantdifference(犘 <0.05)
Fig.8 Tissuespecificexpressionanalysisof犛犮犃犅犘4
fromdifferenttissuesinsugarcane
2.5 犛犮犃犅犘4,=>BCK犛犮犃犅犘4D7z0MN[¤(jÕãѪ
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Thedifferentlowercaselettersindicatesignificantdifferenceofthesametreatmentduringdifferent
treatmenttimes(犘 <0.05)
Fig.9 qRTPCRanalysisof犛犮犃犅犘4expressionindifferenttreatments
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