全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$
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课题"
!"##11#""!"2"#
#&美国孟德尔生物技术公司合作项目"
34"%*%
#
作者简介$黄丽芳"
#2*&
#!女!硕士!助理研究员!主要从事生物新能源品种选育与栽培技术研究
5(67-8
$
98:!"""0!2
!
#%+;<6
"
通信作者$易自力!博士!教授!博士生导师!主要从事生物质能源研究
5(67-8
$
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->-8-002
!
#%+;<6
野生南荻与芒杂种多倍体诱导研究
黄丽芳#!殷绪明#!杨宇晨!!李伟丽#!易自力!"
"
#
中国科学院亚热带农业生态研究所!亚热带农业生态过程重点实验室!长沙
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!
湖南农业大学 生物科学技术学院!长沙
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#
摘
!
要$用不同浓度秋水仙素处理野生南荻
?
芒"
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-
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#远缘杂交后代以
诱导产生多倍体!并对变异株进行形态学和细胞学鉴定!以期获得稳定的四倍体植株并分析其生理特性结果表
明$"
#
#采用秋水仙素加入培养基处理法和秋水仙素溶液浸泡处理法都可获得一定频率的多倍体植株&胚性愈伤组
织以
"+!@
秋水仙素浸泡处理
)09
的诱变效果较好!四倍体诱导率达
0+*@
&芽在
"+"$@
秋水仙素培养基中处理
#$A
较好!四倍体诱导率达
#"+@
&生根苗在
"+#@
秋水仙素培养基中处理
#"A
较好!四倍体诱导率达
##+#@

"
!
#经体细胞染色体计数!加倍植株染色体数为
!/B)CB*
!对照植株的染色体数目为
!/B!CB%0
"
%
#生长
!
年
的多倍体植株形态(叶片大小(茎粗(茎壁厚(节间等性状表现出巨大性和超亲优势
关键词$芒属植物&杂交后代&染色体加倍&秋水仙碱&异源四倍体
中图分类号$
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文献标志码$
1
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78W
8<-A
!!
芒属"
!"#$%&()#
#植物俗称芒草!是一种新型
的纤维素类能源植物芒属植物具有高光效(低呼
吸(
Xa
!
补偿点低(生长快(适应性强(抗逆性强(生
物产量高等特点!除了作为能源植物开发外!还可用
于造纸和作为水土保持(生态修复植物应用)#(**在
芒 属 植 物 中!芒 "
!"#$%&()##"&.&#"#
#(五 节 芒
"
!"#$%&()#
1
*,+"2)*)#
#(荻"
!"#$%&()##%$$(%+"
1
*,3
+%
#(南荻"
!"#$%&()#*)%+",+"
-
%+"%
#等
)
个种的利
用价值最大!但各有优点为了选育出高生物产量(
强适应能力和优良能源利用品质的芒属能源植物新
品种!以满足生物质能源产业的实际需要!还必需开
展芒属植物的遗传改良
通过染色体加倍技术!人工创造多倍体!是获得
高生物质产量芒属植物新品种的有效途径之一何
立珍等)0*采用组培诱变方法!获得了第一个南荻同
源四倍体新资源+芙蓉南荻,!发现其产量大幅度提
高!纤维质量更好该品种通过常规的造纸试验证
明!碱耗低!易成浆!制浆得率高!是一种优良的造纸
纤维原料)2*张闯等)#"*通过秋水仙素诱导获得的
另一南获同源四倍体!具有较强光合特性!其株高(
茎粗以及干物质量均高于普通二倍体但诱导产生
的全部是同源四倍体!即品种自身加倍从遗传进
化的角度看!它们的亲缘关系太近所以南荻同源
四倍体的最大缺点就是株型散生
芒属植物具有自交不亲和特征!且种间可以进
行杂交!现在多采用远缘杂交育种手段!将优良基因
转入到栽培种中创造新种质目前!欧洲国家正在
推广的一种主要能源植物---奇岗"
!4
5
"
5
%&.)#
#
就是一种芒与荻种间自然杂交而产生的异源三倍
体)##(#!*.湘杂芒
!
号/是湖南农业大学芒属植物研
究所以野生南荻"
!4*)%+",+"
-
%+")#
#为母本和芒
"
!4#"&.&#"#
#为父本!通过人工远缘杂交培育出的
种间杂交新品种!其叶片(株高(株型和腋芽的形态
学性状均介于双亲之间!具高产(优质(抗病虫和耐
逆性强等优点!但其茎秆细弱!生长期遇大暴风雨易
发生倒伏
解决远缘杂交和多倍体问题的策略是异源多倍
体化)#%*实践证明!已成功获得油菜 "
6+%##"3
$%
#
)
#)
*
(拟南芥"
7+%8"2,
-
#"#
#
)
#$
*和棉花"
9,##
:-
"3
);
#
)
#
*的异源多倍体!多表现出超亲优势和器官巨
大性因此!本研究特以野生南荻
?
芒"
!4*)%+"3
,+"
-
%+"%?!4#"&.&#"#
#远缘杂交新品种.湘杂芒
!
号/为材料!利用秋水仙素诱导其染色体加倍!旨在
获得高产(优质(多抗的异源多倍体新品系
#
!
材料和方法
9+9
!
实验材料
外植体材料来自于芒属植物杂交种.湘杂芒
!
号/!是湖南农业大学培育出的南荻"
!4*)%+",+"3
-
%+")#
#与芒"
!4#"&.&#"#
#远缘人工杂交种!经体细
胞染色体鉴定为二倍体!数目为
!/B!CB%0
选择
.湘杂芒
!
号/继代的胚性愈伤组织(离体芽尖和生
根苗为诱导多倍体的外植体生物学性状分析材料
为杂种二倍体与四倍体试管苗移植田间的植株
9+:
!
组织培养及秋水仙碱处理的方法
用含
$+"6
J
%
I!
!
)(b
和
#+"6
J
%
I(Y1
培养
基进行幼穗愈伤组织诱导和培养&用含
!+"6
J
%
I
(Y1
和
"+!6
J
%
IL11
培养基进行分化和增殖&用
含
"+$6
J
%
IG11
和
#+"6
J
%
IVV
%%%
"多效唑#培
养基进行生根培养"基本培养基均为
c3
#选用秋
水仙素作为诱导剂!胚性愈伤组织在形成绿点的第
%
(第
$
和第
*
天用秋水仙碱浸泡处理!浸没在
"+#@
(
"+!@
(
"+%@
秋水仙碱溶液中处理
)0
和
*!
9
&选择
#
"
!;6
高的芽和生根苗接种在添加
"+"$@
(
"+#@
秋水仙碱的
c3
培养基上共培养
$
(
#"
(
#$A
!同时将同浓度秋水仙碱溶液点滴
!
片子叶
中间的生长点!共培养结束后转接至上述分化和增
殖培养基中为了提高秋水仙碱的渗透率!在被测
试的应用溶液中均加入
#+$@
的二甲亚砜"
bc(
3a
#每种方法重复
%
次!并且每次不少于
%"
个处
理
#!"A
后!将诱变成活的试管苗转入生根培养
基中培养&从中选择变异明显的植株进行
bG1
的
相对含量鉴定&对
bG1
相对含量已加倍的再生苗!
进行根尖染色体制片!根据染色体数判断其倍性!并
统计诱导率"诱导率
B
四倍体植株数%成活植株数
?
#""@
#对染色体鉴定为多倍体的部分植株进行扩
大繁殖!另一部分移栽至大田生长
9+;
!
多倍体鉴定方法
!
#
"形态学观测
!
经植株大小(叶片颜色(叶形
等外部形态观察比较后!完成初步筛选
!"流式细胞仪检测
!
参考周癑癑等)#**的方
法!初步确定染色体倍性
!
%
"细胞遗传学鉴定
!
经细胞流式仪检测的
bG1
相对含量已加倍的再生苗!在幼苗根长至
#
"
!;6
时!切取
)
"
66
根尖!用文献)
#0
*建立的芒
属植物染色体核型分析方法!对根尖进行染色体制
片!在显微镜下观察染色体数目并确定植株倍性
9+<
!
四倍体与二倍体主要性状观察
以杂种后代二倍体和四倍体为材料!移栽大田
生长
!
年!随机抽取
#"
株!用同一标准测量植株的
各形态指标!进行对比分析测量标准如下$
"
#
#株高$直尺测量开花植株茎的基部到植株茎
#$
#
期
!!!!!!!!!!!!!!!
黄丽芳!等$野生南荻与芒杂种多倍体诱导研究
的最高点的垂直距离!取平均值&"
!
#茎粗$游标卡尺
测量植株中部附近最粗的茎的直径!同一株各测
$
个值计算取平均值"
%
#茎壁厚$剪开植株中部附近
最粗的茎的节间!用游标卡尺测量茎壁厚度!在同一
横截面取
%
个值计算取平均值"
)
#叶长(叶宽和叶
厚$直尺测量叶片与叶鞘结合处到叶片尖端的距离
为叶长&游标卡尺测量叶片最宽处叶缘间的距离为
叶宽&游标卡尺测量每片叶中部靠近叶脉处的厚度
为叶厚&同一株各测
#"
个值计算取平均值"
$
#节
间$直尺测量植株中部附近最粗的茎的节间距离!同
一株各测
#"
个值计算取平均值
9+=
!
统计分析
利用
c-;T<.<:U5C;O8
作数据处理!采用
bV3
统计软件对数据作差异显著性分析与相关性分析
!
!
结果与分析
:+9
!
秋水仙素加入培养基处理对芽和生根苗多倍
体的诱导
对离体芽尖进行秋水仙碱处理!从成活的
#$#
个芽中发现

个四倍体和
##
个嵌合体芽"
*+!@
#&
对生根苗进行秋水仙碱处理!从成活的
$!
个芽中发
现
%
个四倍体和

个嵌合体"
##+$@
#从表
#
看
出!随体积浓度升高和处理时间延长!秋水仙素处理
致使外植体死亡率增加!但在体积浓度适中的情况
下!总体死亡率较低!且能获得较高变异率
"+"$@
或
"+#@
秋水仙素处理生根苗和离体茎尖
$A
!没有
发现四倍体植株&
"+"$@
秋水仙素处理芽
#$A
(
"+#@
秋水仙素处理生根苗
#"A
!这
!
个组合加倍效
果较好!加倍率分别为
#"+@
和
##+#@

:+:
!
秋水仙素溶液浸泡处理对愈伤组织细胞多倍
体的诱导
对胚性愈伤组织进行秋水仙素溶液浸泡处理!
获得
#)0
株成活试管苗!检测后发现
)
个多倍嵌合
体"
!+*@
#和

个四倍体多倍体出现的频率随体
积浓度的升高和处理时间的延长而增加!小于
"+#@
秋水仙素体积浓度处理对诱导多倍体作用小&
"+#@
及其以上体积浓度处理对诱导产生多倍体效果较
好!但随体积浓度增加秋水仙素对外植体的毒害作
用增大!最高体积浓度"
+%@
#处理"
*!9
#将杀死几
乎所有的外植体&以处理浓度
"+!@
(处理时间
)09
的组合效果最好!四倍体诱导率达到
0+*@

:+;
!
秋水仙素处理对再生试管苗的影响
愈伤组织经秋水仙素诱变处理后!继代于分化
培养基中!培养初期"
#$
"
!"A
#芽块表面出现褐化
现象!继续培养
%"A
!逐步长出少量绿色小芽"图版
#
!
#
#!得到的小芽第二次继代后活性较高!部分试
表
9
!
离体培养条件下秋水仙碱的诱变效果
7^S8O#
!
9^O-/AN;U--
%+")#?!4#"&.&#"#"&<"+,
材料
c7UOT-78
秋水仙碱浓度
X<8;9-;-/O;%
@
处理时间
-^6O
检测数
G<+<:AOUO;U-四倍体数
G<+<:UOUT7
W
8<-A
嵌合体数
G<+<:;9-6OT7
诱导率
L/AN;U-[-U
=
%
@
愈伤组织
X78-
"+#
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J
.
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$A " # "O#"A #0 ! ! ##+#71
#$A " " " "O!!
注$诱导率列数据后不同小写和大字母分别表示
"+"$
和
"+"#
水平显著性差异
G$
9^O-/AN;U-[-U
=
A7U7]-U9/W
-U788OUUOT.6O7/.-
J
/-:-;7/UA-::OTO/;O7U"+"$7/A"+"#8O[O8+
!$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
管苗植株粗壮!叶片增厚!表面出现轻微皱折!叶色
深绿!部分叶片畸形!但植株生长速度慢白化植株
的频率!尤其是来自愈伤组织用秋水仙碱处理后其
数量明显的增加!由于白化植株倍性难以确定而被
丢弃!秋水仙素的浓度和浸入时间对白化苗的生长
没有明显影响
经秋水仙碱处理过的离体茎尖和生根苗!其生
长和增殖受到不同程度的抑制!成活率随秋水仙碱
浓度的增高和处理时间的延长而降低处理后的试
管苗生长缓慢!胚轴增粗呈棒状!幼根根尖肿大呈鼓
锤状或褐色!其增粗程度随体积浓度提高或随处理
时间延长呈加剧趋势&其次是处理后的试管苗均表
现出一定的变异秋水仙碱体积浓度为
"+"$@
或
"+#@
!处理
$A
芽没有受害状!产生的新苗数量多!
但多为二倍体植株&处理
#"A
以上芽发生明显变
化!主要表现为芽胚轴膨大成棒状"图版
#
!#!幼根
根尖肿大呈鼓锤状或褐色"图版
#
!
%
#!叶片肥厚(变
宽(叶色深绿&处理时间超过
#$A
时!大部分芽褐
变!顶端生长点和胚根生长点受到严重抑制!在培养
过程中均先后死亡或是停止生长分化
:+<
!
多倍体的鉴定
:+<+9
!
形态学鉴定
!
与对照"图版
#
!
)
#试管苗相
比!经过处理的部分试管苗表现出扭曲矮化(生长缓
慢(茎秆变粗(叶片增厚(叶变宽(叶片颜色加深(叶
表面粗糙呈泡状等植株形态变异"图版
#
!
$
#基于
形态学变异!从
%$#
株成活苗中初步筛选出
#"
株
疑似四倍体试管苗"
%"+#2@
#对诱变成功的四倍
体植株进行增殖!仍然表现出器官巨大性!茎段粗
壮!叶片比二倍体大而厚!甚至叶形都发生了显著的
变化!由狭长变为钝圆"图版
#
!

#因此!不定芽增
殖是保存和扩繁新种质的有效途径!但增殖的新芽
倍性有待进一步的研究
试管苗移栽后!比较生长
!
年的四倍体与对照
二倍体植株"图版
#
!
*
#!发现
!
年后的四倍体植株
形态性状与双亲有较大差异!且大多表现出超亲优
势"表
!
#依据性状的差异!四倍体植株在株高(株
型"图版
#
!
0
#(叶宽"图版
#
!
2
#(叶厚(茎粗"图版
#
!
#"
#(茎壁厚(节间长等性状表现出超亲优势四
倍体植株高大!茎杆粗!生物产量高!表现为偏母本
性状&株型紧凑!茎秆直立密集!表现为偏父本性状&
节间着生腋芽!可作为区分杂种和双亲的形态标记
指标总体来说!异源多倍体表现出器官巨大型!大
多高于两亲本!表现出超亲优势!长势更强
:+<+:
!
流式细胞仪鉴定
!
以杂种二倍体植株为参
照!对形态明显变异植株进行流式细胞仪分析!分析
bG1
相对含量确定二倍体(四倍体和嵌合体植株
表
:
!
生长
:
年的四倍体与二倍体植株形态学比较
7^S8O!
!
cW
9<8<
J
-;78;<6
W
7T-.W
8<-A7/AA-
W
8<-A
J
T<]U9-/U]<
=
O7T.
材料类型
c7UOT-78
U
=W
O
植株高度
V87/U9O-
J
9U
%
;6
叶片长
IO/
J
U9<:
8O7:
%
;6
叶片宽
P-AU9<:
8O7:
%
;6
节间长
L/UOT/8O/
J
U9
%
;6
叶厚
IO7:U9-;`/O..
%
66
茎粗
3UO6]-AU9
%
66
茎壁厚
3UO6]78
U9-;`/O..
%
66
四倍体
O^UT7
W
8<-A !!+"$d##+2*71 *)+02d%+%#SY %+)d"+##71 #)+)#d#+!71 "+#2d"+"#71 #"+"0d"+71 !+)d"+%#71
二倍体
b-
W
8<-A #22+)d#%+%SY 0)+$"d)+$71 !+*d"+#SY #!+*"d!+%SY "+#)d"+"%)SY *+%)d"+2)SY #+*)d"+#*SY
!!
注$数据以平均值
d
标准表示&同列不同小写(大写字母分别表示
"+"$
和
"+"#
水平差异显著
G$
b7U7-.6O7/[78NOd.U7/A7TAAO[-7U-&
9^OA-::OTO/U/W
-U788OUUOT.6O7/..-
J
/-:-;7/UA-::OTO/;OSOU]OO/U9OUOUT7
W
8<-A7/AA-
W
8<-A7U"+"$7/A
"+"#8O[O8.
!
TO.
W
O;U-[O8
=
+
图
#
!
二倍体与四倍体再生苗的相对
bG1
含量
1+
四倍体
bG1
含量分布图&
Y+
杂种二倍体
bG1
含量分布图&
X+
嵌合体
bG1
含量分布
\-
J
+#
!
9^OTO87U-[ObG1;J
O/OT7UOA
W
87/U8OU.:T<6U9O9
=
ST-AA-
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W
8<-A
1+^9OA-.UT-SNU-W
<:U9ObG1;W
8<-A
&
Y+^9OA-.UT-SNU-W
<:U9ObG1
;W
8<-A
&
X+^9OA-.UT-SNU-W
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#
期
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黄丽芳!等$野生南荻与芒杂种多倍体诱导研究
通过比较
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相对含量分布图"图
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倍体"图
#
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#荧光通道值的
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倍处根据
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相
对含量看!初步筛选的变异植株
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为四倍体
除四倍体外!还检测出少量嵌合体!其
bG1
相对含
量图与混合样的
bG1
相对含量图较相似"图
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!
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#此外!还有一些处理组植株的
bG1
相对含量
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染色体制片技术检测
!
细胞学染色体计数
法可直接观察染色体并计数!是一种可靠(直观的鉴
定倍性的方法杂种二倍体材料"图版
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为四倍体
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版
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讨
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论
通过组织培养技术对远缘杂交种
#
代进行大
量扩繁后!采用秋水仙素进行化学诱导异源多倍体!
通过鉴定获得
#$
个异源四倍体株系!建立了芒属植
物远缘杂交和多倍体双重优势育种的新途径
试验中!采用秋水仙素加入培养基处理法和秋
水仙素溶液浸泡处理法都可获得一定频率的多倍体
植株&胚性愈伤组织浸泡处理获得了较多的成活试
管苗!嵌合体频率低!但秋水仙素溶液浸泡处理法对
愈伤组织的伤害较直接!且要经过多次的转移和冲
洗!增加了受污染的几率&离体芽尖在培养基上共培
养获得了较多的成活试管苗!操作简单!嵌合体频率
较低&生根苗在培养基上共培养!操作虽简单!诱变
率高!但获得很高频率的嵌合体!且生根苗所有处理
的植物都通过根吸收秋水仙碱!要比愈伤组织和离
体芽尖对秋水仙素的处理更敏感!导致大部分外植
体褐化死亡综上所述!秋水仙素溶液浸泡处理法
不论在操作还是在加倍效果上均不如秋水仙素加入
培养基处理法!离体芽尖共培养要比生根苗效果好
因此!处理离体芽尖是一种诱导芒属植物多倍体的
有效方法
本研究基于形态学变异和流式细胞仪初步判断
再生植株的变异率分别为
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%%+2@
!进一
步的染色体鉴定表明!其中有
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为真实的多倍
体植株形态观察是最简单而直观的倍性鉴定方
法!也是最粗放的鉴定方法所以通过形态学对倍
性进行初步的判断!有利于减少工作量流式细胞
仪具有方便(快速(可重复性强等优点!但不能区分
染色体丢失或者增加的现象染色体鉴定的操作虽
然比较繁琐!但染色体数目的细胞学鉴定无疑是多
倍体鉴定中最可靠最直接!也是目前应用最多的方
法本研究也是通过染色体计数的方法最终确定了
四倍体的真实性因此!综合运用形态学(流式细胞
仪及染色体压片!是鉴定多倍体的有效方法!既简
单(快捷!又能保证准确性
异源四倍体的诱导是以已鉴定为远缘杂交种的
#
代作为材料!使来源不同的
!
条染色体得到加
倍!从而达到试验预期的目的杂种
#
代的母本南
荻特征为散生状!茎秆自立稀疏!植株高大!茎粗!节
间着生腋芽!甚至萌发成侧枝而父本芒特征为丛
生状!茎秆直立密集!株高和茎径较小!节间无腋芽!
叶片直立&杂种
#
代综合了南荻和芒的特点!植株
丛生状!茎秆自立密集!植株高(茎径介于双亲!节间
着生腋芽生长
!
年的杂种
#
代异源四倍体植株
形态性状不仅出现介于两亲本之间的性状!还可以
出现某些超亲性状!甚至产生一些双亲都没有的新
性状例如!四倍体植株株型紧凑!茎秆粗壮!叶片
浓绿!叶片长度宽度也都比两亲本和其他二倍体杂
种要大!可以看出明显的优势!其优势正好解决了南
荻同源四倍体株型散生和杂种
#
代茎秆细弱等方
面的缺点实践证明!利用远缘杂交和多倍体双重
优势是获得高产优质新品种的一条有效途径
参考文献!
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