全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"#)!1
基金项目$上海市自然科学基金"
#%23#&!1,""
#&上海市科学技术委员会课题"
#&42!!$"&""
#
作者简介$陈雪菲"
#1($
#!女!在读博士研究生!主要从事蕨类植物生物学研究
5)67.8
$
9:;
(
!!,
!
#$%+9<6
"
通信作者$曹建国!教授!主要从事蕨类植物生殖发育和蕨类植物资源开发与利用的研究
5)67.8
$
97<#"#
!
/=0>+?@>+90
水蕨中心体蛋白基因的克隆与原核表达
陈雪菲#!王
!
尧#!秦召远#!王全喜#!!曹建国#"
"
#
上海师范大学 生命与环境科学学院!上海
!""!%&
&
!
上海资源植物功能基因组学重点实验室 上海辰山植物园!上海
!"#$"!
#
摘
!
要$蕨类植物的精子形成是一个运动细胞器重新发生的过程!但对其精子发生的分子机制仍不甚了解中心
体蛋白"
9?0AB.0
#是定位于细胞中心体上的一种高度保守的钙结合蛋白!被认为可能是最早参与运动细胞器发生的
蛋白质克隆鉴定
9?0AB.0
蛋白为进一步分析蕨类精子发生的分子机制奠定基础该研究从蕨类模式植物水蕨
"
!"#$%&

%"#()%*$+(,%#&(-")
#中克隆到了水蕨
9?0AB.0
基因"
!%!./
#!其
94CD
序列全长为
#",,E
F
!结构分析表明
!%!./
基因属于
5G)=70@
超家族的
9?0AB.0
基因
H?0AB.0
的系统树分析发现!藻类)蕨类以及动物等具鞭毛游动
精子的生物聚为一支!而被子植物聚为另一分支!表明
9?0AB.0
的功能可能与运动细胞器鞭毛发生有关原核表达
和
I?/A?B0E8分析表明!
%!./
基因表达的蛋白能与人源
9?0AB.0
抗体发生结合!这一结果证实克隆到了
9?0AB.0
基因
关键词$中心体蛋白&克隆&原核表达
中图分类号$
J,(*
&
J,($
文献标志码$
D
$%"&(&!)*"+(*
,
"-#./0
1
*22#"&"3$&-*#&4&
3*"5-67*&1)($#&
2
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9?0AB.0
F
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9?0AB.0
&
98<0.0
S
&
F
B<^7B
P
F
B?//.<0
!!
中心体蛋白!即
9?0AB.0
最初是从绿藻"
2"%#$3
)"+4())%#($%$
#中分离得到的一种钙结合蛋白!属于
高度保守的
5G)=70@
蛋白超家族*#+!现已知
9?0AB.0
蛋白存在于从藻类)酵母到人类等所有生物的微管
组织中心中*!+衣藻中
9?0AB.0
主要参与鞭毛形成!
是核
)
基体连接纤维的一个主要成分*%)&+芽殖酵母
9?0AB.0
蛋白对细胞周期依赖性的纺锤体复制起重
要作用*+
5BB7E<8>
等从人中克隆及鉴定到了
%
个
9?0AB.0
同源蛋白*$),+!其中
K/9?0%
在中心体复制中
具有重要作用*(+高等植物的
9?0AB.0
蛋白研究比
较少!最早在拟南芥"
5#$6(-&

)()%*$+($0$
#和烟草
"
/(,&%($0$%$6$,74
#中 获 得 了
9?0AB.0
同 源 基
因*1)##+!但有关它们的功能未见报道随后
X8.0^
等*#!+在异形孢子蕨类苹"
8$#)(+"$1")%(%$
#中克隆
得到
813,"0%#(0
!这个基因在苹小孢子发育阶段就
已经发生转录并且以蛋白形式储存于未萌发的孢子
中!此后在雄配子体发育和精子发生过程中!
9?0AB.0
蛋白参与了运动细胞器的形成过程*#!+综上所述!
9?0AB.0
蛋白在高等生物中主要参与中心体复制以
及细胞分裂过程!而在低等生物中主要参与运动细
胞器鞭毛的发生蕨类植物是高等植物中的一个特
殊类群!其精子发生是一个运动细胞器重新形成的
过程!
9?0AB.0
蛋白极有可能参与了这一过程本研
究从蕨类模式植物水蕨*
!"#$%&

%"#()%*$+(,%#&(-")
"
T+
#
ZB<0
S
0+
+中克隆到
9?0AB.0
基因"
!%!./
#并
对其进行了验证!这对阐明
9?0AB.0
在蕨类精子发生
中的功能以及进一步研究
9?0AB.0
蛋白参与运动细
胞器形成的过程和分子机制奠定了基础
#
!
材料和方法
<+<
!
材
!
料
以无菌培养
%
周左右的水蕨成熟雄配子体为实
验材料载体
F
5\)%!7
购买于北京全式金基因有
限公司菌株购买于北京博大泰克生物科技有限公
司人源
9?0AB.0
蛋白的鼠抗购买于上海熠晨生物
科技有限公司
<=>
!
1#156
基因的克隆
按康为世纪植物
3CD
提取试剂盒说明书提取
水蕨配子体总
3CD
采用
O0U.AB<
S
?0
公司的
V>)
F
?BV9B.
F
A
\`
3"
反转录试剂盒反转录获得
94)
CD
根据
M?0Z70^
已经公布的
9?0AB.0
基因!进行
同源性比较!获得较为保守的区域"约
%""E
F
#根
据保守区的已知序列!设计保守区扩增引物"
*a)
MDHDH\MD\MMM\HDMMHDH)%a
和
*a)HDDMD)
MD\MD\\MD\MDDMH)%a
#通过
YH3
反应获
得保守片段!其反应体系及条件为$
#"bTDYH3
Z>;;?B*
#
T
!
TD2$
9
酶
"+*
#
T
!
@C\Y .`:(
#
T
!
模板
#
#
T
!引物各
*
#
T
!加
@@K
!
Q
补至
*"
#
T
反
应程序为$
1&c
预变性
*6.0
&
1&c
变性
%"/
!
*1+1
c
退火
%"/
!
,!c
延伸
#6.0
!共
%*
个循环&
,!c
延
伸
#"6.0
获得的保守片段由北京六合华大公司
完成测序!根据
CHZO
的比对结果!证实该保守片段
与其他物种的
9?0AB.0
基因具有同源性根据
O0)
U.AB<
S
?0
公司的
M?0?379?B
\`
X.A
说明书分别设计
*a
末端和
%a
末端引物"
*a)\HDMMDDMMHM\\HD)
DMH)%a
!
*a)H\\MDDHMHH\\HH\MD\H\HH)%a
#!
采用
3DH5
技术分别扩增目的基因的
%a
末端和
*a
末端!测序拼接获得完整的
!%!./
基因
94CD
进
一步对获得的全长
94CD
的
Q3G
区域进行分析!
设计含酶切位点的引物"
*a)HH\HMDMD\M\H)
MDMH\\HDMMDDDMM\M)%a
!框内为
:*&
$
酶
切位点&
*a)HMMD\HHMH\DDDDMDMMH\\M)
\\\\H\\HD\M)%a
!框内为
;$4K
$
酶切位点#!
扩增
HAH5C
蛋白的编码序列
<=?
!
1#156
基因原核表达载体的构建
通过琼脂糖凝胶电泳检测
!%!./
编码区
YH3
产物!采用
4CD
纯化试剂盒进行目的片段回收
使用限制性内切酶
;$4K
$
和
:*&
$
对测序正确
的目的基因和原核表达载体"
F
5\)%!7
#分别双酶
切!对酶切后的质粒和
YH3
产物分别进行回收!按
#d&
的比例用
&
4CD
连接酶在
#$c
连接过夜
用连接产物转化
4K*
%
感受态细胞!涂板挑取单克
隆!测序检测重组目的基因提取转化成功的重组
质粒!命名为

.2%!$3!%!./

<=@
!
1#156
基因原核表达
将

.2%!$3!%!./
重组质粒转化
.<,&+(ZT!#
菌株!挑选单个菌落进行扩大培养在菌液
Q4
$""
达到
"+$
左右时!加入适量诱导剂
OY\M
!
%,c
继续
振荡
&=
!每小时取
#
次菌液"
+*6T
#!离心收集菌
体!使用超声仪进行超声破碎!离心后分别取上清和
沉淀制样并通过
V4V)YDM5
凝胶电泳鉴定表达结
果为了进一步证实该蛋白属于
9?0AB.0
蛋白!对上
述诱导重组蛋白样品进行
I?/A?B0E8实验验证
一抗采用的是人源
9?0AB.0
蛋白的鼠抗!稀释倍数是
#d#"""
&二抗选择的是辣根过氧化物酶标记的羊抗
鼠
O
S
M
!稀释倍数是
#d!*""
最后!按辣根过氧化
物
4DZ
显色试剂盒说明书进行显色及终止反应
*&&
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
陈雪菲!等$水蕨中心体蛋白基因的克隆与原核表达
<=A
!
1#156
基因的生物信息学分析
对测序获得的
!%!./
基因所编码的氨基酸序
列同
M?0Z70^
中已知的
9?0AB.0
氨基酸序列进行相
似性比对利用
H8>/A78L
和
`5MD*+"
软件构建
CR
系统树
!
!
结果与分析
>=<
!
1#156
基因的克隆与序列分析
根据苹
813,"0%#(0
基因保守区设计引物扩增
获得的水蕨
!%!./
基因保守区序列!经克隆测序
获得长度为
%&!E
F
的序列利用
3DH5
技术分别
对
!%!./
基因
*a
末端和
%a
末端进行扩增!经克隆
测序去除引物接头后分别获得
*a
末端
*"&E
F
)
%a
末
端
,%&E
F
的序列对获得的序列进行拼接!设计全
长引物获得
!%!./
基因的全长
94CD
由图
#
可
知!扩增序列长度大约
#"""E
F
!与目的基因的序列
长度相似
将目的基因片段切胶回收后连接至克隆载体!
转化挑选阳性菌落测序!测序结果比对后发现其与
其他物种的
9?0AB.0
基因同源!序列全长为
#",,E
F
"图
!
#通过在
CHZO
中进行
Z87/A0
分析!结果表
明
!%!./
序列与苹)小立碗藓)衣藻)江南卷柏具
有较高相似性!均在
("e
左右该基因包含一个
*#"E
F
开放阅读框!编码具有
#,"
个氨基酸残基的
蛋白质!使用蛋白质功能结构域分析软件
V` D3对氨基酸序列进行分析!结果显示
HAH5C
具有
&
个
钙结合位点"
5G)=70@
#!这
&
个
5G)=70@
分别位于
第
%"
&
*(
)
$$
&
1&
)
#"%
&
#%#
和
#%1
&
#$,
氨基酸!
由此可以推断
!%!./
基因属于
5G)=70@
超家族
>=>
!
1#156
系统树构建
M?0Z70^
已公布
9?0AB.0
基因序列的物种主要
#+4T!"""
&
!+
阴性对照"无模板#&
%+!%!./
基因全长
94CD
图
#
!
!%!./
基因全长
94CD
序列
YH3
电泳
#+4T!"""
&
!+C?
S
7A.U?9<0AB<8
"
[.A=<>AA?6
F
87A?/
#&
%+!%!./94CD
G.
S
+#
!
\=?
S
?8?8?9AB<
F
=S
?0?98<0?@;B<694CDE
P
YH3
包括蕨类植物苹"
8<1")%(%$
#和江南卷柏"
="+$
>
(3
0"++$4&"++"0-&#
??
((
#&藻类植物衣藻"
!*+$4
@
-&3
4&0$)#"(0*$#-%((
#和团藻"
A&+1&B,$#%"#(;+0$3
>
$#("0)()
#&高等植物拟南芥"
5<%*$+($0$
#)烟草
"
/<%$6$,74
#和可可"
2*"&6#&4$,$,$&
#&人"
C&4&
)$

("0)
#&鼠"
87)47),7+7)
#等从构建的系统关
系"图
%
#可知!这
#"
个物种的
9?0AB.0
基因分成两
大支!第一大支包括藻类植物的团藻和衣藻!蕨类植
物苹)卷柏和水蕨!哺乳动物人和鼠!其中水蕨)苹和
卷柏聚在一起!其自展支持率达到
1$e
!体现了它
们之间较近的亲缘关系这几种蕨类又与
!
种藻类
聚在一起!它们都属于鞭毛类植物&这些鞭毛类植物
的
9?0AB.0
基因又与哺乳动物人和鼠的聚为一支!且
自展支持率达到
#""e
!从产生的精子特征上来看!
该支物种的共同特征是都能够产生具鞭毛的游动精
子!因此!
9?0AB.0
的功能可能与鞭毛发生有关第
二大支包括拟南芥)烟草和可可!这些物种属于被子
植物!在整个生活史过程中都不产生游动细胞!因
此!被子植物中
9?0AB.0
的功能可能发生了改变
粗体加下划线
D\M
表示起始密码子!粗体加下划线
\DM
表示终止子!方框区域为推测的
5G)=70@
结合域
图
!
!
!%!./
基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
\=?D\M.0.A.7A.<09<@<0./.0E<8@70@.0@.97A?@E
P
>0@?B8.0?
&
A=?\DMA?B6.07A.<09<@<0./.0E<8@70@.0@.97A?@E
P
>0@?B8.0?+\=?;B76?//=<[
F
>A7A.U?5G)=70@@<67.0/
G.
S
+!
!
C>98?]
>?09?<;!%!./
70@A=?@?@>9?@76.0<79.@/?
]
>?09?
$&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图中分支点的数字表示基于
#"""
次重复该节点的自展支持率&标尺代表遗传距离
图
%
!
水蕨与其它物种
9?0AB.0
基因序列系统演化关系
\=?;.
S
>B?7AA=?0<@?//=<[/A=?E<F
U78>?E7/?@<0#"""B?
F
8.97A.<0/
!
70@A=?/978?B?
F
B?/?0A/A=?
S
?0?A.9@./A709?
G.
S
+%
!
Y=
P
8<
S
?0?A.9B?87A.<0/=.
F
<;A=?9?0AB.0
S
?0?/?
]
>?09?/76<0
S
!<%*$+(,%#&(-")70@F
?9.?/
>=?
!
1#156
基因原核表达载体的鉴定
利用引入酶切位点
;$4K
$
和
:*&
$
的引物
将
!%!./
连入
F
5\)%!7
表达载体!重组质粒经
;$4K
$
和
:*&
$
酶切后获得大小约
$ E^
的载体
片段和
*""E
F
左右的插入片段"图
&
#!对阳性克隆
进行测序测序结果表明获得克隆片段长度为
*#"
E
F
!与
!%!./
基因序列完全一致!即已成功克隆了
!%!./
基因并构建了表达载体
>+@
!
目的蛋白的原核表达与纯化
将
F
5\%!7)HAH5C
重组质粒转入
ZT!#
空菌
中!用
# 66<8
%
TOY\M
诱导表达后进行
V4V)
YDM5
鉴定!得到有明显诱导趋势的条带"图
*
!
D
#!
大小在
%( 4^
左右!在线软件
YB"
=AA
F
$%%
[?E+?:
F
7/
P
+S
%
F
BF
7B76
%#预测的目的蛋白
HA)
H5C
大小约为
#1 4^
!此结果与预测的结果相符
>+A
!
蛋白质印迹实验鉴定
经
OY\M
诱导表达的重组蛋白按常规方法纯化
后经
V4V)YDM5
分析!用半干法移至
Yf4G
膜上!
用
*e
脱脂奶粉封闭后!依次加入稀释的人源
9?0)
AB.0
蛋白的鼠抗和羊抗鼠
O
S
M
二抗进行孵育!最后
使用显色试剂盒显色结果如图
*
!
Z
所示!表明克
隆并表达的
HAH5C
蛋白能够与人源
9?0AB.0
蛋白抗
体杂交!克隆出来基因是水蕨的
9?0AB.0
基因
%
!
讨
!
论
H?0AB.0
蛋白是中心体中的钙调蛋白!在动物)
植物)微生物中均有广泛的分布我们从水蕨配子
`
#
+4T!"""
&
`
!
+

C(0@
"
&
#+!%!./
基因
YH3
产物&
!+
F
5\%!7)HAH5C;$4K
$
%
:*&
$
双酶切产物&
%+
F
5\%!7;$4K
$
%
:*&
$
双酶切产物&
+
F
5\%!7)HAH5C
;$4K
$
单酶切&
*+
F
5\%!7)HAH5C:*&
$
单酶切
图
&
!
重组质粒
F
5\%!7)HAH5C
酶切鉴定
`
#
+4T!"""
&
`
!
+

C(0@
"
&
#+YH3
F
B<@>9A<;HAH5C
&
!+
F
5\%!7)HAH5C@.
S
?/A?@E
P
;$4K
$
%
:*&
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9?0AB.0
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基因与其他物种的
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又与
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种藻类聚为一支!它们都属于鞭毛类植物!然
而这些鞭毛类植物的
9?0AB.0
基因又与人和鼠的
9?0AB.0)#
!
9?0AB.0)!
聚为一支!而人和鼠都能产生具
鞭毛的游动精子!表明
9?0AB.0
在生物精细胞发生上
具有重要的作用!特别是在细胞运动细胞器和运动
器官的发生上具有重要作用
本课题组在水蕨蛋白组学研究中发现
9?0AB.0
在水蕨雄配子体精子器发生阶段特异表达!是雄配
子体内新产生的一种蛋白*#%+!由此可推断
9?0AB.0
蛋白参与了精子的发生过程!其功能与水蕨精细胞
运动细胞器的发生有关尽管高等被子植物如拟南
芥)烟草和可可也具有
9?0AB.0
基因!但系统分析表
明被子植物的
9?0AB.0
基因聚为单独一支!与鞭毛类
生物
9?0AB.0
基因关系较远!可能表明被子植物
9?0)
AB.0
基因在演化过程中发生了功能的改变!不再参
与精细胞的发生!因为被子植物在整个生活史过程
中都不产生游动细胞!
9?0AB.0
基因在进化过程中的
分化及功能的改变也值得深入研究
参考文献!
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