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,2016,36(7):1321-1330
犃犮狋犪犅狅狋.犅狅狉犲犪犾.犗犮犮犻犱犲狀狋.犛犻狀.
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(1982-),8,9:,;<=>?,@ABCDEFGHI=>。Email:changluo1983@126.com.
JKLM:NO*,=>?,@ABCDEFGHI=>。Email:conglinh@126.com
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犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿
LUOChang,CHENDongliang,CHENGXi,HUANGConglin
(BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,BeijingAgriculturalBiotechnologyResearchCenter,Beijing100097,
China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Basedon犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿RNAseqdata,weobtainedtwocodeDNAsequences
named犆犾犎犛犘70and犆犾犎犛犘90usingRTPCR.Sequenceanalysisshowedthepredictedopenreading
frame(ORF)of犆犾犎犛犘70is2559bp,encodingaproteinof852aminoacids.Theconserverdomain
searchexhibitedthatNteminarcontainstypicalNBDdomainwhichbelongstoHSP70family.Thepredic
tedORFof犆犾犎犛犘90is2094bp,encodingaproteinof697aminoacids.Theconserverdomainsearch
showedthatNteminarcontainsATPasesuperfamilyand HSP90superfamilyconservativestructure.
BioinformaticsshowedthattheaminoacidsequencesofClHSP70hadhighconsistencywith犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓
and犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋狅犿犲狀狋狅狊犻犳狅狉犿犻狊HSP70,whileClHSP90hadhighconsistencywith犃犵犲狉犪狋犻狀犪犪犱犲狀狅狆犺狅狉犪
HSP90.RealtimePCRdemonstratedtheexpressionpatternsof犆犾犎犛犘70and犆犾犎犛犘90inleavesat42
℃.Theexpressionofthesetwogeneswerebothsignificantlyupregulatedafter0.5h,reachedthehigh
estlevelafter1h.Thentheexpressionofbothtwogenesdecreasedafter2h,andremainedatarelatively
lowerlevelafter4h.Indifferentplanttissues(root,stem,leaf)after1hat42℃,犆犾犎犛犘70washighly
expressedinmatureleaves,lowerinyoung,leaves,root,maturestems,youngstems,and犆犾犎犛犘90was
thehighestinmaturestems.Theresultsshowedthat犆犾犎犛犘70and犆犾犎犛犘90participatedtheprocessof
heattolerancein犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿andlaidafoundationforanalyzing犆犾犎犛犘70and犆犾犎
犛犘90genefunction.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿;犆犾犎犛犘70;犆犾犎犛犘90;heatstress
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(50μL):2μLcDNAÂÃ(100mmol/L),0.5μL
PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL),
10μL5×PrimeSTARBuffer(Mg
2+plus),4μL
dNTPMixture(Ä2.5mmol/L),ñ»ÅU$Ä
2μLVè29.5μLddH2O。PCRÆ°ÓÔX98℃
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EpqU$
Targetgeneprimers
ClHSP70F TTATGCAGTAGCTTCAGGCTTATC
ClHSP70R ATGAGCGTGGTTGGATTTGATC
ClHSP90F TTAGTCGACTTCCTCCATCTTGC
ClHSP90R ATGGCTGATACAGAAACGTTTGC
Y ¡¢£¤PCR
RealtimePCR
RTClHSP70F AGTCCCGTTTTGTGAATCTTGTG
RTClHSP70R ACAGTTAGTGATATTTATGCTGTCGAG
RTClHSP90F AACCTTCCCTTCCTCGTCTTTC
RTClHSP90R GAGTCGCAAGCTGGTGGTTCGTTCA
RTClActinF TGCTATTCAGGCTGTGCTTTCTC
RTClActinR TAACTTGTCCATCAGGCAATTCG
Y5min;98℃Y10s,58℃©5s,72℃
ÉÊ15s,30~Ëß;72℃ÉÊ6min。PCRj$
Ì1%ÍÎÏÐÑÒÓ,ÔÕÖ@E¬}µ×Ø
²pGEMTEasyÙ<$,42℃hi`@ÚÛÜ
DH5αÝ7W\],?f Amp¾£t Xgal/
IPTGÞkß¾£。à¤káÜâ?fPCR¼,
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tp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);î ì
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ConservedDomainDatabase(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)S?fj
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(http://web.expasy.org/protparam)jk
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ExtractionKit,TaKaRa¶·)õ¤42℃¨© ª
(0、0.5、1、2、4h)§<µWD«¬ RNA,øÌ
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Æ¡¢£¤³´µSYBR PremixEXTaqTM
Ⅱ(TilRNaseH Plus,TaKaRa)Âyû?füL:
SYBRPremixEXTaq(2×)10μL,$、¸ ýU$
(10μmol/L)Ä0.4μL,ROXReferenceDye(50
×)0.4μL,cDNA ÂÃ (100 mmol/L)1μL,
ddH2O7.8μL,¸ <í20μL。»ÊÌuX95℃
Y10min,95℃Y15s,60℃þÿ1min,40~
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-1 WD犆犾犎犛犘70t犆犾犎犛犘90pqÆ°Í
Fig.1 PCRamplificationresultsof犆犾犎犛犘70and
犆犾犎犛犘90genefrom犆.犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿
¸:óÙeXN(NBD(A)tN(ATPase(B);;á<=ÙeX犆犾犎犛犘90puv(B);
>á<=ÙeXC(]Û?Ä@Kôpu(B);.x/ABC}ý
-2 WD犆犾犎犛犘70(A)t犆犾犎犛犘90(B)pq%DuvèÀ|}puv
UnderlinerepresentsNBDdomainofNterminusdomain(A)andtheATPbindingdomainofNterminusdomain(B);shadedgray
representshighlyconservedaminoacid犆犾犎犛犘90signaturesequencemotifscharacteristic(B);shadedblackrepresentstheCterminus
cytosolicisoformspecificsignaturemotif(MEEVD)(B);.Stopcodon
Fig.2 Thenucleotideanddeducedaminoacidsequencesof犆犾犎犛犘70(A)and犆犾犎犛犘90(B)in犆.犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿
4231 ! " # $ % & 36Ç
NtHSP7015. (XP009624163.1);GmHSP7014.(XP003546366.1);AtHSP70.123(NP850984.4);
BoHSP7014.WÞ(XP013591718.1)
-3 WDClHSP70ÀÁ$I HSPs^uvíÜ
NtHSP7015.犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋狅犿犲狀狋狅狊犻犳狅狉犿犻狊(XP009624163.1);GmHSP7014.犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓(XP003546366.1);
AtHSP70.犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪(NP850984.4);BoHSP7014.犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪var.狅犾犲狉犪犮犲犪(XP01591718.1).
Fig.3 MultiplealignmentofClHSP70withHSPsfromotherplantspecies
<2 5a犆犾犎犛犘70W犆犾犎犛犘90bcde8Qfgh
Table2 PhysicalandchemicalcharacterizationofClHSP70andClHSP90heatshockproteinsfrom犆.犾犪狏犪狀犱狌犾犻犳狅犾犻狌犿
jkÛProteincharacter ClHSP70 ClHSP90
¸pcENumberofaminoacids/aa 852 697
jkeýÛ¤ Molecularweight/kD 94.1 79.9
¸*2Ò3GpcTotalnumberofnegativelychargedresidues(Asp+Glu) 135 138
¸*ñÒ3GpcTotalnumberofpositivelychargedresidues(Arg+Lys) 103 106
ÎH!IcAliphaticindex 78.91 82.50
¨5£ÁcInstabilityindex 43.08,¨ 5£Unstable 37.55,5£Stable
¸0HGrandaverageofhydropathicity -0.444 -0.604
52317. 6 7,¿:WD犆犾犎犛犘70犆犾犎犛犘90pqäåèx¥ew
βJt36.85%KÇ";ClHSP90L
51.51%α89、6.31%βJt24.82%K
Ç"
。SignalP¦óew ClHSP70t ClHSP90
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WDClHSP70
(犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓)t(犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋狅犿犲狀狋狅狊犻犳狅狉
犿犻狊)HSP70jk,eªX78%t
76%,À$Ò123(犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪)、W
Þ
(犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪var.狅犾犲狉犪犮犲犪)©X74%(-
3);WD ClHSP90(犃犵犲狉犪狋犻狀犪犪犱犲狀狅
狆犺狅狉犪)HSP90®¯,¥93%,À$Ò
X92%,PQ(犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 )、
123eªX91%t90%(- 4)。Ây
ClHSP70tClHSP90Ãhijkÿ!
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(
-5)xyClHSP70j
kC(3~691aaXHSP70jkÿ!,782
~818aaX}æ©R}(lowcomplexity
region,LCR)。N ( 9~381aa Ò % l
(nucleotidebindingdomain,NBD)(-2,A),U
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,
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Ü^õ1t1
,34~219aaX&$l(sub
stratebindingdomain,SBD)。
ClHSP90jkÛS
N(
ATPase29~178aa(-5),Ã ATPaseS
,ClHSP90jkÛ184~697aa。OÝ,ClHSP90
NtHSP80like. (XP009594054.1);AaHSP90. (ABX76302.1);SlHSP901.PQ (NP001234436.1);
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SlHSP901.犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 (NP001234436.1);AtHSP812.犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪(NP200414.1);
GmHSP902.犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 (NP001236599.1)
Fig.4 MultiplealignmentofClHSP90withHSPsfromotherplantspecies
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Fig.6 PhylogenetictreeforHSP70(A)and犎犛犘90(B)basedonalignmentofaminoacidsequencesfromotherspecies
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Fig.7 Relativeexpressionlevelof犆犾犎犛犘70and犆犾犎犛犘90geneindifferenttreatmenttimesanddifferenttissues
under42℃hightemperaturestress.
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