全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"#)!!
基金项目$国家自然科学基金"
%#",#&%%
#
作者简介$邹郁陶"
#**"(
#!女!在读硕士研究生!主要从事玉米遗传育种与生物技术研究
1)23.4
$
&$,$#"&!
!55
+672
"
通信作者$李晚忱!教授!主要从事玉米遗传育种与生物技术研究
1)23.4
$
3829
:
2/
!
/.638+;98+60
玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因
的启动子克隆与功能验证
邹郁陶!刘
!
鑫!牟
!
巍!高学焕!付凤玲!李晚忱"
"四川农业大学 玉米研究所!成都
###%"
#
摘
!
要$该研究在生物信息学分析的基础上!克隆玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因"
!"#%
#的启动子序列
"
$
!"#%
#!进行非生物逆境应答元件分析以及实时定量
<=>
验证其非生物逆境胁迫响应特性!构建了
$
!"#%
启
动子驱动报告基因"
"%&
#表达载体!基因枪法转化玉米愈伤组织!通过
?@A
染色验证
$
!"#%
启动子在非生物逆
境胁迫下的驱动活性再根据启动子序列分析结果!去除不同的顺式作用元件!构建不同长度
$
!"#%
启动子驱动
报告基因
"%&
表达载体!农杆菌介导法转化烟草叶盘!以确定
$
!"#%
启动子的最短活性序列结果显示$
$
!"#%
启动子长
#$$&B
C
!存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件!在干旱(高盐(低温胁迫及脱落酸(乙
烯诱导下驱动
!"#%
基因增量表达!用以驱动
"%&
基因转化玉米愈伤组织!在高渗(高盐(低温胁迫及脱落酸诱导
下具有驱动活性!且截短至
%!$B
C
仍可保持驱动活性研究表明!
$
!"#%
启动子的确有非生物逆境诱导启动活
性!进一步验证其作用机理后可运用于玉米抗逆转基因研究
关键词$非生物胁迫&胚胎发生后期丰富蛋白&玉米&启动子
中图分类号$
D,E*
文献标志码$
F
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5
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4.0
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KLO306P;0
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A.6P830F
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=P.03
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C
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670J3.0.0
R
284J.
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C
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309.0986J.707V3B/6./.636.9
309;JP
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C
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J.7036J.U.J
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R
P7/27J.6
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R
P/34J
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47XJ;2
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T727J.7036J.U.J
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3B.7J.6/JT;//
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C
T7J;.0
&
23.S;
&
C
T727J;T
!!
近年来!人类活动和气候变化等引起的非生物
胁迫愈加严重!已成为中国及世界许多地区作物生
产的主要限制因素)#*耐旱(耐盐碱等对非生物逆
境的抗性一直是常规玉米育种的重要目标性状虽
然不同玉米种质对非生物逆境的抗性存在明显差
异!但其遗传性质较为复杂!多年来遗传改良的进展
不大!难以满足玉米生产对品种抗逆性的要求)!)&*
转基因技术可转化利用外源抗性基因!是改良玉米
非生物逆境抗性的有效途径)$)**然而!在以往的转
基因研究中!多采用
2.(
4
2(0(5
(
6/!7%$&
等组成型
强启动子驱动外源基因的表达虽然抗逆性得以改
良提高!但外源抗逆基因的持续表达!过量消耗植物
营养和能源!又会阻碍植物的正常生理代谢!致使非
胁迫条件下的生长发育受到制约!限制了产量潜力
的进一步发挥)#")#%*转而改用诱导型启动子!只在
逆境胁迫时才驱动外源抗性基因表达!渡过逆境后
又恢复正常!就可降低外源基因过量表达造成的适
应性代价)#&*而且还有研究表明!用内源诱导型启
动子的驱效率往往比外源诱导型启动子要高)#$)#,*
因此!要很好地发挥外源基因在非生物逆境抗
性转基因玉米种质培育中的作用!除对外源基因本
身的功能选择外!还应注重选择适当的内源诱导型
启动子!既可在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆
基因的表达!提高玉米对非生物逆境的抗性!又可在
非胁迫条件下降低外源基因过量表达造成的适应性
代价因为玉米功能基因组研究比拟南芥和水稻等
模式植物滞后!除发现胚胎发生后期丰富蛋白基因
,/.#,
和转录因子基因
7
$
#
"
7(8(
$
/,-2)#
#的启动
子响应脱落酸诱导)#E)#**!磷脂酰乙醇胺
\)
甲基转移
酶基因
93:;*!<
的启动子区域存在高盐(高温
应答元件)!"*!抗病基因
93=>?#
的启动子区域存
在茉莉酸(赤霉素和脱落酸应答元件!可在非生物逆
境胁迫条件下驱动下游基因的表达而外)!#*!鲜有关
于玉米内源非生物逆境诱导启动子克隆及功能验证
方面的报道
胚胎发生后期丰富蛋白"
K1F
#可在脱水(高渗
和低温等非生物逆境胁迫下保护细胞内其他蛋白的
活性)!!)%"*其中!尤以第
%
亚家族的
K1F
蛋白的这
种保护作用最为明显)!,)%"*转化利用
K1F
蛋白的
编码基因!可以提高植物对非生物逆境的抗性)E)**
而且!
K1F
蛋白编码基因的启动子对各种非生物逆
境胁迫也有应答!可在植物转基因操作中用以驱动
其他抗逆基因的逆境诱导表达)%#)%!*本研究在前人
研究的基础上)!!!*!先用实时定量
<=>
"
5
>Y)<=>
#
验证玉米
K1F
蛋白第
%
亚家族一个成员的编码基
因
!"#%
在非生物逆境胁迫下的诱导表达!然后对
其上游序列作启动子分析!并克 隆 其 启 动 子
$
!"#%
!用以构建驱动报告基因
"%&
的表达载体!
基因枪法转化玉米愈伤组织通过愈伤组织的
?@A
荧光值与荧光素酶"
K@=
#发光值的比值
?@A
%
K@=
!评价
$
!"#%
启动子在非生物逆境胁迫
及激素诱导条件下的驱动活性!以期为抗逆转基因
玉米研究提供更多的选择
#
!
材料和方法
>+>
!
实验材料
为验证
$
!"#%
启动子对非生物逆境胁迫的响
应!先在各种不同的非生物胁迫及激素诱导条件下!
5
>Y)<=>
检测
!"#%
基因的差异表达取玉米自
交系+
#,E
,种子!
#"] \3=4H
消毒后发芽至二叶期!
用改良
Z73
R
4309
营养液培养至四叶期)%%*!分别用
#]
聚乙二醇
"""
"
<1?)"""
#模拟干旱)%&*和高盐
"
!""2274
-
K
(#
\3=4
#处理
,!P
!低温"
&^
#和高
温"
&!^
#处理
!&P
!以及
#""
"
274
-
K
(#脱落酸
"
F_F
#和
#""
"
274
-
K
(#乙烯利诱导
!&P
!
%
次重
复在模拟干旱(高盐处理的
"
(
#!
(
!&
(
&E
(
,!P
!以
及低温(高温处理和
F_F
(乙烯利诱导的
"
(
!
(

(
#!
(
!&P
取样!用
YT.S74
试剂盒"
Y3` 3>3
!大连#提
取总
>\F
!再用
C
J
YN试剂盒"
Y3` 3>3
!大
连#反转录成
6a\F
!稀释
$
倍后作
5
>Y)<=>
模板
>?@
!
非生物胁迫处理与
A
BCD8$B
检测
根据玉米
K1F
蛋白第
%
亚家族成员
N?K%
"
?;0_30[
登录号
\<
.
""##"$!*E
#对应的
2>\F
序列"
?;0_30[
登录号
\N
.
""####E!E
#
)
!!
!

*
!用
软 件 "
PJJ
C
$%%
XXX+
C
T;2.;TB.7/7VJ+
672
#设计特异
<=>
引物"
$b)?F===Y?YYY?=Y)
Y?YY=)%b
%
$b)F=F=YY?FY?F=?=F?FF)%b
#!
生工生物工程公司"上海#合成以玉米
#E&
基因
&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
作内参!
#"
"
K
反应体系包括$荧光染料
A/7Q3/J
1U3?T;;0/8
C
;T2.W
"
_.7)>39
!美国#
$+"
"
K
(上下游
引物"
#"+"
"
274
-
K
(#
#各
"+$
"
K
和稀释后的
6a)
\F
模板
#+"
"
K
在
=QM*
定量
<=>
仪"
_.7)
>39
!美国#进行反应反应程序为$
*E^
预变性
!
2.0
&
*E^
变性
!/
!
"+!^
退火
#"/
!循环
&&
次
然后!以每步
"+$^
%
"+"#/
速度升高至
*$^
!绘制
熔解曲线采用双标准曲线法对
!"#%
基因的表
达水平进行相对定量测定!计算不同胁迫或诱导时
间
!"#%
基因表达量相对于
"P
对照的倍数
>+E
!
启动子序列分析与克隆
以玉米
K1F
蛋白第
%
亚家族成员
N?K%
对应
的
2>\F
序列为探针)!!!*!与玉米自交系+
_,%
,基
因组
>;V?;0
.
U%
版本"
PJJ
C
$%%
XXX+06B.+042+0.P+
R
7U
%
08667T;
%#序列比对!定位
!"#%
基因在基因组
中的物理位置用启动子分析软件
<430J=F>1
"
PJJ
C
$%%
B.7.0V7T23J.6/+
C
/B+8
R
;0J+B;
%
X;BJ774/
%
C
430J63T;
%
PJ24
%#!查找编码序列上游
#$""B
C
以内
的
=FFY
与
YFYF
框等重要启动子序列特征!预
测
$
!"#%
启动子序列!并分析其中与非生物胁迫
应答相关的顺式作用元件
根据预测结果!用
软件"
PJJ
C
$%%
XXX+
C
T;2.;TB.7/7VJ+672
#设计特异
<=>
引物"
$b)
FF?=YY?FF=Y=Y=?F==Y=F??FYFF=Y=)
%b
%
$b)??FY==??=F?=F???Y=Y=Y=FF?)%b
#!
并引入载体构建所需要的限制性内切酶
@(59
#
和
A/3Z
$
的识别位点"括号中下划线部分#以玉米
自交系+
_,%
,的基因组
a\F
为模板!用高保真
a\F
聚合酶
<=>
扩增
$
!"#%
启动子序列
!"
"
K
反应体系包括$
<=>
缓冲液
AW
"
N
R
!c
#
&
"
K
!
9\Y<#+&
"
K
!上下游引物各
"+$
"
K
!玉米自交系+
_,%
,基因组
a\F#
"
K
!
a\F
聚
合酶
ZA"+!
"
K
!
99Z
!
H
至
!"
"
K

<=>
反应程序为$
*E^
预变性
%2.0
&
*E^
变性
#"
/
!
"^
退火
#$/
!
,!^
延伸
*"/
!
%$
个循环&
,!^
延伸
$2.0
&
^
保存扩增产物用
!]
琼脂糖凝胶
电泳分离!回收纯化
#$""B
C
左右的目的片段
>+F
!
瞬时表达载体构建与玉米愈伤组织转化
用限制性内切
@(59
#
和
A/3Z
$
分别双酶切
上述回收纯化的
<=>
扩增产物和单子叶植物瞬时
表达载体
C
_L!!#)%.(B"%&
)
%$
*
!琼脂糖凝胶电泳分
离!回收(纯化
$
!"#%
启动子序列和去除组成型启
动子
%.(
序列的表达载体片段!用
Y
&
a\F
连接酶
"
Y3` 3>3
!大连#连接!构建
$
!"#%
启动子驱动报
告基因
"%&
的瞬时表达载体
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
"图
#
#!热激法转化大肠杆菌
aZ$
%
菌株的感受态
细胞!经氨苄青霉素抗性培养基上筛选后扩大培养!
菌液
<=>
和
@(59
#
和
A/3Z
$
双酶检测后!送生
工生物工程公司"上海#测序验证
取浓度为
#+"
"
R
-
"
K
(#瞬时表达载体
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
质粒
a\F%
"
K
!并以单子叶植物组
成型启动子
%.(
驱动荧光素酶基因
#%6
的表达载
体
$
%.(B#%6
为内参!以消除愈伤组织间基因枪转
化率的差异加入
!"
"
K"+$274
-
K
(#亚精胺和
$"
"
K!+$274
-
K
(#
=3=4
!
!沉淀到
%2
R
直径
"
"
2
的金粉"金粉-甘油
d"2
R
-
2K
(#
#上!用乙
醇和无菌蒸馏水反复洗涤!涡旋震荡并用色谱级
#&"
"
K,"]
乙醇洗涤后!加入
"
"
K
无水乙醇!涡
旋震荡
#2.0
并用超声波处理
%
&
$/
使金粉分散悬
浮在
a8<70J%
Z;
型基因枪上!以
##""
C
/.
系统压力和
,"62
汞柱真空度!每枪
#+"
"
R
-
2
R
(#
"质粒%金粉#!转化在
高渗培养基上预培养
&P
的玉米胚性愈伤组织各
#"
皿)%*!每皿
#""
块愈
伤组织
>?G
!
9HI
染色检测
将转化后的愈伤组织转接到
继代培养基
上!
,^
黑暗培养
!9
后!选大小和形态基本一致
的愈伤组织各
#$
皿!每皿
"
块愈伤组织!分别实施
高渗"
E]
甘露醇#(高盐"
!""2274
-
K
(#
\3=4
#(低
温"
&^
#处理和
F_F
"
#""
"
274
-
K
(#
#诱导
!&P

每处理
%
皿!其余
%
皿作空白对照处理结束后!用
e;V;T/70
等)%,*的方法染色!解剖显微镜下观察照像
>+J
!
Gb)
端缺失实验
为确定
$
!"#%
启动子具有启动活性的最短序
列!根据启动子序列分析结果设计

对
<=>
引物
Q#
%
>#
(
Q#
%
>!
(
Q!
%
>#
(
Q%
%
>#
(
Q&
%
>#
和
Q$
%
>!
!以
玉米自交系+
_,%
,基因组
a\F
为模板!分别扩增
图
#
!
$
!"#%
启动子驱动报告基因
"%&
表达载体"
C
_L!!#)
C
N?K%)?@A
#
Q.
R
+#
!
1W
C
T;//.70U;6J7TV7TT;
C
7TJ;T
R
;0;
"%&809;T670JT747V
$
!"#%
C
T727J;T
$$
&
期
!!!!!!!!!!
邹郁陶!等$玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证
$!"#%
启动子序列全长的
#$$&B
C
片段(增加
$b)
端非编码序列"
$b)80JT30/43J;9T;
R
.70
!
$b)@Y>
#的
#,!"B
C
片段!以及去除不同非生物胁迫应答元件
的
##!*
(
*"
(
&!*
和
%!$B
C
片段!通过相应的酶切
连接取代包含双子叶植物增强子
*0*C@$b)%<=
的表达载体
C
>L!"#)*DB"%&
"
Y3` 3>3
!大连#中的
%$&
启动子"图
!
#!并以组成型强启动子
2.(
4
2(0(5
为对照!构建瞬时表达载体!农杆菌介导法转化大叶
烟草品种+
O./670/.0%E
,叶盘!经筛选鉴定后分化
培养愈伤组织!
?@A
染色鉴定上述截短片段是否能
够驱动
"%&
基因表达
!
!
结果与分析
@?>
!
123E
基因在非生物逆境胁迫下诱导表达
对
5
>Y)<=>
结果的方差分析表明!在模拟干
旱胁迫初期"
&
!&P
#!
!"#%
基因表达水平与
"P
空白对照无差异!但在
&EP
时有一表达高峰!
,!P
后下降"图
%
#在高盐胁迫下!
!"#%
基因的表达
从
#!P
开始上升!
&P
达到高峰!随后下降"图
%
#
在低温胁迫下!
!"#%
基因表达的高峰出现在
P
!
其他时间段与
"P
空白对照无显著差异"图
&
#
!"#%
基因表达对高温胁迫的应答不明显!只在
!&P
后才略有升高"图
&
#在
F_F
和乙烯诱导下!
!"#%
基因表达的高峰分别出现在
P
和
!P
!其余时间段
与
"P
空白对照的差异不显著"图
&
#结果表明!
!"#%
基因的表达响应多种非生物逆境胁迫!其启动
子
$
!"#%
很可能具有非生物逆境启动活性
@?@
!
4
123E
启动子序列
以玉米
K1F
蛋白第
%
亚家族成员
N?K%
对应
的
2>\F
序列为探针!与玉米自交系/
_,%
0基因组
>;V?;0
.
U%
版本序列比对!将
!"#%
基因定位于第

染色体
=PT
$
#!#!%!%
&
#!#%$EE
!与此段基
因组序列的一致性为
#""]
用
<430J=F>1
软件
图
!
!
包含双子叶植物增强子
*0*C@
$b)%<=
的表达载体"
C
>L!"#)*DB"%&
#
Q.
R
+!
!
1W
C
T;//.70U;6J7T670J3.0.0
R
9.67J
:
4;97078/
;0P306;T*0*C@$b)%<=
对其编码序列上游
#$""B
C
"
=PT
$
#!#"*,*
&
#!#!&,E
#启动子序列分析表明!除
YFYF
框等启
动子序列的基本元件外!还包括
NI_
结合位点
N_A
(脱水应答元件
F_>1
及
F>1
等多种响应非
生物逆境胁迫的顺式作用元件"图
$
(表
#
#
@?E
!
逆境胁迫下
4
123E
驱动
250
基因瞬时表达
根据启动子序列分析设计的特异
<=>
引物!以
玉米自交系+
_,%
,基因组
a\F
为模板!扩增得到的
片段约长
#$""B
C
"图

#!实际测序结果为
#$$&
B
C
!与预测结果相符合
扩增片段经
@(59
#
和
A/3Z
$
双酶切后插入
单子叶植物表达载体
C
_L!!#)%.(B"%&
!构建成
!"#%
基因启动子驱动
"%&
基因的表达载体
C
_L!!#)
$
!A#%B"%&
!转化大肠杆菌感受态细胞!
经菌液
<=>
检测挑阳性克隆扩大培养!再经
@(59
#
和
A/3Z
$
双酶切鉴定"图
,
#和测序验证!与预
期相符
用表达载体
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
基因枪法转
化玉米胚性愈伤组织!在
E]
甘露醇高渗(
!""2274
-
K
(#
\3=4
高盐和
&^
低温胁迫及
#""274
-
K
(#
F_F
诱导条件下!
?@A
染色均可显现靛蓝色斑点!
图
%
!
!"#%
基因在干旱和高盐胁迫下的差异表达
Q.
R
+%
!
a.VV;T;0J.34;W
C
T;//.707V!"#%
R
;0;
809;T9T78
R
PJ309P.
R
P/34J/JT;//;/
图
&
!
!"#%
基因在低温(高温胁迫和
F_F
(乙烯诱导下的差异表达
Q.
R
+&
!
a.VV;T;0J.34;W
C
T;//.707V!"#%
R
;0;809;T
6749309P;3J/JT;//;/
!
309F_F309;JP
:
4;0;.0986J.70
$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
玉米
!"#%
基因启动子序列及其非生物逆境胁迫应答元件
下划实线表示非生物逆境胁迫应答元件!下划虚线表示截短引物
Q.
R
+$
!
5
8;06;7V23.S;!"#%
R
;0;3093B.7J.6/JT;//)T;/
C
70/.U;;4;2;0J/
YP;3B.7J.6/JT;//)T;/
C
70/.U;;4;2;0J/3T;809;T4.0;9B
:
/74.94.0;/
!
309JP;JT8063J.70
C
T.2;T/3T;809;T4.0;9B
:
97JJ;94.0;/
表
>
!
玉米
123E
基因启动子的非生物逆境胁迫应答元件
Y3B4;#
!
FB.7J.6/JT;//)T;/
C
70/.U;;4;2;0J/.0
C
T727J;T7V23.S;!"#%
R
;0;
元件
14;2;0J
参考物种
>;V;T;06;/
C
;6.;/
核心序列
=7T;/;
5
8;06;
定位
K763J.70
功能
Q806J.70
F_>1
拟南芥
*E0F/G(/5/
YF=?Y?
F=?Y??=
(*%*
(
(!E$
(
(!E#
(
(!&$B
C
F_F
应答
F_FT;/
C
70/;
F_>1
大麦
_3T4;
:
?==F=?YF=F
=?YF=?Y?=F
==YF=?Y??=
($#$
(
(&!*B
C
F_F
应答
F_FT;/
C
70/;
F>1
玉米
N3.S; Y??YYY (#$$
(
(%#B
C
增强厌氧诱导
10P306;9303;T7B.6.0986J.70
=FY)B7W
拟南芥
*E0F/G(/5/ ?==F=Y ($
(
("B
C
分生组织表达
N;T./J;2;W
C
T;//.70
==FFY)B7W
大麦
_3T4;
:
=FF=?? (#$&B
C
NI_ZU#
结合位点
NI_ZU#B.09.0
R
/.J;
N_A
拟南芥
*E0F/G(/5/ =FF=Y?
%
YFF=Y? (#,"
(
(##,
(
(#"$%B
C
NI_
结合位点
NI_B.09.0
R
/.J;
N_A
玉米
N3.S; =??Y=F (%*!B
C
NI_
结合位点
NI_B.09.0
R
/.J;
Y=)T.6PT;
C
;3J
烟草
Y7B3667 FYYYY=YY=F (,,#B
C
防卫和胁迫响应
a;V;0/;309/JT;//T;/
C
70/;
Y=F);4;2;0J
烟草
Y7B3667 ==FY=YYYYY (##"B
C
水杨酸反应
A34.6
:
4.636.9T;36J.70
,$
&
期
!!!!!!!!!!
邹郁陶!等$玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证
而空白对照没有显现"图
E
#!说明
$
!"#%
启动子的
确有非生物逆境诱导启动功能
@+F
!
保持启动活性的截短片段
瞬时表达载体转化烟草愈伤组织的
?@A
染色
结果表明!
$b
端截短不同长度的
$
!"#%
启动子片
段!均能驱动
?@A
的表达!愈伤组织呈现靛蓝色斑
点"图
*
#一直截短至
%!$B
C
仍可保持
$
!"#%
启
图

!
!"#%
基因启动子扩增片段
N+aK!"""
&
#+
$
!"#%
启动子
Q.
R
+
!
F2
C
4.V.;9VT3
R
2;0J7V23.S;!"#%
R
;0;
C
T727J;T
N+aK!"""
&
#+
$
!"#%
C
T727J;T
动子的驱动活性由此说明!这
%!$B
C
上游的非生
物逆境胁迫应答元件!虽然可能响应胁迫诱导而增
强
$
!"#%
启动子的活性!但并不是保持驱动活性
所必需的
图
,
!
表达载体
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
酶切鉴定
N+aK!"""
&
#+
表达载体
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
经
@(59
#
和
A/3Z
$
双酶切片段
Q.
R
+,
!
10/
:
2;9.
R
;/J.707V;W
C
T;//.70U;6J7T
C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
N+aK!"""
&
#+1W
C
T;//.70U;6J7T
C
_L!!#)
$
!"#%)
"%&9.
R
;/J;9B
:
@(59
#
309A/3Z
$
图
E
!C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
转化玉米愈伤组织
?@A
染色
Q.
R
+E
!
?@A/J3.0.0
R
7V23.S;634.JT30/V7T2;9B
:C
_L!!#)
$
!"#%B"%&
图
*
!
$
!"#%
启动子不同长度截短片段驱动
"%&
基因转化烟草愈伤组织
?@A
染色
3
&
V+
分别为
#,!"
(
#$$&
(
##!*
(
*"
(
&!*
和
%!$B
C
片段&
R
+%.(
4
2(0(5
&
P+
空白对照
Q.
R
+*
!
?@A/J3.0.0
R
7VJ7B3667634.JT30/V7T2;9B
:
"%&
R
;0;809;T
670JT747V
C
T727J;T
$
!"#%X.JP9.VV;T;0J4;0
R
JP9;4;J.70
3(V+#,!"
!
#$$&
!
##!*
!
*"
!
&!*309%!$B
C
VT3
R
2;0J/
!
T;/
C
;6J.U;4
:
&
R
+%.(
4
2(0(5
&
P+_430[670JT74
E$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
%!
讨
!
论
<430J=F>1
分析结果表明!
$
!"#%
启动子含
有
F_>1
(
F>1
(
N_A
(
Y=)T.6PT;
C
;3J
等顺式作用
元件这些元件的非生物逆境应答特性在以往的研
究中已有较多的报道譬如!
F_>1
元件与高盐胁
迫)!!)!%*(干旱胁迫和
F_F
诱导相关)%E*!
F>1
与厌
氧应答相关)%**!
N_A
元件与干旱等多种非生物逆
境胁迫相关)%E!&"*!
Y=)T.6PT;
C
;3J
与防卫和胁迫有
关)&#)&!*!
Y=F);4;2;0J
参与水杨酸反应)&!)&%*等等
在本研究中!根据序列中非生物逆境顺式作用
元件分析结果!将
$
!"#%
启动子截短至
%!$B
C
仍
可保持其驱动活性!还不能说明是否为
$
!"#%
启
动子保持驱动活性的最短片段!而只说明那些与非
生物逆境胁迫应答相关的顺式作用元件只起基因表
达强度的调控作用!而不起开关的决定性作用棉
花胚胎发生后期丰富蛋白基因
C##%
启动子
$b
端截
短实验的结果也表明!保持非生物逆境响应及驱动
活性的最短序列在
#$E
至
$,&B
C
之间)&&*有研究
表明!不同来源的胚胎发生后期丰富蛋白基因启动
子!对非生物逆境的响应及驱动活性不尽相同譬
如!大麦胚胎发生后期丰富蛋白基因启动子
CF5&)
的驱动活性是来自大麦和水稻同源启动子
@7*#)
和
H)(#E
I
的
!
倍!是来自水稻同源启动子
,/.#A
I
的
#,
倍)&$*要明确这些非生物逆境胁迫应答相关
顺式作用元件对基因表达强度的具体调控作用!更
需要对其驱动的基因表达做定量分析本研究的定
量
<=>
分析结果能够从整体上说明这一问题!但截
短去除不同顺式作用元件后的
$
!"#%
启动子片段
驱动
"%&
基因转化烟草愈伤的
?@A
染色!只能定
性地说明各种不同长度的截短片段仍保持其驱动活
性!不能说明驱动活性的定量变化
在模式植物上的研究表明!胚胎发生后期丰富
蛋白基因的启动子可响应多种非生物逆境胁迫的诱
导!驱动抗逆相关基因的表达)&)&,*本研究克隆的
玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因
!"#%
的启动子
$
!"#%
!存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调
控元件!可响应干旱(高盐(低温等多种非生物逆境
胁迫和激素诱导!驱动下游基因的表达进一步研
究验证其作用机理后!可为抗逆转基因玉米研究提
供更多的选择
参考文献!
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!
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R
;3093
R
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邹郁陶!等$玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证
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裂达基部!外面疏被短柔毛&花冠淡紫色!外面疏被贴服短柔毛!内面在上唇被白色柔毛&
花冠筒长约
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! 深裂!下唇与上唇近等长!
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深裂!所有裂片近长圆形!顶端圆形
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秦岭石蝴蝶是由我国著名分类学家王文采教授在
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为陕西省勉县茶店!之后近
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年间的调查中!均未发现其野生居群直到近年!在陕西省第二次野生植物资
源调查和汉中市极小种群野生植物秦岭石蝴蝶(庙台槭资源调查中被重新发现
秦岭石蝴蝶是秦岭地区特有的珍稀濒危野生植物!一般生长于阴湿山谷岩石上!群落上层为落叶阔叶
林!郁闭度比较高由于其野生居群地理分布极为狭窄!个体数量稀少!已经被列入第一批国家二级重点保
护野生植物!具有较高的科研价值
!图文分别由陕西理工学院 王勇$杨培君%略阳县野生动植物保护管理站 李长波和勉县野生动植物保
护管理站 樊荣 提供#
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邹郁陶!等$玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证