全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(４): ３６２￣３６７(２０１３)
收稿日期: ２０１３￣０１￣０３ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣２９
基金项目: 国家自然科学基金(３１１７１８２０)ꎻ 农业公益行业科技专项(２０１３０３０２１)
通讯作者: 刘 艳ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｌｉｕ＠ ｉｐｐｃａａｓ. ｃｎ
第一作者: 王亚娇ꎬ女ꎬ河北定州人ꎬ分子植物病理学硕士生ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙａｊｉａｏｗａｎｇ５１５＠１６３. ｃｏｍꎮ
小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、
抗体制备及应用
王亚娇１ꎬ 任堂雨２ꎬ 刘 艳１∗ꎬ 王锡锋１
( １ 中国农业科学院植物保护研究所ꎬ 植物病虫害生物学国家重点实验室ꎬ 北京 １００１９３ꎻ
２福建农林大学植物病毒研究所ꎬ 福建省植物病毒学重点实验室ꎬ 福州 ３５０００２)
摘要:小麦矮缩病毒(Ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬＷＤＶ)引起的小麦矮缩病是近年来我国小麦生产中的一种重要病毒病害ꎬ急需研
发快速精准的检测技术用于预测预报和病毒￣介体相互作用的研究ꎮ 本研究应用 Ｇａｔｅｗａｙ 重组技术构建了外壳蛋白基因
(Ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＣＰ)的原核表达载体ꎬ将重组表达载体转化大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａꎬ经 ＩＰＴＧ诱导获得 ＣＰ 基因原核表达蛋白ꎮ 以
重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备得到了相应的抗体ꎬＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明制备的抗体能与 ＣＰ重组蛋白、感病小麦
和带毒叶蝉特异性结合ꎬ说明获得的抗体特异性高ꎮ 用获得的抗体进行免疫荧光标记ꎬ观察到病毒分布在介体叶蝉的前中
肠和中中肠部位ꎬ为ＷＤＶ的预测预报和介体条沙叶蝉传毒机制的研究奠定了基础ꎮ
关键词:小麦矮缩病毒ꎻ 原核表达ꎻ 多克隆抗体ꎻ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔꎻ 免疫荧光标记
Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅ￣
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＡＮＧ Ｙａ￣ｊｉａｏ１ꎬ ＲＥＮ Ｔａｎｇ￣Ｙｕ２ꎬ ＬＩＵ Ｙａｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉ￣ｆｅｎｇ１
( １ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉ￣
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ Ｆｕ￣
ｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ (ＷＤＶ) ｈａｓ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｙｅａｒｓ. Ｉｔ ｉｓ
ｕｒｇｅｎｔ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｏｒｃａｓｔ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖｉｒｕｓ
ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ ＷＤＶ ＣＰ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｇａｔｅｗａｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ. ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｒｏｓｅｔｔａ. Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＰＴＧ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ. Ｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ＣＰ
ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ＷＤＶ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｔ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ ＷＤＶ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｍｉｄｇｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｕｐ￣
ｐｏｒｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎻ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙꎻ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔꎻ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｃｅ
中图分类号: Ｓ４３２. ４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３６２￣０６
小麦矮缩病毒(Ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬ ＷＤＶ)是
联体病毒科玉米线条病毒属的成员ꎬ属于第 Ｉ 亚组
联体病毒ꎬ是严重危害世界各地小麦产量的主要病
毒之一[１]ꎮ ＷＤＶ为孪生颗粒形态的植物病毒ꎬ颗
４ 期 王亚娇ꎬ等:小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用
粒直径约为 １８ ｎｍꎬ２０ 面对称ꎬ蛋白衣壳呈六边形ꎬ
全基因组由 ２ ７３９￣２ ７５０ 个核苷酸组成ꎮ 编码 ４ 个
蛋白ꎬ包括运动蛋白 (ＭＰ / ＶＩ)、外壳蛋白 (ＣＰ /
Ｖ２)、２ 个复制酶相关蛋白酶(ＲｅｐＡ 和 Ｒｅｐ)及 ２
个基因间隔区 ( ＬＩＲ 和 ＳＩＲ) [２]ꎮ 由条沙叶蝉
(Ｐｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘ ｓｔｒｉａｔｕｓ Ｌ. )以持久性非增殖方式传
播[３]ꎬ寄主包括小麦、大麦、燕麦和多种杂草ꎬ引起
植株的严重黄化、矮缩、条斑和分蘖增多等症状ꎮ
该病毒广泛分布在亚洲、欧洲、非洲的多个国
家[４ ~ ６]ꎮ Ｘｉｅ等[７]２００７ 年首次报道小麦矮缩病毒
在中国的发生ꎮ 该年小麦矮缩病毒在陕西韩城发
病面积约为 ０. ０７ 万 ｈｍ２ꎬ发病田平均病株率约为
８０％ ꎬ严重矮缩病株约占 ２０％ ꎬ发病田减产达 ５０％
~ ８０％ ꎬ造成严重的经济损失ꎮ 小麦矮缩病大面积
爆发主要依赖于介体条沙叶蝉的传播ꎬ检测条沙叶
蝉的带毒率是该病害预测预报的前提ꎬ通过介体传
毒机理的研究可有效控制小麦矮缩病的流行ꎮ
病毒特异性抗血清的制备和应用是病毒检测
最有效的手段之一ꎮ 但提纯病毒需要繁殖大量的
毒源并且提纯程序较为复杂ꎮ 本实验室前期研究
发现世界上不同地区的ＷＤＶ分离物 ＣＰ基因的同
源性很高ꎬ利用分子克隆的方法易于获得[８]ꎮ 本
研究克隆了ＷＤＶ的 ＣＰ 基因并进行了原核表达ꎬ
制备了多克隆抗体ꎬ应用该抗体观察了 ＷＤＶ 在带
毒条沙叶蝉中的分布ꎬ可为小麦矮缩病的预测预报
和条沙叶蝉的传毒机制研究提供参考ꎮ
１ 材料与方法
１. １ 材料
１. １. １ ＷＤＶ 毒源及介体条沙叶蝉 ＷＤＶ 侵染
的小麦病株采自陕西韩城ꎬ经 ＰＣＲ 检测和基因测
序确定为 ＷＤＶ 病株ꎮ 介体条沙叶蝉由本实验室
长期饲养ꎮ
１. １. ２ 菌株与载体 大肠杆菌 ＤＨ５α由本实验室
保存ꎻＲｏｓｅｔｔａ 菌株由福建农林大学魏太云教授馈
赠ꎻ入门载体 ｐＤＯＮＲ￣２２１ 和原核表达载体 ｐＤ￣
ＥＳＴ￣１７ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎮ
１. １. ３ 试验试剂 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ和 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 购自 Ｉｎ￣
ｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司ꎻＧｏａｔ ａｎｔｉ￣ｒｉｂｂｉｔ ＩｇＧ￣ＦＩＴＣ和 ＩＰＴＧ购
自 Ｓｉｇｍａ公司ꎻＰｒｏｔｅｉｎ Ａ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ
购自 Ｐｉｅｒｃｅ公司ꎻＮｉ２ ＋ ＮＴＡ 亲和层析柱购自美国
通用电气公司(Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ)ꎻ质粒提取试剂盒
和 ＤＮＡ 凝胶纯化试剂盒为天根生化科技有限公
司产品ꎮ
１. ２ 方法
１. ２. １ 引物合成 根据 ＧｅｎＢａｎｋ中ＷＤＶ的基因
序列(登录号:ＪＱ８３６５６８)ꎬ设计一对含有 ａｔｔＢ 位点
的特异性引物ꎬ其中上游引物 ( ａｔｔＢ ＣＰ￣Ｆ):５′￣
ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣ￣
ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧ￣３′ꎻ 下 游
引 物 ( ａｔｔＢ ＣＰ￣Ｒ ): ５′￣ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡ￣
ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧ￣
ＧＡＴＴＴＧＡＡＧ￣３′ꎬ用于扩增全长 ＣＰ基因ꎮ
１. ２. ２ 目的基因的获得和表达载体的构建 提取
小麦病叶的总 ＤＮＡꎬ利用 ａｔｔＢ ＣＰ￣Ｆ / Ｒ引物对扩增
得到 ＣＰ目的基因ꎮ 将侧翼含有 ａｔｔＢ 位点的 ＰＣＲ
产物纯化后ꎬ参照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司的 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ
Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 试剂盒说明ꎬ与入门克隆载体
ｐＤＯＮＲ￣２２１ 进行 ＢＰ 重组反应得到中间载体
ｐＤＯＮＲ２２１￣ＷＤＶ￣ＣＰꎮ 测序正确后参照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司的 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ试剂盒说
明ꎬ将中间载体和原核表达载体 ｐＤＥＳＴ￣１７ 进行
ＬＲ重组反应ꎬ得到目的载体 ｐＤＥＳＴ１７￣ＷＤＶ￣ＣＰꎮ
１. ２. ３ ＷＤＶ ＣＰ 基因的原核诱导表达 将目的载
体 ｐＤＥＳＴ１７￣ＷＤＶ￣ＣＰ转化 Ｒｏｓｅｔｔａ 表达菌株ꎬ将含
有重组表达质粒的 Ｒｏｓｅｔｔａ 菌液接种于含氨苄青霉
素和氯霉素的 ＬＢ 液体培养基中ꎬ３０℃、２５０ ｒｐｍ 培
养至 ＯＤ６００为 ０. ６ ~ ０. ９ꎬ加入 ＩＰＴＧ至终浓度为 ０. １
ｍｍｏｌ / Ｌꎬ３０℃继续诱导培养 ４ ｈꎮ ４ ｈ 后各收集
１ ｍＬ菌液ꎬ离心收集菌体ꎬ经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 凝胶电泳
和考马斯亮蓝染色分析蛋白的表达ꎮ 用 ６ × Ｈｉｓ 单
克隆抗体进行融合蛋白的 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析ꎮ 优化
诱导条件诱导可溶性蛋白ꎬ收集菌体超声波破碎细
胞后于 １２ ０００ ｒｐｍ离心 １５ ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ并应用
Ｎｉ２ ＋ ＮＴＡ亲和层析柱纯化回收蛋白ꎮ
１. ２. ４ 抗血清的制备及检测 纯化后的可溶性蛋
白与完全弗氏佐剂乳化后ꎬ皮下多点免疫于新西兰
雄兔ꎬ１０ ｄ后进行第 ２ 次免疫ꎬ以后每隔一周加强
免疫ꎬ加强免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化ꎬ大腿
肌肉注射方法ꎮ 每次免疫后 ５ ｄ 取少量血清ꎬ用间
接 ＥＬＩＳＡ测定抗体的效价ꎬ当效价达到 １∶ １００ ０００
以上时ꎬ取血并分离血清ꎮ 采用 ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ￣Ｓｅｐｈａ￣
ｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ 从抗血清中提纯获得 ａｎｔｉ￣
ＷＤＶ￣ＣＰ￣ＩｇＧꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ特异性分析ꎮ
１. ２. ５ 免疫荧光法检测介体体内的 ＷＤＶ 病毒
解剖镜下解剖出带毒介体条沙叶蝉的消化道ꎬ用
３６３
植物病理学报 ４３ 卷
４％的多聚甲醛固定 １ ｈꎬ磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)清洗
３ 次ꎻ０. ２％ Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ￣１００ 渗透 ２ ｈꎬＰＢＳ 清洗 ３ 次ꎻ
加入用抗体稀释液 (含有 ３％ 牛血清白蛋白的
ＰＢＳ)稀释后的一抗 ａｎｔｉ￣ＷＤＶ￣ＣＰ(１∶ ２０)孵育 １ ｈꎬ
ＰＢＳ清洗 ３ 次ꎻ再用稀释后的二抗 ａｎｔｉ￣ｒｉｂｂｉｔ ＩｇＧ￣
ＦＩＴＣ(１∶ ２００)孵育 １ ｈꎬＰＢＳ清洗 ３ 次ꎻ最后将消化
道固定在载玻片上ꎬ用共聚焦显微镜(Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ
ＳＰ５ꎬ Ｇｅｒｍａｎｙ)观察分析ꎮ
２ 结果与分析
２. １ ＷＤＶ ＣＰ基因的获得
提取感染ＷＤＶ的小麦叶片总 ＤＮＡ通过 ＰＣＲ
获得 ８４３ ｂｐ 大小的条带ꎬ它是由额外增加的 ａｔｔＢ
位点的 ６１ ｂｐ 引物核苷酸和 ７８２ ｂｐ 的全长 ＣＰ 基
因组成(图 １)ꎮ 将回收纯化的 ＰＣＲ 产物与载体
ｐＤＯＮＲ￣２２１ ＢＰ 进行重组反应获得中间载体
ｐＤＯＮＲ￣２２１￣ＷＤＶ￣ＣＰꎮ
２. ２ 原核表达载体的构建及重组蛋白的表达与
纯化
中间载体测序验证正确后和目标载体 ｐＤＥＳＴ￣
１７ 进行 ＬＲ重组反应获得原核表达载体 ｐＤＥＳＴ１７￣
ＷＤＶ￣ＣＰꎮ 将构建的表达载体转入到大肠杆菌表
达菌株Ｒｏｓｅｔｔａ感受态细胞中 ꎮ３０℃ 、２５０ ｒｐｍ经
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＰ ｇｅｎｅ ｏｆ ＷＤＶ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＬ２ ０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ ２: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ.
ＩＰＴＧ诱导表达 ４ ｈ 后收集菌体ꎬ经 １２％的 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ凝胶电泳检测ꎬ在诱导处理的样品中检测到
目的蛋白特异表达ꎬ大小约为 ２９ ｋＤꎬ与预计的融
合蛋白大小一致ꎬ而在未诱导的样品中没有检测到
目的条带(图 ２￣Ａ)ꎮ 因表达的蛋白带有 ６ × Ｈｉｓ标
签靶序列ꎬ故利用 ６ × Ｈｉｓ 标签单克隆抗体进行
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析ꎬ结果发现表达的重组蛋白能与
６ × Ｈｉｓ单克隆抗体起特异性反应(图 ２￣Ｂ)ꎬ表明
ＷＤＶ的外壳蛋白基因已经在大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ 中
融合表达ꎮ 但诱导的蛋白为包涵体蛋白ꎬ如果对蛋
白进行纯化ꎬ需可溶性的蛋白ꎬ因此对诱导条件进
Ｆｉｇ. ２ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ (Ａ) ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ (Ｂ) ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ
ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ (Ｃ)
Ａ: ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＷＤＶ. Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒꎻ
Ｌａｎｅ １: ｐＤＥＳＴ￣１７ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｒｏｓｅｔｔａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧꎻＬａｎｅ ２: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ.
Ｂ: Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＷＤＶ. Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒꎻ
Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｃ: ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＷＤＶ ＣＰ ｇｅｎｅ.
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒꎻＬａｎｅ １: ｐＤＥＳＴ￣１７ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｒｏｓｅｔｔａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎻＬａｎｅ ３: Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ.
４６３
４ 期 王亚娇ꎬ等:小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用
行了优化ꎮ 在菌液 ＯＤ６００达到 ０. １ 时ꎬ加入 ０. １
ｍｍｏｌ / Ｌ的 ＩＰＴＧꎬ１６℃、１００ ｒｐｍ 过夜诱导ꎬ收集菌
体利用超声波破碎后ꎬ分别对上清和沉淀进行收
集ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳检测发现上清沉淀中均有
目的蛋白ꎬ上清有少量可溶性蛋白ꎬ沉淀中仍有包
涵体蛋白存在(图 ２￣Ｃ)ꎮ 回收纯化可溶性蛋白ꎬ用
于制备抗体ꎮ
２. ３ 抗血清制备及特异性检测
将回收纯化的可溶性 ＣＰ蛋白作为抗原免疫新
西兰兔ꎬ制备多克隆抗体ꎬ用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析抗血
清对ＷＤＶ的特异性ꎮ 提取健康小麦ꎬ感病小麦以
及带毒介体￣条沙叶蝉的总蛋白ꎬ经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶
电泳后ꎬ转移到硝酸纤维素膜上ꎬ用封闭缓冲液稀释
的 ＣＰ多克隆抗血清作为一抗(１∶ ５ ０００稀释)进行
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测ꎮ 结果显示ꎬ多克隆抗血清能与
ＣＰ重组蛋白ꎬ感染ＷＤＶ植株以及带毒条沙叶蝉的
提取液有特异反应ꎬ均有一条约 ２９ ｋＤ的条带ꎬ而与
健康植株的提取液无任何特异性反应(图 ３)ꎬ说明
制备的抗血清具有很好的特异性ꎮ
２. ４ ＷＤＶ病毒在条沙叶蝉中的分布
参照 Ｗｅｉ 等[９]的方法进行免疫荧光实验 ꎬ二
龄条沙叶蝉饲毒２ ｄ后ꎬ解剖出消化道ꎬ免疫荧光
Ｆｉｇ. ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＣＰ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔꎻ Ｌａｎｅ ３:
ＷＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｈｅａｌｔｈｙ ｗｈｅａｔ
ｐｌａｎｔ.
法进行标记ꎮ 在共聚焦显微镜下发现抗体能够特
异性地结合病毒(绿色荧光标记) (图 ４￣Ａ)ꎬ而未
带毒叶蝉体内未发现荧光信号(图 ４￣Ｂ)ꎬ说明制备
的抗体能很好地用于介体内小麦矮缩病毒的检测ꎮ
ＷＤＶ主要分布在条沙叶蝉的前中肠和中中肠部
位ꎬ在其它部位未发现明显荧光信号ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＷＤＶ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ
ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ｆｃ ＝ ｆｉｌｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒꎻ ａｍ ＝ ａｎｔｅｒｉｏｒꎻ ｍｍ ＝ｍｉｄｄｌｅꎻ ｐｍ ＝ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｍｉｄｇｕｔꎻ ｍｔ ＝ ｍａｌｐｉｇｈｉａｎ ｔｕｂｕｌｅｓ.
Ａ: Ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ ｏｒｇａｎｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｅｄ ｆｏｒ ＷＤＶ ｗｉｔｈ ＦＩＴＣ (ｇｒｅｅｎ) .
Ｂ: Ｎｏｎｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ ｏｒｇａｎｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
５６３
植物病理学报 ４３ 卷
３ 讨论
由于病毒粒子的外壳蛋白和表面突起极其不
稳定ꎬ在病毒的纯化过程中容易丢失ꎬ所以一般提
纯的病毒都是各种亚病毒粒子的混合物ꎮ 故采用
提纯病毒粒子的方法制备抗血清的效价、灵敏性和
特异性均较差ꎬ且用提纯的亚病毒粒子制备的抗血
清对病毒外壳蛋白不能起特异反应ꎬ限制了利用血
清学方法对该病毒的检测ꎮ 本研究利用原核表达
系统表达了ＷＤＶ的外壳蛋白ꎬ以此为抗原制备多
克隆抗血清具有较高特异性ꎬ为病毒的检测及其功
能研究提供了便利条件ꎮ 本试验应用 Ｇａｔｅｗａｙ 重
组技术将 ＷＤＶ￣ＣＰ 重组插入原核表达载体 ｐＤ￣
ＥＳＴ１７ꎬ整个过程不需要使用限制性内切酶和连接
酶ꎬ可以高效快速地获得 ＷＤＶ￣ＣＰ 的原核表达载
体ꎮ 外源基因在大肠杆菌内表达易形成包涵体蛋
白ꎬ包涵体形成是比较复杂的ꎬ与胞质内蛋白质生
成速率有关ꎬ新生成的多肽浓度较高ꎬ无充足的时
间进行折叠ꎬ从而形成非结晶、无定形的蛋白质的
聚集体[１０]ꎮ 包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集
体ꎬ不具有生物学活性且不易纯化回收[１１]ꎮ 为了
更容易提取纯化蛋白ꎬ本研究采取在菌体低浓度条
件下低温低转速诱导ꎬ降低了蛋白的合成速度ꎬ在
菌液 ＯＤ６００为 ０. １ꎬ加入 ０. １ ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ＩＰＴＧꎬ
１６℃、１００ ｒｐｍ过夜诱导条件下ꎬ部分重组蛋白可
溶ꎬ促进 ＣＰ蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达ꎬ为
纯化蛋白制备特异性抗体奠定了基础ꎮ
绝大多数植物病毒依赖于昆虫介体传播而流
行危害ꎬ切断病毒的介体传播是控制病毒病的有效
途径之一[１２]ꎮ 因而明确病毒介体传播的机制具有
重要的理论和实践意义ꎮ Ｃｈｅｎ 等[１３]通过免疫荧
光标记的方法观察了水稻矮缩病毒在介体黑尾叶
蝉体内的分布ꎻＡｍｍａｒ 等[１４]通过免疫荧光标记和
电镜观察的方法观察了玉米条纹病毒在介体叶蝉
滤室和中肠的分布 Ｃｈｅｎ 等[１５]验证了莴苣侵染性
黄化病毒 ＣＰｍ蛋白介导病毒在介体体内的滞留与
传播ꎮ 本研究已经获得了高浓度的 ＷＤＶ￣ＣＰ重组
蛋白并制备了抗体ꎬ用此抗体检测到 ＷＤＶ 在介体
条沙叶蝉体内的分布ꎮ ＷＤＶ 在介体体内的运动
过程以及ＷＤＶ 与介体的互作机制的研究正在进
行中ꎮ 本试验为研究其它昆虫的获毒、病毒与介体
的特异性识别以及病毒在昆虫体内的运动提供了
理论参考ꎮ
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责任编辑:于金枝
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