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Genetic Relationships of Notholirion and Genetic Diversity of N.bulbuliferum in China Revealed by ISSR Markers

中国假百合属亲缘关系及假百合遗传多样性的ISSR分析



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$+"!+"#
基金项目$国家自然科学基金"
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#&国家基础条件平台&国家标本平台教学标本子平台"
233
4
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502,/67,897,
60
#&科技部基础性研究专项"
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#
作者简介$杨
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梅"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事植物系统进化研究
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通信作者$周颂东!副教授!硕士生导师!主要从事植物分类与系统进化相关方面的研究
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B2A7
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70,6A5
中国假百合属亲缘关系及假百合
遗传多样性的
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分析

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梅!周颂东"!何兴金!彭
!

"四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室!成都
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#

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要$利用
*

CDDE
引物对中国假百合属植物
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个居群
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个个体的遗传多样性进行了初步探讨结果表
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FGHIJ
聚类结果显示!假百合"
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#与大叶假百合
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#分别聚为三支!在分子水平上出现了明显的分化!揭示三者是独立物种"
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K!./0-
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与钟花假百合聚为一支!这可能与其母系遗传和极强的无性繁殖体系有关!但两者间基因流
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#很低!假百合与
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的基因流"
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#也极低!说明
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正在分化"
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#假百合种下各居群间按照地理结构可明显分为
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支!经
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检测
表明存在显著的谱系地理结构"
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分析显示!假百合居群间遗传变异为
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#!而居群内为
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"
4
#
","#
#!同样表明居群间遗传分化大于居群内研究结果揭示了横断山区假
百合属植物的亲缘关系!从分子水平上为其鉴定提供了依据&并从遗传结构上为药用植物假百合的可持续利用和
开发奠定了理论基础
关键词$遗传多样性&
CDDE
&假百合&钟花假百合&大叶假百合
中图分类号$
P%&$,
Q
)
&
P*1
文献标志码$
J
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假百合属是百合科百合族较为原始的类群)#+!*!
属下共有
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种!其中大叶假百合"
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"
1
$
2
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#(钟花假百合"
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1
0(*%0#*-
#和假
百合"
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+
,*-
#等
%
种分布于中国西部横
断山区及东喜马拉雅)%*因其鳞茎由基生叶增厚套
迭而成!外面具黑褐色的膜质鳞茎皮!与百合属的特
征相似而被作为百合属的一个亚属&而后又有学者
将其归为贝母属的一个亚属)&*假百合属植物具卵
形的小鳞茎!成熟后外壳稍硬!内有数片白色肉质的
鳞片&柱头明显
%
裂!这些特征明显区别于百合族的
其它属!
\A.//.8Z
将其提升为独立的属并得到大多
数学者的支持!同时发表了大叶假百合)+**
VA03A0

D38=Z0
又陆续发现了钟花假百合和假百合)$+**
而有研究显示!假百合与钟花假百合之间存在杂交!
即假百合
K
钟花假百合"
!.)*%)*%&
+
,*-K!.
/0-
1
0(*%0#*-
#据文献记载以及野外观察发现这
四者在未开花时很难辨认"图
#
#!假百合为常用中
药材!对其鉴定的准确与否直接关系到药材质量!所
以从分子水平上对其属下种间关系探讨迫在眉睫
假百合属植物生长在
!*""
"
&"""5
高海拔地带!
且大多生长在人迹罕至的深山中!极少受到关注!更
未从分子水平上对这四者进行过亲缘关系及遗传多
样性的研究
CDDE
被称作简单重复区间多态性扩增!或微卫

GVE
!方法是用
#*
"
!!
个重复碱基序列作为引
物扩增出重复序列间的片段)1*!因其操作步骤简单
易行)+#"*!应用范围十分广泛在百合族中运用
CD+
DE
技术探讨了青岛百合)##*的遗传多样性!提出了
麝香百合的分子鉴定依据)#!*&赵丽华等)#%*采用
CD+
DE
技术对中国百合属亲缘关系进行了研究&沈呈娟
等)#&*对近缘类群宝兴百合与匍茎百合进行了亲缘
关系与遗传多样性的研究本实验通过
CDDE
分子
标记对中国假百合属植物的亲缘关系进行了研究!
为药用植物假百合的分子鉴定提供了参考!并对假
百合进行了居群水平上的遗传多样性研究!为假百
合可持续利用和保护提供了理论依据

#
!
假百合属植物形态"幼苗期与花期#
:.
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2^85AZ
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材料和方法
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实验包括
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个居群!共计
!))
个个体!其中假
百合(钟花假百合(假百合
K
钟花假百合(大叶假百
合的居群数分别为
#1
(
!
(
%
(
#
个按居群采样时!每
个个体至少间隔
)"5
以上!将采集的新鲜叶片置
入硅胶干燥备用并将野外采集的个体引种栽培于
实验室!凭证标本存放于四川大学标本馆"
DS
#采
样基本覆盖中国假百合属的分布范围"表
#
!图
!
#
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!
$%%&
标记分析
对实验材料新鲜嫩叶采用植物基因组
cRJ

剂盒"天根生化科技有限公司!北京#提取总
cRJ

cRJ
样品用
#O
琼脂糖凝胶电泳检测!利用紫外分
光光度计确定其浓度!将样品稀释至
!)0
@
%
#
X
!最
后将样品置于
(!"d
冰箱中保存备用随机从每
个居群中抽取
!
个样本作为引物筛选的模板!根据
哥伦比亚大学"
F\V
#公布的引物序列!从中筛选出
稳定性好!重复性强且条带清晰的
*
条引物作为本
次实验的引物"
C0].3ZA
@
08
公司合成#!引物编号及
序列见表
!

从每个居群选取
%
个个体进行预实验!最终确

GVE
扩增反应体系总体积为
!)
#
X
$包含
!)0
@
模板
cRJ
!
#,"F50
6
cRJ
聚合酶!
#KGVE
缓冲
液!
#
#
5A>
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XCDDE
引物!
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%
X9R^ G/
!
#,)
55A>
%
XI
@
VX
!

GVE
扩增程序为
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预变性
&
5.0
&
&d
变性
&)/
!
)#,)d
"
)),)d
"视引物
5^
居群编号同表
#

!
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采样分布图
GA
4
7>=3.A06A98/=Z8
@
.]80.0 =^Y>8#
:.
@
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!
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个居群材料来源
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!
XA6=3.A0/=09/=5
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A
4
7>=3.A0/A[!"#$"%&&"(
物种
D
4
86.8/
居群编号
GA
4
7>=3.A06A98
采集地
XA6=3.A0
海拔
J>3.3798
%
5
经度
XA0
@
.3798
"
<
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纬度
X=3.3798
"
R
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样本数
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假百合
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+
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陕西秦岭
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四川松潘
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四川理县
X.b.=0
!
D.627=0 %)&# #"!e%f %#e)"f #"
TD
四川黑水
T8./27.
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D.627=0 %!! #"!e%*f %!e"%f #"
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四川金川
g.0627=0
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D.627=0 %$"" #"!e")f %#e#"f #"
Wc
四川康定
W=0
@
9.0
@
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D.627=0 %*"# #"#e&*f %"e"$f #"
;g
四川雅江
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-
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!
D.627=0 %$%1 #""e)%f !e)1f #"
UV
四川乡城
U.=0
@
6280
@
!
D.627=0 %$)" e)f !1e)*f #"
IX
四川木里
I7>.
!
D.627=0 %&#& #"#e"f !1e"f #"
U.V
四川西昌
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@
!
D.627=0 %%"" #"!e!!f !*e%)f #"
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四川冕宁
I.=00.0
@
!
D.627=0 %%"" #"!e#)f !1e)%f #"
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四川美姑
I8.
@
7
!
D.627=0 %!"" #"!e)&f !1e%$f #"
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四川越西
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D.627=0 %$"" #"#e)f !*e)!f #"
XP
云南禄劝
X7
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云南大姚
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云南德钦
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西藏芒康
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XS
西藏林芝
X.0B2.
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U.B=0
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假百合
K
钟花假百合
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云南大理
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云南中甸
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云南丽江
X.
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!
;700=0 %$!* #"#e#"f !$e#"f #!
钟花假百合
!./0-
1
0(*%0#*-
V^
云南腾冲
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@
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!
;700=0 %)"" 1e#*f !)e%!f #"
HD
云南贡山
HA0
@
/2=0
!
;700=0 %%&# 1e#*f !1e!%f #"
大叶假百合
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1
$
2
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西藏吉隆
g.>A0
@
!
U.B=0
@
%&)" 1)e%"f !1e%"f #)
#)&
%

!!!!!!!!!!

!
梅!等$中国假百合属亲缘关系及假百合遗传多样性的
CDDE
分析
值而定#退火
&)/
!
*!d
延伸
#5.0
!共
%)
个循环&
*!d
延伸
15.0

cX!"""
作为分子量标准检测
扩增产物!用含有
HA>9].8_

#,)O
琼脂糖凝胶于
#!"N
恒压电泳
&)5.0
最后在凝胶成像系统仪上
进行拍照并保存"
\.A+E=9H8>cA6UEQ.5=
@
.0
@
/
?
/385
#!用于后续分析
=,A
!
数据处理与分析
CDDE
作为显性分子标记视每一个多态位点为
一个等位基因以
cX!"""
进行参照对比!在同一
相对迁移位置出现清晰条带的计为
#
!没有或模糊
的条带记为
"
!将条带数据信息构建成
"

#
的原
始数据矩阵使用
GMGH软件分析遗传
变异的各项参数$如多态位点百分率"
447
#(
R8.
+
/
基因多样度指数"
8
#(
R8.
+
/
遗传距离"
9
#和遗传一
致度"
8
.
#(平均每个位点上的观察等位基因数
"
!
=
#(平均每个位点的有效等位基因"
!
8
#(
D2=0+
0A0
多样性信息指数"
:
#(居群间遗传分化系数

?
!
$%%&
引物序列和最佳退火温度
=^Y>8!
!
GZ.58Z/=09A
4
3.5=>=008=>.0
@
385
4
8Z=37Z8
引物编号
GZ.58Z
引序列
GZ.58Z
/8
`
78068
总条带数
RA,A[
4
A>
?
5AZ
4
2.6
Y=09/
退火温度
J008=>.0
@
385
4
8Z=37Z8
%
d
F\V1#)
"
V^
#
1H #$ )#,)
F\V1%)
"
JH
#
1;V #! )),1
F\V1&%
"
V^
#
1EJ #) )!,"
F\V1&&
"
V^
#
1EV #% )$,"
F\V1&$
"
VJ
#
1E^ #" )!,)
F\V1))
"
JV
#
1;^ #& )),1
F\V1*%
"
HJVJ
#
& ## )%,"
!!
注$
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%
^
&
ELJ
%
H

RA38
$
;LV
%
^
&
ELJ
%
H,
"
;
/3
#(居群内基因多样度"
8
/
#(总的基因多样度
"
8
3
#(基因流"
!
5
#等)#)+#$*然后利用
R^ D;D+
4
6
!,#"
构建树状聚类图以及计算遗传相似性系数
"
;
/
#
)
#*
*
!对假百合属下种间关系进行分析遗传变
异在居群内与居群间的分布情况通过
JIMNJ
#,))
软件计算得出)#1*最后使用
H80J>
遗传距离与地理距离之间相关性进行
I=038>
检验)#*
!
!
结果与分析
?>=
!
$%%&
扩增产物的初步检测

%
为引物
F\V1#)
对假百合属植物进行扩增
后!用
#,)O
琼脂糖凝胶电泳检测的结果其它引
物都达到很好的扩增效果!表明选定的反应体系和
GVE
扩增程序效果较好!扩增产物可用于下一步的
数据分析
?>?
!
假百合属
$%%&
结果分析

!"

CDDE
引物中筛选出了能扩增出清晰(
稳定性和重复性较好的
*
条引物!对假百合属全部
供试材料进行
GVE
分析!共计扩增出
#
个清晰可
重复的多态性有效位点!其中多态性标记位点
#

"
447L#""O
#
*
条引物扩增后的
cRJ
条带数
目从
#"

#$
!平均条带数目为
#%
!变异长度从
!""
Y
4

!"""Y
4

GMGH分析显示"表
%
#$
在这
*
条引物中平均每个位点的有效等位基因
"
!
8
#从
#,"&&"

#,!&1!
!平均值为
#,#&$%

均每个位点上的观察等位基因数"
!
=
#从
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#,&&#$
!平均值为
#,!)"

R8.
+
/
基因多样度指数
"
8
#从
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!平均值为
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D2=00A0
多 样 性 信 息 指 数 "
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#
"
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假百合!康定居群&
"
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大叶假百合&
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钟花假百合&
#&
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假百合
K
钟花假百合&
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假百合!秦岭居群

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引物
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7>=3.A0
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物种
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",%#**
!平均值为
",#$&"

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!
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通过
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4
6+!,#"
软件计算出假百合属各
类群间遗传相似性系数"
;
/
#!结果显示
;
/
值范围从
",)%)!

",1#%%
!平均值为
",*"!!

;
/
最低值
存在于大叶假百合与假百合之间为
",)%)!
!这表明
其亲缘关系最远&最高值为钟花假百合与
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%&
+
,*-K!./0-
1
0(*%0#*-

",1#%%
!说明其亲
缘关系最近通过聚类分析也表明!大叶假百合与
假百合相距最远!假百合与钟花假百合距离最近
"图
&
#
?,@
!
假百合遗传多样性
利用筛选的
*

CDDE
引物"表
!
#对假百合进行
GVE
扩增!共计扩增出
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个清晰可重复的有效位点!
其中多态位点有
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个结果显示"表
%
#$在物种水平
上!假百合的多态位百分率"
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#为
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!
!
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#!
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为"
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梅!等$中国假百合属亲缘关系及假百合遗传多样性的
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分析
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假百合
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钟花假百合
!.)*%)*%&
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(*%0#*-
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物种间
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"
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#在居群水平上!各个居群的
447
范围从
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"
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!平均值为
!&,*)O

假设种群处于
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+i8.0Y8Z
@
平衡条件下!
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个居
群的平均有效等位基因为
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!平均
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+
/
基因
多样性指数为
",#%))
!平均
D2=00A0
多样性信息指
数为
",#*&1
!各项参数均低于物种水平
D2=00A0
多样性指数表明各居群的遗传变异由
低到高为林芝
#
冕宁(美姑
#
大姚
#
越西
#
禄劝
#


#
黑水(金川
#
理县
#
芒康(米林
#
乡城
#
松潘
#
德钦
#
西昌
#
秦岭
#
康定!与
GG值分析的结果一
致各居群间遗传差异较大!其中康定居群"
Wc
#的
遗传多样性水平最高"
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!
!
8
L#,!%&*
!
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#!林芝居群间的遗传多样性水平最低
"
447L#),)1O
!
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L#,"&&"
!
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#
?,C
!
假百合遗传分化与基因流
通过
GMGH软件计算得出假百合
#1
个居群
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",%"!"
!
8
/

",#1")
!
;
/3

",*&)
"表
&
#!即
*&,)O
的变异存在于居群之间!
),")O
的变异存在于居群内!结果显示居群间的遗传分化
大于居群内的分化居群间的基因流"
!
5
#为
",#1#$
!表明居群之间的基因流水平较低
利用
JIMNJ#,))
分析表明在总的遗传变异
中!有
**,#!O
"
4
#
",""#
#的遗传变异发生在居群
之间!
!,11O
"
4
#
",""#
#的遗传变异存在于居群
内!与
GMGH分析结果一致!都表明遗传
变异主要存在于居群间
?,D
!
假百合聚类分析
GMGH分析得出假百合
#1
个居群两
两间的
R8.
+
/
遗传一致度"
8
.
#!范围为
",$"!$
"
",1%#
!遗传距离"
9
#为
","#*#
"
",&$&!
"表
)
#
乡城与雅江居群间遗传一致度最高"
8
.
L",1%#
#!
遗传距离最近"
9L","#*#
#!在聚类分析中也聚得
最近"图
&
#&根据
R8.
+
/
遗传相似性系数!使用
R^ +
D;D
4
6!,#
软件中的
DTJRR
对假百合
#1
个居群
进行
FGHIJ
聚类分析!
#1
个居群按照遗传距离
远近以及遗传一致度高低聚为
!
大支
&
个亚支"图
&
#其中雅江和乡城遗传一致度最高!遗传距离最
近首先聚在一起!然后与康定和木里聚为
V>=98
$
&
秦岭(松潘(理县(黑水和金川遗传一致度与地理距
离也较近优先聚为
V>=98
%
&西昌(冕宁(越西与美
姑形成
V>=98
&
&禄劝(大姚等与其它居群则聚为
V>=98


!
个大类在
",*"
阈值处聚在一起
I=038>
关于地理距离和分子遗传距离的检测揭示
了假百合居群间的地理距离和遗传距离存在显著的
相关性"
L",&#"
!
4L","#
#
%
!

!

A,=
!
中国假百合属遗传多样性与种间亲缘关系的
探讨
生物的遗传多样性是珍贵的自然资源!也是人
类赖以生存的基础物种的遗传多样性越高说明其
遗传背景越复杂!同时也具有更强的进化潜力和对
恶劣环境的耐受力!且更容易扩大生境以及适应新
的环境)!"*在本研究中!利用
*

CDDE
引物对中
国假百合属
&
个类群进行了扩增结果显示多态性
百分率"
447
#为
#""O
通常来说当
447
$
)"O
时!被试物种的遗传多样性就被视为较高!这表明中
国假百合属植物具有很高的遗传多样性根据花的
形态以及颜色划分!中国假百合属下有
%
个种$假百
合(钟花假百合与大叶假百合而后在云南西北部
发现了
!.)*%)*%&
+
,*-K!./0-
1
0(*%0#*-

其形态特征在未开花时差距甚微!且假百合与钟花
假百合之间存在杂交!从表型上很难区分然而假
百合为名贵中药材!所以对其正确鉴定十分必要!在
本研究中遗传相似性系数均值"
;
/
#为
",*"!!
!表明
假百合属种间具有较高的遗传相似性&钟花假百合
作为杂交个体的母本与
!.)*%)*%&
+
,*-K!./0-3
1
0(*%0#*-
具有较高的遗传相似性"
;
/
L",1#%%
#
且在
FGHJIJ
聚类分析中聚为一支!亲缘关系最
近!这可能与钟花假百合作为杂交个体的母本且在种
子植物中为母系遗传有关)!#+!!*&大叶假百合与假百合
在聚类分析时也相距最远!表明其亲缘关系最远
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梅!等$中国假百合属亲缘关系及假百合遗传多样性的
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源以及进化的基础!并且可以为人类提供合理的保
护(开发和利用的理论依据)!%+!&*根据
CDDE
分析
结果显示!假百合物种水平上多态位百分率"
447
#

%,O
!
R8.
+
/
遗传多样性指数"
8
#为
",&)1!
!
D2=00A0
+
/
信息多样性指数"
:
#为
",%&%!
这一较
高的遗传多样性可能是由于假百合的分布从秦岭延
伸到东喜马拉雅以及生长在平均海拔高度为
%"""
5
的横断山区!而这一地区具有复杂的地质地貌!
高山峡谷纵横!生活环境多变通常!物种具有广泛
的分布就会展现出较高的遗传多样性!这种现象在
竹黄菌)!)+!$*的研究中也有发现一方面!长期的地
理隔离导致各居群间适应不同的环境!从而产生较
大的遗传变异&另一方面!也可能是假百合的祖先类
群具有多样性复杂的基因库!而后由于青藏高原隆
起)!**(横断山造山运动)!1+!*以及第四纪冰期气候的
反复波动导致生境片段化后!而出现如今不同分布
地间的遗传差异
假百合种下居群间的遗传分化系数"
;
/3
#为
",*&)
!远远高于
R
?
YA5
统计的多种植物
CDDE
遗传分化系数均值"
;
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L",%&
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)
%"
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!同样也高于宝兴
百合"
;
/3
L",$&!)
#(匍茎百合"
;
/3
L",)$%*
#的
CD+
DE
遗传分化系数)#&*!这说明假百合居群间存在较
高的遗传分化而且从
R^ D;D
4
6!,#"
聚类结果
以及各居群的采样分布可以看出!
V>=98
$

V>=98
%
被折多山山脉隔开&
V>=98
&

V>=98

被金沙江
流域阻隔&而这两大支之间存在锦屏山山脉横断
山区复杂的地貌环境可能孕育了假百合的异质居群
结构而
I=038>
关于地理距离与遗传距离的检测
存在极显著的相关性也恰好说明这一点虽然假百
合有性生殖依靠虫媒传份!这会使得居群间遗传分
化降低!但是假百合生长在横断山区!该地区由高黎
贡山(大雪山(锦屏山等
*
条几乎平行的山脉和金沙
江(澜沧江与怒江等几大流域组成!高山峡谷纵横!
大多数山脉海拔达到五千多米!形成了天然的地理
隔离屏障这种依靠虫媒传粉方式的植物被自然条
件阻隔!从而限制了居群间的基因交流!这也是造成
假百合居群间遗传分化值高的又一原因再者!假
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说明遗传漂变也可能是假百合种下居群间遗传分化
较高的原因
分布范围(种子传播机制(繁育系统等因素都可
影响群体遗传结构!但在异交类型植物中群体间的
分化值一般较小)%!*假百合居群间遗传分化系数
远高于远交植物!这可能是因为假百合具有复杂的
兼性生殖繁育系统)%%*在自然生存环境中!假百合
具有大量的小鳞茎野外取样过程中观察发现小鳞
茎繁殖能力极强!在脱离母株后!大多数小鳞茎便形
成无性生殖植株!同时也存在种子实生苗假百合
在漫长的进化历史中和自然选择的压力下!已经形
成了适应环境要求的有性和无性两种繁育制度通
过大量观察发现!假百合聚居现象特别明显!大多成
群分布!遇到有水沟的地方则沿水流方向两岸分布
据此推测依靠小鳞茎的无性繁殖体系是假百合主要
的繁殖方式较强的无性繁殖能力导致了假百合居
群内遗传多样性的降低
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假百合可持续利用与保护策略
对于物种来说!遗传多样性水平高低与对环境
的适应能力以及变异和进化潜力的强弱是紧密相关
的)%&*丰富的遗传多样性是物种具有更高的适应
和存活能力的基础!从而才能提高物种的进化(繁殖
以及优化遗传结构的能力)%)*基于目前的研究显
示!假百合具有很高的遗传分化因此!对集巨大药
用价值与观赏价值于一体的假百合野生资源以及遗
传多样性的保护是非常有意义的假百合野生居群
被药农大量采挖!加之近年来道路建设使得假百合
生境破坏以及原生态旅游业的大规模开发!假百合
大而艳丽的花朵吸引了游客的采摘所以!对现存
假百合居群应该采取一些有效的保护措施!比如$对
假百合的生存环境适度保护!禁止人们过度采挖等&
因秦岭(松潘(康定(西昌(德钦等地具有较高的遗传
多样性!这些具有丰富的基因多样性资源的地区是
将来进行育种的优良种质库的来源!在制定保护措
施和对其利用时应多加注意
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