全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
#
#$
""#&""!!
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""()"!$
"
!"#$
#
"#(""#&("*
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"+*&"&
%
,
+-../+#"""()"!$+!"#$+"#+""#&
收稿日期$
!"#)("0("*
&修改稿收到日期$
!"#)(##("1
基金项目$福建省农业科技平台"
!""02!""#
#&国家科技支持计划项目"
!""*345"*3"#
#
作者简介$练从龙"
#100
#!男!硕士!主要从事花卉与景观园艺生物技术研究
6(78-9
$
**"%*1#0%
!::
+;<7
"
通信作者$赖钟雄!博士!研究员!博士生导师!主要从事园艺植物生物技术与遗传资源
6(78-9
$
98-=>"#
!
#&%+;<7
荔枝古树胚性愈伤组织
1"23
!
4/+0,5$
基因启动子的克隆及功能验证
练从龙!卢秉国!赖钟雄"!冯
!
新!林玉玲!陈裕坤!张梓浩
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%$"""!
#
摘
!
要$以荔枝古树(宋荔)胚性愈伤组织为材料!采用接头染色体步移法!分离获得
!"#$
%
%&()*%
启动子片段长
度为
#)!&?
@
!命名为
+,-!"#(*%
"
AB/38/C
登录号$
DE&*!#0&+#
#生物信息学分析表明!该启动子含有多个逆
境应答元件*激素应答元件*胚乳特异表达元件!且可能受
FGDH
和
IH3
等转录因子调控通过双酶切方法!以
JK替换载体
@
M4I3O4#%"#
上的
#./0%$(
启动子!构建了重组质粒
@
#%"#(
@
K!并成功转化
农杆菌
6Q4#"$
和
AR%#"#
注射烟草的瞬时表达分析表明!该启动子片段可以驱动下游报告基因表达转化拟南
芥分析表明!该启动子驱动的下游
12(
可以在拟南芥的根*茎*叶中表达!且可响应
28M9
*
J6A(&"""
*
434
*
IBS4
和损
伤等非生物胁迫研究表明!荔枝古树
!"#$
%
%&()*%
可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径
关键词$荔枝古树&胚性愈伤组织&
#$
%
%&()*%
&启动子&功能验证
中图分类号$
T*0$
&
T*0&
文献标志码$
4
%&"#
(
)!*+,-#")&.)&
/
0#0"11"23
%
4/+0,5$23"4"-53
13"46473
/
"
(
5#,%)&+0"1-85.,#5-9#-,8#:355
LO42MU
9U
!
LP3-/
UU
V<
!
L4OWXU
>-U
"
!
E62AY-/
!
LO2HV9-/
U
!
MQ62HVCV/
!
WQ42AW-X8<
"
O/.Z-ZVZB<[QU!
EV
,
-8/4
U
K-;V9ZVKB8/]EP/-^BK.-Z
!
EV=X!
MX-/8
#
.70-3),-
$
O/ZX-.B>
@
BK-7B/Z
!
ZXB#)!&?
@@
K<7U
7B/Z<[!"#$
%
%&()*%[K<7B7?K
<
U
B/-;;89V.<[
ZXB8/;-B/Z9-Z;X-ZKBB
+
NU
9-
,
_X-;X/87B]+,-!"#(*%
"
AB/38/C
$
DE&*!#0&+#
#
_8.;97B8/.<[
8]8
@
ZBK;XK<7<.<7B_89C-/
U
7BZX<]+`XB?-<-/[.-..X<_B]ZX8ZJK?BK<[B/^-K@
!
X@
!
B/]<.
@
BK7B>
@
KB..-8/]89.<7-
U
XZ?BKB
U
V98Z-IH38/]FGDHZK8/.;K-
@
Z-@
98/ZB>
@
KB..-@
#%"#(
@
K@
98;B%$N
@
K<7@
M4I3O4#%"# B^;(
ZV.-/
U
ZXB]U
B.ZB]7BZX<]8/]ZXB/ZK8/.[BKKB]-/Z<3
4
,-5."67,8$9.ZK8-/6Q4#"$8/]
AR%#"#+EVKZXBK7!
ZK8/.[.-..X<_B]ZX8ZJK@
K<7?
ZXB-/[B;(
Z-@
U
B/BB>
@
KB..-!
.ZB7.8/]
9B8^B.?
3
4
,-5."67,8$9(7B]-8ZB]ZK8/.[;
<8<+4/].ZKB..ZKB8Z7B/Z..X<_B]ZX8ZJK<(
L;MN5%;@
!
.V;X8.28M9
!
J6A(&"""
!
434
!
IBS48/]_U
+aVK
KB.V9Z.]B7%
%&()*%7-
U
XZKB.
@
@
8KZ-;-
@
8ZB-/ZXB.-
U
/89
ZK8/.]V;Z-@
8ZX_8
.<[X;5
/
<"3!0
$
ZXB8/;-B/Z9-Z;X-ZKBB
&
B7?K
<
U
B/-;;89V.
&
#$
%
%&()*%
&
@
K<7&
[V/;Z-.-.
!!
荔枝 "
!86"=8"=8&7&<8#属无患子科
"
N8
@
-/]8;B8B
#荔枝属"
!86"=8
#!是热带亚热带地区
风光的代表性树种!也是重要的经济树种古树被
誉为(活化石)!具有较高的观赏*经济*文化价值!同
时也是一座优良种源基因库-#.+宋荔,作为荔枝古
树的代表性品种!位于福州西禅寺!历经千年!可能
是国内最高龄的古荔之一-!.+宋荔,凭借顽强的生
命力经历
)
次枯荣到目前仍长势良好!且每年仍可
结出沉甸甸的果实!其强大的生命力可算是生命的
奇迹-%.体现了其自身强大的环境适应能力!也代
表着荔枝整个生命的长期演化过程超氧化物歧化
酶"
Na5
#抗性基因作为抗氧化系统的第一道防线!
具有防御氧毒性*清除体内氧自由基等作用!在植物
抗氧化*抗逆等方面起着关键的作用-).!可能在维持
(宋荔)整个生长过程中活性氧的代谢平衡!防止其
衰老而历经千年中起重要作用
启动子作为基因表达的重要调控元件!是转录
的调控中心!指导着
G24
聚合酶与
524
模板的正
确结合!并通过活化
G24
聚合酶!募集相应的转录
因子形成特异性的转录起始复合体!进而决定转录
的方向和效率-$.&同时!启动子作为精确调控基因表
达的(开关)!直接控制着下游基因的表达!其含有的
顺式元件也直接反映了该基因的生物学功能因
此!通过对
()*
基因启动子进行研究!分析其调控
元件!可为
()*
基因的研究奠定一定的基础许
珊珊-&.对+宋荔,
()*
基因的克隆与表达进行了较
为全面的研究因此!本试验在此基础上!采用接头
染色体步移法分离获得荔枝古树
()*
基因家族
!"#$
%
%&()*%
基因的启动子!并通过转化烟草和
拟南芥对其功能进行初步验证分析!为进一步深入
研究
()*
在荔枝古树中的时空表达特性*生物学
功能以及抗逆转基因研究奠定基础
#
!
材料和方法
=+=
!
供试材料
+宋荔,胚性愈伤组织!采自福州西禅寺+宋荔,
的花药诱导而成!由福建农林大学园艺植物生物工
程研究所保存
=+>
!
方
!
法
=?>?=
!
荔枝基因组
@A.
的提取及检测
!
采用改良
M` 43
法-*.提取+宋荔,基因组
524
!并经
#+"b
琼
脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测
=?>?>
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子的克隆及测序
!
利用接头染色体步移法对荔枝
!"#$
%
%&()*%
启动子进行克隆参照
AB/<7BF89C-/
U
`I
P/-(
B^K.89C-Z
"
M9#试剂盒说明进行操作!步骤如
下$首先!对检验合格的荔枝基因组
524
分别进行
*,.
"
*
>"-G
#
*
+0$
$
和
(6$
"
)
种平末端限制酶
酶切并纯化&然后!将荔枝基因组
524
的
)
种酶切
产物分别与试剂盒中的
AB/<7BF89CBK
`I
4]8
@
(
Z连接构建
)
种
AB/<7BF89CBK
文库&最后!以
构建好的
)
种文库为模板!在
!"#$
%
%&()*%
基因
组序列"
DE&*!#0&
#靠近
$
端处设计的两条反向互
补引物分别与接头引物
4J#
*
4J!
引物配对!进行
两轮的巢式
JMG

JMG
体系及
Z_<(.ZB
@
;
;9B
程序
详见
AB/<7BF89C-/
U
`I
P/-^BK.89C-Z
"
M9#
说明书其中所用引物有
4J#
*
4J!
*
L;MN5%(
ANJ#
和
L;MN5%(ANJ!
"表
#
#
=?>?$
!
目的片段的回收*
:.
克隆与测序
!
将
JMG
扩增产物进行琼脂糖"
#+"b
#电泳检测!割胶回收目
的片段将目的片段克隆至
@
I5#0(`
载体!转化
大肠杆菌
5Q$8
并进行培养最后!
JMG
菌检后挑
取阳性克隆!送华大基因公司测序
=?>?B
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子的序列分析
!
首先!利用
2BVK892BZ_"
XZZ
@
$%%
___+[KV-Z[9
+U
%
.B
:
/
Z<<9.
%
@
K<7XZ79
#在线软件分析该启动子可能的核心启动子区
域及转录起始位点&其次!使用
J98/ZM4G6
"
XZZ
@
$%%
?-<-/[@
.?+V
U
B/Z+?B
%
_B?Z<<9.
%
@
98/Z;8KB
%
XZ(
79
%#并结合
JL4M6
"
XZZ
@
$%%
___+]/8+8[K;+
U
<+
,@
%
JL4M6
%
.-
U
/89V
@
+XZ79
#在线软件分析该启动子序列
潜在的顺式作用元件
表
=
!
启动子克隆及载体构建引物
8`?9B#
!
JK-7BK.[@
K<7U
8/] B^;Z引物名称
JK-7BK/87B
引物序列
JK-7BK.B
:
VB/;B
"
$c(%c
#
产物大小
JK<]V;Z.-=B
%
?
@
退火温度
7`
%
d
4J#
L;MN5%(ANJ#
$c(A` 44` 4MA4M` M4M` 4` 4AAAM(%c
$c(` M4MM44AAAMA` A44` 4` AA44A(%c
#&*0 &*
4J!
L;MN5%(ANJ!
$c(4M` 4` 4AAAM4MAMA` AA` (%c
$c(AM` `` M4M` A` AM` M` `` MM4M` M` M(%c
#)1# &*
@
K@
K$c(4` AA4` MMMM` 44` A4AM` A` 4`AM` AA(%c
$c(` 4MM4` AAM444` A` M`` M`A` MA4AAM` A(%c
#)"1 $1
*#
#
期
!!!!!!!!
练从龙!等$荔枝古树胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
基因启动子的克隆及功能验证
=?>?C
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子瞬时表达载体
的构建
!
首先!克隆带酶切位点的目的片段
?.9Q
"
(
@
K"
在启动子上游引物引入
?.9Q
"
"
$c(AA4` MM(%c
#酶切位点!下游引入
@"-
"
"
$c(MM4` AA(%c
#酶切位点!所设计引物见表
#
的
@
K和
@
K以含有该启动
子序列的质粒为模板!利用高保真酶
Da5(J9V.(
2B<
"
M<]B
$
Da5")#
#进行
JMG
!获得目的片段后割
胶回收!测序正确后!将该回收产物命名为
?.9Q
"
(
@
K"

其次!构建
@
#%"#(
@
K重组质粒
利用
X`BK7<
公司的
E8.Z5-
U
B.Z?.9Q
"
和
E8.Z(
5-
U
B.Z@"-
"
双酶切
@
M4I3O4#%"#
和回收产物
?.9Q
"
(
@
K"
!并分别回收
@
M4I(
3O4#%"#
的大片段和
?.9Q
"
(
@
K"
酶切的目的片段将回收的两条片段进行连接!并
转化大肠杆菌!菌液鉴定!提取该重组质粒!并进行
双酶切和特异引物
JMG
的双重鉴定!将构建成功质
粒命名为
@
#%"#(
@
K
最后!将重组质粒
@
#%"#(
@
K转
化农杆菌
6Q4#"$
和
AR%#"#
取
$
%
L
重组质粒
于
#""
%
L
的农杆菌中!充分混匀!通过冻融法转化
农杆菌-0.!并进行菌检
=?>?D
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子转化烟草的瞬
时表达鉴定
!
以不携带任何载体的空菌株
6Q4#"$
为阴性对照*
#./A%$(
启动子驱动
12(
基因的
@
M4I3O4#%"#
的
6Q4#"$
菌株为阳性对照!和携
带目的质粒的阳性
6Q4#"$
分别通过注射法注入
烟草叶片-1.!
%]
后用打孔器取下烟草叶片的注射
部位进行
APN
组织化学染色-#".鉴定
=?>?E
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子转化拟南芥的
功能鉴定
!
以
M<9V7?-8
野生型拟南芥植株为阴性对
照!以
#./A%$(
启动子驱动
12(
基因的
@
M4I(
3O4#%"#
的
AR%#"#
菌株为阳性对照和携带目的质
粒的阳性
AR%#"#
分别通过花絮浸染法转化拟南
芥-##.即将待转化的农杆菌
AR%#"#
单菌落于含
.ZKeC8/
各
#""7
U
%
L
的
$"7LH63
中!
0d
*
!$"
K
%
7-/
振荡培养&离心!收集菌体!重悬于
$b
蔗糖
悬浮液中!悬浮液浓度调至
a5
&""
为
"+0
左右&选取
花蕾期的拟南芥!将花蕾浸泡到重悬液中数秒&培养
室下黑暗保湿培养
#]
!之后正常光照生长!直至开
花收种
=?>?F
!
:
=
代转基因拟南芥筛选
!
将存放在
)d
冰
箱的
`
"
代拟南芥种子先采用
*$b
的乙醇处理
#
7-/
!后用
#"b
的
28M9a
处理
#"7-/
!期间不断振
荡!最后用无菌水漂洗种子数次进行消毒将消毒
后的种子平铺在含有潮霉素的
IN
固体培养基上!
)
d
春化
!]
后移至培养箱中正常光照萌发待长出
!
片真叶后!将植株移至营养土中正常光照生长
=?>?G
!
转基因拟南芥
HIJ
组织化学染色分析和
@A.
水平检测
!
选取部分经潮霉素筛选的转化植
株!于
APN
染色液中过夜染色后!加入
*$b
乙醇
*"d
水浴脱色至无色后!观察拍照-#".之后!每种
转基因株系分别随机选取经
APN
染色验证成功的
0
株植株!进行
524
水平的鉴定!即提取植物总
524
!采用相应启动子的载体构建引物进行目的片
段的
JMG
验证
=+>+=K
!
转基因拟南芥不同株系胁迫处理
!
选取经
APN
染色和
524
水平鉴定转化成功的转
JK<(
L;MN5%
拟南芥株系!待其莲座叶片完全展开而还
未抽薹时!分别进行
!""77<9
%
L28M9
*
#$bJ6A(
&"""
模拟干旱*
#""
%
7<9
%
L434
*
$"
%
7<9
%
LIB(
S4
和针刺叶片的损伤处理!分别在处理后的
"
*
&
和
!)X
取样!同一单株的取样根据拟南芥生长特点取
大小*长势相同的靠基部相对较大的叶片其中
28M9
和模拟干旱处理采用浇灌法!即在营养钵上分
别注入等体积配置好的溶液&
434
和
IBS4
处理采
用叶片喷施!即在处理的叶面上均匀的喷洒配置好
的液体!并以水喷洒处理为对照!覆盖保鲜膜&损伤
处理采用针刺造成叶片上等量的多个小孔伤害最
后!将采取的样本进行
APN
荧光定量活性分析-#!.
!
!
结果与分析
>?=
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子的克隆
启动子克隆结果表明!从限制性内切酶
>"-G
#
和
(6$
"
酶切的文库中!分别获得长度约
##""?
@
和
#$""?
@
的扩增条带"图
#
#测序所得实际长度
分别为
#"&!?
@
和
#)1#?
@
!
524I62
软件比对
分析表明其为同一条序列取
#)1#?
@
长片段!经
拼接和
2M3O398.Z
比对显示所得序列即为
!"#$
%
%&()*%
的启动子序列!命名为
+,-!"#(*%
"
AB/(
38/C
登入号$
DE&*!#0&
#因此!获得
!"#$
%
%&
()*%
启动子长度为
#)!&?
@

>?>
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
基因启动子的序列结构
分析
2BVK892BZ_预测表
明!该启动子可能存在的核心启动子区域有
%
处!分
值分别为
"+00
*
"+0$
和
"+0"
!分别位于第
*0!
&
0#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
*%%?
@
*
)#0
&
%&1?
@
和
1%
&
))?
@
之间
"将起始密码子
4` A
中的
4
定义为位
e#
#!而可能
的转录起始位点为
`
和
4

J98/ZM4G6
顺式元件
分析表明"图
!
#!该序列存在大量的调控元件!其中
核心元件
4`` 4(3<>
和
M44` (3<>
最为丰富!此
外!还存在多个光响应元件
3<>)
*
3<>O
*
O(?<>
*
N
@
#
和
%(4E#?-/]-/
U
.-ZB
&激素应答元件
M6%
*
A4G6(
7和
M`4(B9B7B/Z
&胚乳表达响应元件
NC/(#
/
7和
AM2)
/
7&环境胁迫中的厌氧诱导响应
元件
4G6
和
AM(7*热压响应元件
QN6
*防御
与胁迫响应元件
M`(K-;XKB
@
B8Z
*干旱诱导响应元件
I3N
和昼夜节律元件
;-K;8]-8/
&以及一些功能未知
的相关元件其中
I3N
元件为干旱诱导下的
IH3
结合位点此外!
JL4M6
软件分析表明该启
图
#
!
荔枝
!"#$
%
%&()*%
基因启动子
扩增的琼脂糖电泳检测
5#
*
5!
*
6#
*
6!
*
J#
*
J!
和
N#
*
N!
分别是
*,.
"
*
>"-G
#
*
+0$
$
和
(6$
"
)
种酶切后为模板的
第一*第二轮扩增产物&
I+5!"""52498]]BK
E-
U
+#
!
4
U
8K<.B
U
B9<[JMG87
@
9-[-;8Z-%
%&
()*%
@
K<75#
!
5!
!
6#
!
6!
!
J#
!
J!8/]N#
!
N!_BKBZXB[-K.Z8/].B;K@
K<]V;Z.<[[@
98ZB_X-;X]-
U
B.ZB]
?
*,.
"
!
>"-G
#
!
+0$
$
8/](6$
"
!
KB.
@
B;Z-^B9
&
I+5!"""52498]]BK
动子还存在
F3aY
和
FGDH*#aN
元件
>?$
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
基因启动子载体构建
重组质粒双酶切和目的序列的
JMG
双重鉴定
分析"图
%
#表明!所切下的小片段及特异引物
JMG
所得条带与目地启动子长度一致!说明
@
#%"#(
@
K<(
L;MN5%(APN
重组质粒构建成功重组质粒
@
#%"#(
@
K转化农杆菌
6Q4#"$
和
AR%#"#
图
!
!
J98/ZM4G6
预测
!"#$
%
%&()*%
启动子顺式元件分析
波浪线为载体构建引物&下划线为顺式元件!箭头方向为
正负链&
4` A
为翻译起始位点&阴影部分为可能的
核心转录区域&突出加粗字体为可能的转录起始位点
E-
U
+!
!
#8<(B9B7B/Z.8/89
.-.<[!"#$
%
%&
()*%
@
K<7J98/ZM4G6
F8^B9-/B._BKB
@
K-7BK.<[^ B;Z&
4KK<_9-/B.
_BKB"8<(B9B7B/Z.8/]_X-;X]-KB;Z-@
KB.B/Z..B/.B
8/]8/Z-.B/;B.ZK8/]
&
4` A _8.ZXBZK8/.98Z-.-ZB
&
NX8]<_B]8KB8_8.ZXB;@
K<7U
-&
NZ8/]?<9];X8K8;ZBK._BKB
@
<..-?9BZK8/.;K-
@
Z-图
%
!@
#%"#(
@
K载体构建凝胶成像图
4+
@
M4I3O4#%"#
双酶切条带&
3+
@
#%"#(
@
K酶切验证条带&
M+
@
#%"#(
@
K验证
E-
U
+%
!
4
U
8K<.B
U
B9<[ZXB;@
#%"#(
@
K4+5U
B.ZB]9-/B.<[
@
M4I3O4#%"#
&
3+5U
B.ZB]9-/B.<[
@
#%"#(
@
K&
M+`XBJMG B^K-[-;8Z-@
#%"#(
@
K1#
#
期
!!!!!!!!
练从龙!等$荔枝古树胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
基因启动子的克隆及功能验证
的
JMG
检测均得到与该启动子大小一致的条带!说
明
@
#%"#(
@
K重组质粒已分别成功地
转化农杆菌
6Q4#"$
和
AR%#"#
!可用于后续试验
>?B
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子转化烟草的功能
鉴定
APN
组织化学染色如图
)
所示!阴性对照的叶
片未能染色!而注射目的启动子
JK和阳性
对照的
M8I^ %$N
驱动
APN
的叶片均染成蓝色!但
JK驱动下的染色程度不及
#./0%$(
启动
子该结果表明
JK启动子具有驱动下游
12(
基因表达能力!即具有启动子活性!但其活性
不及
#./0%$(
启动子
>?C
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子转化拟南芥
:
=
代
筛选及鉴定
潮霉素筛选结果表明$转化成功的拟南芥小苗
根系生长良好且植株长势相对较强拟南芥小苗
APN
组织化学染色分析"图
$
#显示!
JK驱
动的
12(
在转基因拟南芥的根*茎和叶中均有表达
进一步
524
水平上的
JMG
鉴定结果"图
&
#表明!随
机选取的
0
株转基因拟南芥株系均为阳性植株
>?D
!
荔枝
1"23
!
4/+0,5$
启动子响应非生物胁迫
分析
转基因拟南芥植株在不同非生物胁迫处理下的
图
)
!
组织化学染色法检测
APN
酶活性
4+
阴性对照&
3+
阳性对照&
M+
@
#%"#(
@
K&下同
E-
U
+)
!
APN8;Z-^-Z
]BZB;ZB]?
X-.Z<;XB7-;89.Z8-/-/
U
4+2B
U
8Z-^B;&
3+J<.-Z-^B;&
M+
@
#%"#(
@
K&
X`B.87B8.?B9<_
APN
荧光活性变化分析如图
*
首先!从图中可看
出在水处理下!其
APN
活性变化不显著!因此!可
排除
434
和
IBS4
处理时水成分的影响分析转
JK株系在各非生物胁迫下
APN
活性变
化!表明
!"#$
%
%&()*%
启动子可响应
28M9
*
J6A(
&"""
*
434
*
IBS4
和损伤等非生物胁迫其中在
28M9
*
J6A(&"""
和
434
处理
&X
时其
APN
活性
即显著升高!可达到未处理的
#+*
&
%+!
倍!而在
!)
图
&
!
转基因拟南芥株系
524
水平验证
I+5!"""52498]]BK
&
4+
阴性对照&
3+
阳性对照&
M
#
&
M
*
+
转基因拟南芥不同株系
E-
U
+&
!
N;KBB/-/
U
<[ZK8/.[;
<8<
.ZK8-/.I+5!"""52498]]BK
&
4+2B
U
8Z-^B;&
3+J<.-Z-^B;&
M
#
M
*
+5-[[BKB/Z.ZK8-/.<[ZK8/.[;
<8<
图
*
!
转基因拟南芥不同胁迫处理下
APN
活性分析
E-
U
+*
!
X`B8/89
.-.<[APN8;Z-^-Z
<[ZK8/.
U
B/-;
3,.58:-
;
<8图
$
!
转基因拟南芥植株的
APN
组织化学染色
E-
U
+$
!
Q-.Z<;XB7-;89.Z8-/-/
U
<[ZK8/.
U
B/-;3,.58:-
;
<8<
@
98/Z.
"!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
0
!
转基因拟南芥不同株系
APN
活性差异分析
E-
U
+0
!
X`B]-[[BKB/;B8/89
.-.<[APN8;Z-^-Z
<[
]-[[BKB/ZZK8/.
U
B/-;3,.58:-
;
<8<.ZK8-/.
X
时均又下降&
IBS4
和损伤胁迫处理
&X
时其活性
变化不明显!而在处理
!)X
时其
APN
活性显著升
高!约为未处理的
!
&
%
倍!且两者的表达模式相近
此外!进一步分析"图
0
#发现!不同的转基因株
系叶片中的
APN
活性差异较大!表明在转
JK<(
L;MN5%
的拟南芥不同株系中!其
JK驱动
下游
APN
的活性存在差异!这可能是该启动子插
入拟南芥基因组中的位置不同所致
%
!
讨
!
论
$?=
!
荔枝古树胚性愈伤组织
1"23
!
4/+0,5$
参与
环境胁迫的调控
荔枝胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
启动子的
转录活性受不同环境因素的诱导顺式元件预测分
析表明该启动子含有光*热压*厌氧*防御与胁迫*干
旱和昼夜节律等响应元件!说明该启动子可能响应
光*热*厌氧*干旱和昼夜等的诱导本研究对转
!"#$
%
%&()*%
启动子的拟南芥植株进行
28M9
*
J6A(&"""
和损伤胁迫的结果验证了该启动子对
盐*干旱和损伤逆境下的响应这与以往
28M9
*干
旱等逆境胁迫均诱导
#$
%
%&()*
基因表达的研究
相符-#%(#).因此!该研究表明
!"#$
%
%&()*%
启动
子在逆境胁迫下!可通过响应相应的逆境顺式元件
调控其下游基因的表达!从而调整植株对逆境的耐
受能力
$?>
!
荔枝古树胚性愈伤组织
1"23
!
4/+0,5$
参与
激素胁迫调控
荔枝胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
启动子响
应外源激素胁迫
J98/ZM4G6
顺式元件分析表明!
该启动子含有参与
434
*赤霉素和水杨酸应答元
件表明该启动子在上述激素信号转导中可能发挥
了一定作用
IV/]
等-#$.指出一些基因的表达可
能是外源激素直接作为反式作用因子与这些调控元
件结合来调控的
434
-
#&
.
*赤霉素-#*.和水杨酸-#0.
等均在植物的抗旱*抗盐*抗低温等逆境方面起到一
定调控作用其中!茉莉酸甲酯作为一种挥发性化
合物!可以从植物的气孔进入植物体内!在细胞质中
被酯酶水解为茉莉酸!实现长距离的信号传导和植
物间的交流!诱导邻近植物产生诱导防御反应-#1.!
并可以产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果-!".
同样!在本研究对转
!"#$
%
%&()*%
启动子的拟南
芥植株进行
434
和
IBS4
胁迫的结果验证了该启
动子对
434
和
IBS4
激素的响应因此!该研究
也表明该启动子在外源激素胁迫下!可通过响应相
应的激素顺式元件调控
!"#$
%
%&()*%
基因的表
达
综上!本研究主要通过对
!"#$
%
%&()*%
启动
子进行克隆和功能分析!即在启动子研究的水平初
步鉴定了
!"#$
%
%&()*%
基因功能!为进一步对该
基因的转基因抗逆性研究奠定一定的基础此外!
I3N
*
F3aY
和
FGDH*#aN
等顺式元件的存在!
暗示荔枝胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
基因的调
控可能还受
IH3
和
FGDH
转录因子的调控其
中!
IH3
转录因子作为植物转录因子中最大的家
族之一!参与植物对非生物胁迫的响应-!#.!尤其在
干旱胁迫下!大部分
IH3
转录因子均与
434
相
关!且
IH3
转录因子对
434
的调控存在诱导型*
介导型和依赖型三种方式-!!.本试验所得的启动
子中!也正含有一个干旱诱导的
I3N
元件和
434
响应的
M6%
元件!那么该两个元件是否也协同作用
以及作用的方式有待进一步研究
FGDH
转录因
子能够与
F(?<>
发生特异性作用!调节启动子中含
有
F(?<>
元件的基因表达-!%.!从而参与各种防御
反应!调节植物的生长发育等-!).同时!以往的研
究也表明
FGDH
转录因子还受外源激素如水杨
酸-!$.*赤霉素-!&.*脱落酸-!*.和茉莉酸甲酯-!0.等胁
迫因此!以上的前人研究成果也为进一步深入研
究该启动子的功能及上游调控因子的调控方式等提
供新的思路
参考文献"
-
#
.
!
L4OWQY
"赖钟雄#!
LOQL
"李焕苓#
+`XBB^89V8Z-U
B/B.KB.-
S
.
+!.&:1,77&8&
4
"国土绿化#!
""*
!"
$
#$
&*
"
-/MX-/B.B
#
+
#!
#
期
!!!!!!!!
练从龙!等$荔枝古树胚性愈伤组织
!"#$
%
%&()*%
基因启动子的克隆及功能验证
-!
.
!
QPNQ I
"胡善美#
+`XB8/;-B/Z9-Z;X-ZKBB.-/ZXBY-;X8/ZB7
@
9B<[EV=X-
S
.
+B$
C
8.&17-
4
,.
;
=
D
"福建地理#!
"""
!
=C
"
)
#$
%$%0
"
-/
MX-/B.B
#
+
-
%
.
!
刘
!
枫
+
福州市寺庙园林研究-
5
.
+
福州$福建农林大学!
""0+
-
)
.
!
3P3LOHa
!
La6NMQMD6R+M@
U
B^-Z
-/898?\@
<
@
V98Z-;
=8E.
97E.&-
4
.<67,
-
S
.
+F-$,&.E-
G
>0-E$68-&.,
D
?8-E-
4D
!
""$
!
=F
"
)
#$
*010"%+
-
$
.
!
孙乃恩!孙东旭!朱德煦
+
分子遗传学-
I
.
+
南京$南京大学出版社!
#111+
-
&
.
!
许珊珊
+
福州荔枝古树离体种质保存及抗性基因
()*
的克隆与表达-
5
.
+
福州$福建农林大学!
"#!+
-
*
.
!
5O2AY5
"丁晓东#!
LfLY
"吕柳新#
+NZV]
U
B/<7-;524B>ZK8;Z--
S
.
+#=8&7<7F-$,&.E3
;;
E87:>&08,-&
97&6.8?8-E-
4D
"应用与环境生物学报#!
"""
!
D
"
!
#$
#)!#)$
"
-/MX-/B.B
#
+
-
0
.
!
F42AYT
"王学全#!
NQ62Y
"沈
!
晓#!
Q6WI
"何赞绵#!
76.E+4/<
@
Z-7-=B][KBB=B(ZX8_[4
,-5."67,8$96$97
G
."87&<6Q4#"$8/]L34))")
-
S
.
++=.,9."7$68".E?8-67"=&-E-
4D
"药物生物技术#!
"##
!
=F
"
$
#$
%0!%0&
"
-/MX-/B.B
#
+
-
1
.
!
LOH
"黎
!
茵#!
WQ42AHNQ
"张以顺#
+NZV]
4
,-5."67,8$96$97
G
."87&<(7B]-8ZB]ZK8/.-B/ZZK8/.[-/[-9ZK8Z--
S
.
H>I
;
7,897&6.EJ7"=&-E-
4D
.&:/.&.
4
797&6
"实验技术与管理#!
"#"
!
>E
"
##
#$
"$!
"
-/MX-/B.B
#
+
-
#"
.
!
S6EE6GNa2G4
!
D4R424AQ`4
!
36R42 I F+APN[V.-$

(
U
9V;VKU
B/B[V.-X-
U
XBK
@
98/Z.
-
S
.
+J=7>/?)F-$,&.E
!
#10*
!
D
"
#%
#$
%1"#%1"*+
-
##
.
!
362` 4+3,.58:-
;
<8<6=.E8.&.[9@
ZK8/.[-
I
.
+4
U
K!
""&
$
0*#")+
-
#!
.
!
S6EE6GNa2G4+4..8
-/
U
;X-7BK-;
U
B/B.-/
@
98/Z.
$
ZXB12(
U
B/B[V.-.ZB7
-
S
.
++E.&6/-E7"$E.,?8-E-
4D
K7
;
-,67,
!
#10*
!
C
"
)
#$
%0*)"$+
-
#%
.
!
F42ANQ
"王
!
盛#!
WQ42A3T
"张保青#!
QP42AY
"黄
!
杏#!
76.E+I<9B;V98K;9U
<[.V
U
8K;8/B#$
%
%&($
;
7,-I8:7:8<9$6.<7
"
#$
%
%&()*
#
8/]-Z.B>
@
KB..-.-.
-
S
.
H("87&68.3
4
,8"$E6$,.(8&8".
"中国农业科学#!
"#%
!
BD
"
#$
#$
%!**%!0)
"
-/MX-/B.B
#
+
-
#)
.
!
W42AS
"臧
!
洁#!
HPI
"余
!
梅#!
F42AYL
"王先磊#!
76.E+M9U
8/].89Z(Z<9BK8/;B8/89
.-.<[ZXB(.E8"-,&8.7$,-
;
.7.
U
B/B#$
%
%&()*
-
S
.
HF-$,&.E-
G
3
4
,8"$E6$,.E?8-67"=&-E-
4D
"农业生物技术学报#!
"#%
!
>=
"
*
#$
0)*0$)
"
-/MX-/B.B
#
+
-
#$
.
!
IP25HS
!
H4I4APMQO(NQO2aW4DOD
!
MQP42Q+2V;9B8K
@
K@
@
K<(
7U
B/B
-
S
.
++,-"77:8&
4
<-
G
6=7@.68-&.E3".:79
D
-
G
("87&"7<
!
#11"
!
FE
"
)
#$
#)"&#)#"+
-
#&
.
!
24I34G46
!
DPMQO` NPD+a
@
B/-/
U
8/B_BK8<[434KB.B8K;X
-
S
.
+F-$,&.E-
G
+E.&6K7<7.,"=
!
"##
!
=>B
"
)
#$
)%#)%$+
-
#*
.
!
NQ45545I4D
!
QI46N
!
IaN` NE45+G<9B<[
U
-??BKB9-;8;-]
"
A4
%
#
-/-7
@
K<^-/
U
.89Z.ZKB..Z<9BK8/;B<[Z_<_XB8Z;V9Z-^8K.
-
S
.
HL&67,&.68-&.EF-$,&.E-
G
+E.&6+=
D
<8-E-
4D
.&:?8-"=798<6,
D
!
"#%
!
C
"
)
#$
"$*+
-
#0
.
!
I62AYS
"孟雪娇#!
5OD
"邸
!
昆#!
5O2AAQ
"丁国华#
+JK<
U
KB..<[.ZV]
@
X
.-<9<
U
-;89K<9B<[.89-;
9-;8;-]-/
@
98/Z
-
S
.
+#=8&7<7
3
4
,8"$E6$,.E("87&"7?$EE768&
"中国农学通报#!
"#"
!
>D
"
#$
#$
!"*!#)
"
-/MX-/B.B
#
+
-
#1
.
!
E4GI6G66
!
GH42M4+O/ZBK
@
98/Z;<77V/-;8Z-$
8-K?9
,
8.7/ZXB.-.<[
@
K@
98/Z9B8^(
B.
-
S
.
++,-"77:8&
4
<-
G
6=7@.68-&.E3".:79
D
-
G
("87&"7<
!
#11"
!
FE
"
#1
#$
**#%**#&+
-
!"
.
!
YP F
"徐
!
伟#!
H42NQMQ
"严善春#
+`XB[V/;Z-,
8.7@
98/Z]B[B/;B
-
S
.
+3"6.>"-E-
4
8".(8&8".
"生态学报#!
!""$
!
>C
"
0
#$
!"*)!"0!
"
-/MX-/B.B
#
+
-
!#
.
!
LO4aH
!
WaPQE
!
F42AQF
!
76.E+N<
?B8/19/M?*&
!
19/M?1!
!
8/]19/M?#**
U
B/B.;U
B/-;3,
.58:-
;
<8<
@
98/Z.
-
S
.
H#7EEK7<7.,"=
!
""0
!
=F
"
#"
#$
#")*#"&"+
-
!!
.
!
WPaG
"左
!
然#!
YPIL
"徐美玲#!
MQ4OAQ
"柴国华#!
76.E+EV/;Z-U
V98Z-@
98/ZIH3ZK8/.;K-
@
Z--
S
.
+#=8&7<7?$EE768&-
G
!8
G
7("87&"7<
"生命科学#!
"#!
!
>B
"
#"
#$
##%%##)"
"
-/MX-/B.B
#
+
-
!%
.
!
O`42H
"田
!
云#!
LPYH
"卢向阳#!
J62ALNQ
"彭丽莎#!
76.E+`XB.ZKV;ZVKB8/][V/;Z-@
98/ZFGDHZK8/.;K-
@
Z--
S
.
+
N7,7:86.<
"遗传#!
""&
!
>F
"
#!
#$
#&"*#&#!
"
-/MX-/B.B
#
+
-
!)
.
!
李
!
癑
+%
个玉米
OKPM
转录因子基因的表达模式分析-
5
.
+
四川成都$四川农业大学!
"#!+
-
!$
.
!
5a2AS
!
MQ62M
!
MQ62W+6>
@
KB..-@
K<[-9B.<[ZXB3,.58:-
;
<8U
B/B.V
@
BK[87-9
]VK-/
U@
98/Z]B[B/.BKB.
@
-
S
.
++E.&6
/-E7"$E.,?8-E-
4D
!
""%
!
C=
"
#
#$
!#%*+
-
!&
.
!
WQ42AWL
!
YO6W
!
WaPY
!
76.E+4K-;BOKPM
U
B/BB/;<]B.8ZK8/.;K-
@
Z-@
KB..U
-??BKB9-/.-
U
/89-/
U@
8ZX_8
-/89BVK;B9.
-
S
.
++E.&6+=
D
<8-E-
4D
!
"")
!
=$B
"
)
#$
#$""#$#%+
-
!*
.
!
YO6W
!
WQ42AWL
!
WaPY
!
76.E+4//.B.<[ZXBK-;BOKPM
U
B/B.V
@
BK[87-9
KB^B89
@
<.-Z-^B8/]/B
U
8Z-^B
KB
U
V98ZU
/89-/
U
-/89BVK-
S
.
++E.&6+=
D
<8-E-
4D
!
""$
!
=$E
"
#
#$
#*
+
-
!0
.
!
J62AYY
"彭喜旭#!
QPHS
"胡耀军#!
76.E+O.<98Z-
@
KB..-@
K<[-9B.<[K-;BFGDH%"-/]V;B]?
\,
8.7@@
9-;8Z-[V/
U
89
@
8ZX<
U
B/-/[B;Z--
S
.
+("87&68.3
4
,8"$E6$,7(8&8".
"中国农业科学#!
"##
!
BB
"
#!
#$
!)$)!)&#
"
-/MX-/B.B
#
+
!编辑"宋亚珍#
!!
!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷