全 文 ：第 源员 卷摇 第 员 期
圆园员源 年 圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 员
云藻遭援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 转基因生物新品种培育重大专项渊圆园员猿在载园愿园园员鄄园园圆冤
作者简介院 宋云枝袁女袁员怨远圆年生袁副研究员袁研究方向为植物病毒学袁 耘鄄皂葬蚤造院 躁赠早糟岳 泽凿葬怎援 藻凿怎援 糟灶
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 扎澡糟澡曾岳 泽凿葬怎援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员猿 原 员园 原 员源
水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆尧
原核表达及抗体制备
宋云枝摇 姜雅元摇 毕吕杰摇 温孚江摇 朱常香鄢
渊山东农业大学袁 作物生物学国家重点实验室袁 山东省作物生物学重点实验室袁 泰安 圆苑员园员愿冤
摘要院 为探讨水稻黑条矮缩病毒渊砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽袁砸月杂阅灾冤的种群变异袁采用 砸栽鄄孕悦砸
方法从感染 砸月杂阅灾山东分离物 砸月杂阅灾鄄允晕员 的水稻中克隆该病毒的 杂员园 片段袁并进行序列分析袁进
而构建包含 砸月杂阅灾鄄允晕员 的 悦孕基因的原核表达载体袁导入大肠杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 月蕴圆员渊阅耘猿冤诱
导表达曰并以表达的融合蛋白为抗原袁制备病毒的多克隆抗体遥 结果显示院杂员园 片段全长为 员 愿园员
遭责袁包含 员 个 员 远苑苑 遭责 编码框袁编码 缘缘愿 个氨基酸的外壳蛋白渊悦孕冤曰与 郧藻灶月葬灶噪 已注册的 员怨 个
砸月杂阅灾的 悦孕基因序列相比较发现袁病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为 怨园援 缘豫 耀 怨怨援 愿豫 袁氨
基酸的序列相似性为 怨缘援 怨豫 耀员园园援 园豫 曰地理位置较近的分离物间序列相似性较高袁砸月杂阅灾种群分
布呈现区域性差异遥 原核表达载体 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄悦孕 经 陨孕栽郧 诱导袁获得了分子量约为 远猿 噪阅 带有
匀蚤泽标签的目的蛋白遥 用该蛋白制备的多克隆抗体经 耘蕴陨杂粤尧宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼和 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤检测显
示袁效价为 员颐 愿员 园园园袁且具有良好的特异性遥
关键词院 水稻黑条矮缩病毒曰 外壳蛋白曰 序列分析曰 原核表达曰 多克隆抗体
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻 燥枣 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄
泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 葬灶凿 责则藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤贼泽 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠
杂燥灶早 再怎灶扎澡蚤摇 允蚤葬灶早 再葬赠怎葬灶摇 月蚤 蕴俟躁蚤藻摇 宰藻灶 云怎躁蚤葬灶早摇 在澡怎 悦澡葬灶早曾蚤葬灶早鄢
渊杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 月蚤燥造燥早赠袁 杂澡葬灶凿燥灶早 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 月蚤燥造燥早赠袁
杂澡葬灶凿燥灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 栽葬蚤爷葬灶 圆苑员园员愿袁 杂澡葬灶凿燥灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻 贼澡藻 责燥责怎造葬贼蚤燥灶 增葬则蚤葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 渊砸月杂阅灾冤袁
贼澡藻 枣怎造造 造藻灶早贼澡 糟阅晕粤 燥枣 砸月杂阅灾 杂澡葬灶凿燥灶早 蚤泽燥造葬贼藻 渊砸月杂阅灾鄄允晕员冤 泽藻早皂藻灶贼 员园 渊杂员园冤 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 贼澡藻
增蚤则怎泽鄄蚤灶枣藻糟贼藻凿 则蚤糟藻 泽葬皂责造藻泽 遭赠 砸栽鄄孕悦砸袁 葬灶凿 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻 憎葬泽 葬灶葬造赠扎藻凿援 悦燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻 渊悦孕冤 燥枣
砸月杂阅灾鄄允晕员 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 孕耘栽鄄猿园葬 渊垣冤援 栽澡藻 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶袁
燥遭贼葬蚤灶藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 蚤灶凿怎糟藻凿鄄藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄悦孕袁 憎葬泽 怎泽藻凿
葬泽 葬灶 葬灶贼蚤早藻灶 贼燥 责则藻责葬则藻 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 枣燥则 贼澡藻 增蚤则怎泽援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼
贼澡藻 糟燥皂责造藻贼藻 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 杂员园 憎葬泽 员 愿园员 遭责袁 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 葬 员 远苑苑 遭责 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻 憎澡蚤糟澡
藻灶糟燥凿藻凿 葬 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 缘缘愿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽援 栽澡藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 燥枣 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 葬灶凿 责则藻凿蚤糟贼藻凿 责则燥贼藻蚤灶 憎藻则藻
怨园郾 缘豫 原怨怨援 愿豫 葬灶凿 怨缘援 怨豫 原员园园援 园豫 袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠袁 糟燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻 悦孕 早藻灶藻 燥枣 燥贼澡藻则 员怨 砸月杂阅灾
蚤泽燥造葬贼藻泽 则藻早蚤泽贼藻则藻凿 蚤灶 郧藻灶月葬灶噪援 栽澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 遭藻贼憎藻藻灶 贼澡藻 蚤泽燥造葬贼藻泽 蚤泽 澡蚤早澡藻则 蚤灶 贼澡藻 泽责藻糟蚤藻泽 糟造燥泽藻
蚤灶 早藻燥早则葬责澡蚤糟 责燥泽蚤贼蚤燥灶泽袁 葬灶凿 贼澡藻 责燥责怎造葬贼蚤燥灶 凿蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 砸月杂阅灾 泽澡燥憎藻凿 则藻早蚤燥灶葬造 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻援
粤 远猿 噪阅 贼葬则早藻贼 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡 匀蚤泽鄄贼葬早 憎葬泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿 枣则燥皂 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧援 栽澡藻
葬灶贼蚤遭燥凿赠 憎葬泽 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 耘蕴陨杂粤袁 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 葬灶凿 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤袁 葬灶凿 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼蚤贼藻则
燥枣 贼澡藻 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 憎葬泽 员颐 愿员 园园园 憎蚤贼澡 澡蚤早澡 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 贼燥 砸月杂阅灾援
运藻赠 憎燥则凿泽院 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽曰 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶曰 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰
责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠
摇 摇 水稻黑条矮缩病毒渊砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤鄄
则怎泽袁砸月杂阅灾冤属呼肠孤病毒科 砸藻燥增蚤则蚤凿葬藻斐济病毒属
云蚤躁蚤增蚤则怎泽袁主要经灰飞虱 蕴葬燥凿藻造责澡葬曾 泽贼则蚤葬贼藻造造怎泽 传播袁
可侵染多种禾本科植物袁引起水稻黑条矮缩病尧玉
米粗缩病尧小麦绿矮病等咱员 原 圆暂 遥 感染 砸月杂阅灾的水稻
植株在生长早期比正常植株分蘖多袁并出现明显矮
缩尧叶色浓绿尧叶脉产生白色蜡质短条状突起等症
状曰感病植株即使存活到成熟袁也表现为生长严重
受阻咱猿暂 遥 砸月杂阅灾最早发现于日本袁目前广泛分布于
中国尧日本尧朝鲜等东亚国家和地区袁近年来袁在我
国多个地区严重暴发袁一些地块水稻几乎绝收咱圆袁源暂 遥
砸月杂阅灾的病毒粒子为等径对称球状多面体袁直
径 苑缘 耀 愿缘 灶皂袁其基因组包括 员园 条双链线性 砸晕粤片
段袁按照它们在凝胶上的迁移率由慢到快依次命名
为 杂员 耀 杂员园咱缘 原 远暂 遥 在澡葬灶早 等咱苑暂和 宰葬灶早 等咱愿暂分别以
砸月杂阅灾的水稻和玉米分离物为材料袁测定了 砸月杂鄄
阅灾全基因组序列袁序列分析表明 砸月杂阅灾 基因组全
长约为 猿园 噪遭袁至少含有 员猿 个开放阅读框 渊 燥责藻灶
则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻袁 韵砸云冤袁编码 远 种结构蛋白遥 陨泽燥早葬蚤
等咱怨暂用 砸月杂阅灾 杂员园 编码的多肽制备抗血清与 砸月杂鄄
阅灾 病毒粒子反应袁证明 杂员园 编码病毒衣壳蛋白遥
砸月杂阅灾主要存在于植物韧皮部袁在纯化过程中病毒
粒子的外壳蛋白渊糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶袁悦孕冤和表面突起容易
丢失袁提纯的病毒一般都是多种亚病毒粒子的混合
物袁很难得到大量高纯度的完整病毒粒子咱员园暂 遥 以亚
病毒粒子为抗原制备抗血清不能与病毒外壳蛋白
发生特异反应袁抗血清的效价和特异性均受到影
响袁限制了血清学方法的应用遥 蛋白的原核表达为
病毒抗体的制备提供了另一条有效途径遥 目前袁研
究人员已原核表达了 砸月杂阅灾 的 孕愿 和 孕员园 等蛋白袁
制备了病毒抗体咱员员 原 员圆暂 遥 本研究以 砸月杂阅灾山东分离
物为材料袁克隆其 悦孕 基因袁并进行序列分析袁通过
原核表达袁获得纯化的 悦孕 融合蛋白袁制备了特异性
良好的多克隆抗体袁以期为分析山东稻区 砸月杂阅灾
的种群变异及 砸月杂阅灾的血清学检测提供条件遥
员 材料与方法
员援 员 材料
水稻黑条矮缩病毒山东分离物 砸月杂阅灾鄄允晕员 采
自山东省济宁稻区有明显水稻黑条矮缩病症状的
感病水稻植株曰水稻条纹病毒 渊 砸蚤糟藻 泽贼则蚤责藻 增蚤则怎泽袁
砸杂灾冤尧马铃薯 再 病毒渊孕燥贼葬贼燥 增蚤则怎泽 再袁孕灾再冤尧烟草花
叶病毒渊栽燥遭葬糟糟燥 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁栽酝灾冤和黄瓜花叶病毒
渊悦怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁悦酝灾冤由本实验室繁殖保
存遥 责酝阅员愿鄄栽克隆载体购自 栽葬运葬砸葬 公司曰原核表
达载体 责耘栽猿园葬 渊垣冤尧大肠杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 阅匀缘琢
和 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌株由本实验室保存遥
试验所用限制性内切酶尧栽源 阅晕粤 连接酶购自
栽粤运粤砸粤公司曰运韵阅 云载 高保真酶购自日本 栽韵再韵鄄
月韵公司曰中等分子量标准蛋白 皂葬则噪藻则 圆园栽 购自北
京鼎国公司曰圆噪 责造怎泽 阅晕粤分子量标准和反转录试剂
盒购自北京全式金公司曰羊抗兔 陨早郧尧孕灾阅云 硝酸纤
维素膜尧晕蚤鄄粤早葬则燥泽藻 匀蚤泽 标签蛋白纯化试剂盒尧植物
蛋白抽提试剂盒尧月悦粤 蛋白定量试剂盒尧化学发光
底物检测试剂盒尧广谱蛋白 皂葬则噪藻则 和广谱彩虹预染
蛋白 皂葬则噪藻则购自北京康为公司曰琼脂糖凝胶回收试
剂盒尧质粒提取试剂盒购自美国 月蚤燥皂蚤早葬 公司曰其余
试剂均为国产分析纯遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 引物设计及 砸月杂阅灾 杂员园 序列的克隆
根据 郧藻灶月葬灶噪 中已报道的 砸月杂阅灾 杂员园 序列设
计并合成 圆 条引物袁缘忆端引物 砸月杂阅灾 杂员园鄄缘院缘忆鄄
粤粤郧栽栽栽栽栽栽栽悦悦栽悦粤悦悦悦粤栽粤粤栽郧鄄猿忆曰 猿忆 端 引 物
砸月杂阅灾 杂员园鄄猿院缘忆鄄郧粤悦粤粤栽粤郧悦栽郧粤粤栽栽栽悦悦悦悦悦栽鄄猿忆遥
引物由北京赛百盛生物基因技术有限公司合成遥
以感染 砸月杂阅灾鄄允晕员 的水稻叶片为材料袁用
栽则蚤扎燥造法提取总 砸晕粤袁反转录得到 砸月杂阅灾 杂员园 的第
员 条 糟阅晕粤 链袁再以所得 糟阅晕粤 为模板进行高保真
孕悦砸扩增遥 孕悦砸反应条件院怨源 益预变性 圆 皂蚤灶曰怨愿 益
变性 员园 泽袁远圆 益退火 猿园 泽袁远愿 益延伸 圆 皂蚤灶袁猿缘 个循
环遥 扩增所得到的产物经 员豫琼脂糖凝胶电泳后袁
回收 阅晕粤片段袁连接 责酝阅员愿鄄栽 克隆载体袁转化大肠
杆菌 阅匀缘琢感受态细胞遥 提取重组质粒袁进行 孕悦砸
和酶切验证袁阳性质粒送英杰公司测序袁并用 阅晕粤鄄
酝粤晕 苑援 园 等软件比较 砸月杂阅灾 各分离物间的序列相
似性遥
员援 圆援 圆 原核表达载体的构建
根据克隆的 砸月杂阅灾鄄允晕员 杂员园 序列袁设计包含
远猿 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
悦孕基因完整阅读框和相应限制性内切酶位点的 缘忆
端和 猿忆端引物遥 缘忆端引物 砸月杂阅灾悦孕鄄月缘院缘忆鄄郧悦郧悦郧鄄
郧粤栽悦悦粤栽郧郧悦栽郧粤悦粤栽粤粤郧粤悦栽悦鄄猿忆曰猿忆端引物 砸月杂鄄
阅灾悦孕鄄载猿院缘忆鄄郧悦郧悦悦栽悦郧粤郧栽悦粤栽悦栽栽郧栽悦粤悦栽栽栽郧栽鄄
栽栽粤鄄猿忆遥 两条引物序列下划线处分别表示 月葬皂匀玉
和 载澡燥玉限制性酶切位点遥 以 砸月杂阅灾鄄允晕员 杂员园 序
列为模板袁孕悦砸扩增 悦孕 基因曰扩增产物经 月葬皂匀玉
和 载澡燥玉酶切后电泳回收袁连接于原核表达载体
责耘栽猿园葬 渊垣冤遥 鉴定为重组的质粒袁命名为 责耘栽鄄砸月杂鄄
阅灾鄄悦孕袁并采用热激法咱员猿暂转入大肠杆菌 月蕴圆员渊阅耘猿冤
感受态细胞遥
图 员 基于 砸月杂阅灾 悦孕基因的核苷酸序列渊葬冤和氨基酸序列渊遭冤构建的系统进化树
云蚤早援 员 栽澡藻 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻 燥枣 砸月杂阅灾 蚤泽燥造葬贼藻泽 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 灶怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿 渊葬冤 葬灶凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 渊遭冤 燥枣 悦孕 早藻灶藻泽
员援 圆援 猿 砸月杂阅灾 悦孕基因原核表达与检测
将含有 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄允晕员 的 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌液接
种到 蕴月 培养基中袁猿苑 益振荡培养至菌液 韵阅远园园为园郾 源 耀 员援 园曰加入终浓度为 园援 远 皂皂燥造 辕 蕴的 陨孕栽郧袁员远 益
诱导表达 源 澡曰利用 杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳检测 砸月杂阅灾 悦孕
基因的表达情况咱员猿暂 遥
员援 圆援 源 砸月杂阅灾 悦孕多克隆抗体的制备
离心收集诱导后的菌液袁用 员 伊 孕月杂 重悬袁超声
破碎袁分别收集上清与沉淀遥 参照 晕蚤鄄粤早葬则燥泽藻 匀蚤泽标
签蛋白纯化试剂盒和 月悦粤 蛋白定量试剂盒说明书
对上清进行蛋白纯化和定量遥
将 远园园 滋早的抗原和完全弗氏佐剂等体积混匀
充分乳化袁对雄性家兔进行背部脊柱两侧 源 点皮下
注射免疫遥 第 圆 次免疫在第 圆员 天袁用抗原溶液加等
体积弗氏不完全佐剂乳化后进行皮下多点注射免疫袁
免疫剂量为 源园园 滋早遥 此后袁每隔 员源 凿进行第 猿次和第
源次免疫袁免疫剂量为 源园园 滋早遥 第 源 次免疫后 员园 凿袁
每只兔子耳缘静脉取血 园援 缘 耀 员 皂蕴袁分离抗血清遥 采
用间接 耘蕴陨杂粤测定血清的效价咱员源暂 袁利用 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼
和 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤进行抗体特异性分析咱员圆袁员源暂 遥
圆 结果与分析
圆援 员 砸月杂阅灾 杂员园 序列的克隆及分析
将 砸栽鄄孕悦砸 扩增得到的 砸月杂阅灾 杂员园 序列克隆
于 责酝阅员愿鄄栽袁重组质粒测序结果显示袁砸月杂阅灾鄄晕员
杂员园 全长为 员 愿园员 遭责袁编码框为 员 远苑苑 遭责袁编码 缘缘愿 个
氨基酸的外壳蛋白遥 测序结果提交 郧藻灶月葬灶噪袁登录
号为 运悦员远远远怨苑遥 将获得的 砸月杂阅灾鄄允晕员 的 悦孕 基因
序列与 郧藻灶月葬灶噪 中注册的 员怨 个标明采集区域的
砸月杂阅灾 悦孕基因序列相比较袁发现各分离物间核苷
酸序列的相似性为 怨园援 缘豫 耀 怨怨援 愿豫 袁氨基酸的序列
相似性为 怨缘援 怨豫 耀 员园园援 园豫 遥 山东水稻分离物
渊运悦员远远远怨苑冤与 圆 个山东玉米分离物渊匀酝圆园怨园苑苑 和
匀酝员愿愿缘圆远冤尧员 个江苏玉米分离物渊匀酝员愿愿源怨员冤和 员
个浙江水稻分离物渊粤再园缘园源愿怨冤具有更近的亲缘关
系袁核苷酸序列相似性为 怨怨援 猿豫 耀 怨怨援 愿豫 袁氨基酸
的序列相似性为 怨怨援 缘豫 耀 员园园援 园豫 曰与云南玉米分
苑猿员 期 宋云枝等院水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆尧原核表达及抗体制备
离物渊匀匝猿怨源圆员园冤和日本水稻分离物渊阅园园远园远冤的亲
缘关系较远袁核苷酸的序列相似性分别为 怨员援 源豫和
怨缘援 缘豫 袁氨基酸的序列相似性分别为 怨苑援 愿豫 和
怨苑郾 猿豫 遥 基于核苷酸序列构建的系统进化树袁将 圆园
个分离物分成 圆 组袁云南玉米分离物渊匀匝猿怨源圆员园冤独
立一组曰而基于氨基酸序列构建的系统进化树袁则
将 圆园 个分离物分成 猿 组袁云南玉米分离物和日本水
稻分离物各成一组渊图 员冤遥 表明 砸月杂阅灾 病毒种群
分布主要表现为区域性差异袁寄主间的差异不明显遥
圆援 圆 重组蛋白原核表达尧纯化及 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测
将扩增得到的 砸月杂阅灾鄄允晕员 悦孕基因克隆于原核
表达载体 责耘栽猿园葬 渊垣冤中袁通过测序和 阅晕粤酝粤晕 苑援 园
等软件进行序列比对分析袁显示基因编码框正确遥
含重组表达载体 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄悦孕 的大肠杆菌 月蕴圆员
渊阅耘猿冤经 陨孕栽郧 分别诱导 圆尧源尧远 澡 后袁进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘电泳袁经诱导的重组载体均在约 远猿 噪阅 处出
现明显的表达条带袁与预期蛋白大小一致曰随着诱
导时间延长袁蛋白表达量没有明显变化曰而未诱导
的空载体尧诱导的空载体和未诱导的重组载体菌液
未出现目标条带渊图 圆冤遥 将目的条带切胶进行电洗
脱尧超滤浓缩后袁测定蛋白浓度约为 员援 源 皂早 辕 皂蕴袁纯
度大于 愿缘豫 袁达到制备多克隆抗体的要求遥
图 圆 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄允晕员 表达蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析
云蚤早援 圆 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄允晕员 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
摇 摇 葬院不同浓度 陨孕栽郧诱导 责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄允晕员表达蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析院 员院未经 陨孕栽郧诱导的空载体曰圆院经 陨孕栽郧诱导的空载体曰猿院未经
陨孕栽郧诱导的重组载体曰源 耀 远院分别为 陨孕栽郧诱导 圆尧源尧远 澡的重组载体曰酝院中等分子量标准蛋白 皂葬则噪藻则 圆园栽曰箭头表示重组蛋白遥 遭院纯化
的重组蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析院 员院员援 圆 皂早 辕 皂蕴牛血清白蛋白标准品曰圆院纯化的重组蛋白曰酝院广谱蛋白 皂葬则噪藻则遥 葬院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣
责耘栽鄄砸月杂阅灾鄄允晕员 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶泽 燥枣 陨孕栽郧院 员院 藻皂责贼赠 增藻糟贼燥则 灶燥贼 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧曰 圆院 藻皂责贼赠 增藻糟贼燥则 蚤灶鄄
凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧曰 猿院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 灶燥贼 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧曰 源 原 远院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧 枣燥则 圆袁 源袁 远 澡曰 酝院 皂藻凿蚤怎皂 皂燥造藻糟怎鄄
造葬则 憎藻蚤早澡贼 责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则 栽圆园曰 葬则则燥憎 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶泽援 遭院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 责怎则蚤枣蚤藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶院 员院 员郾 圆 皂早 辕 皂蕴
葬造遭怎皂蚤灶 遭燥增蚤灶藻曰 圆院 责怎则蚤枣蚤藻凿 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责则燥贼藻蚤灶曰 酝院 遭则燥葬凿鄄则葬灶早藻 责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则援
圆援 猿 多克隆抗体的制备和特异性检测
以免疫前血清背景作为对照袁按比例稀释抗血
清进行间接 耘蕴陨杂粤 检测遥 抗血清稀释至 员 颐 愿员 园园园
时吸光值为 园援 员愿缘袁为阴性对照的 圆援 员 倍袁因此确定
员颐 愿员 园园园 是制备抗血清的最大稀释倍数袁即抗血清
效价为 员颐 愿员 园园园遥
用 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼方法检测抗血清与有效目的蛋
白的特异结合袁多抗血清能与感染 砸月杂阅灾 的水稻
样品提取液中的病毒外壳蛋白发生特异反应袁而健
康水稻样品无反应渊图 猿冤遥 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤 检测显
示袁多抗血清只能与感染 砸月杂阅灾 水稻汁液反应袁产
生特异性斑点袁而与 砸杂灾尧孕灾再尧栽酝灾尧悦酝灾和健康
图 猿 多克隆抗体的宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼分析
云蚤早援 猿 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠
摇 摇 悦运院健康水稻样品曰员尧圆院感染 砸月杂阅灾的水稻样品曰酝院广谱
彩虹预染蛋白 皂葬则噪藻则遥 悦运院 匀藻葬造贼澡赠 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽曰 员袁 圆院 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽
蚤灶枣藻糟贼藻凿 遭赠 砸月杂阅灾曰 酝院 皂怎造贼蚤糟燥造燥则 责则燥贼藻蚤灶 皂葬则噪藻则援
愿猿 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
图 源 多克隆抗体的 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤分析
云蚤早援 源 阅燥贼鄄遭造燥贼 耘蕴陨杂粤 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠
摇 摇 悦运院健康水稻样品曰砸月杂阅灾尧砸杂灾院感染 砸月杂阅灾尧砸杂灾的水稻样品曰孕灾再尧栽酝灾尧悦酝灾院感染 孕灾再尧栽酝灾尧悦酝灾的烟草样品遥 悦运院 匀藻葬造贼澡赠
则蚤糟藻 责造葬灶贼泽曰 砸月杂阅灾袁 砸阅灾院 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽 蚤灶枣藻糟贼藻凿 遭赠 砸月杂阅灾袁 砸杂灾曰 孕灾再袁 栽酝灾袁 悦酝灾院 贼燥遭葬糟糟燥 责造葬灶贼泽 蚤灶枣藻糟贼藻凿 遭赠 孕灾再袁 栽酝灾袁 悦酝灾援
水稻汁液没有任何反应斑点渊图 源冤遥 进一步采集了
济宁大田明显表现矮缩症状的 员园 个水稻样品进行
耘蕴陨杂粤检测袁同时提取 员园 个样品的 砸晕粤袁用 砸栽鄄
孕悦砸的方法扩增 砸月杂阅灾 悦孕基因遥 耘蕴陨杂粤检测为阳
性的样品 孕悦砸 均可扩增出目的条带遥 表明制备的
多克隆抗体具有良好的特异性袁适用于田间 砸月杂阅灾
的检测遥
猿 讨论
砸月杂阅灾是水稻上危害最为严重的病毒病害之
一袁对该病毒的研究已受到国内外的广泛重视咱员园暂 遥
砸月杂阅灾的基因组包括 员园 个组分袁其中 杂员园 片段编
码病毒的外壳蛋白为研究的重点遥 在澡葬灶早 等咱苑暂 尧
宰葬灶早等咱愿暂 尧张恒木等咱员缘暂 尧王朝辉等咱员远暂克隆 砸月杂阅灾
的 杂员园 片段袁并进行序列分析曰白逢伟等咱员苑暂 尧欧阳元
龙等咱员圆暂原核表达 砸月杂阅灾 的外壳蛋白基因袁制备病
毒抗体遥 本研究克隆 砸月杂阅灾 山东分离物的 杂员园 片
段袁并进行序列分析曰原核表达病毒 悦孕 基因袁制备
病毒的抗体遥 基因的克隆丰富了基因资源库袁为进
一步研究山东稻区 砸月杂阅灾 的种群动态积累了资
料曰抗体的制备为病毒的检测尧介体带毒率测定和
病害的流行及预测预报打下了基础遥
砸月杂阅灾鄄允晕员 与 郧藻灶月葬灶噪 中已注册的来自于不
同国家和地区的 砸月杂阅灾 分离物的 悦孕 基因序列比
较发现袁地理位置较近的分离物间序列相似性较
高袁地理位置较远的分离物间序列相似性较低遥 张
恒木等咱员缘暂 尧白逢伟等咱员苑暂的研究结果与此类似遥 说
明 砸月杂阅灾 种群分布存在区域性特征袁这可能与
砸月杂阅灾的传播方式有关遥 研究发现袁砸月杂阅灾 主要
由灰飞虱在稻麦等作物寄主和杂草寄主间以持久
性的方式进行循环传播咱员愿暂 袁并通过灰飞虱随气流远
距离传播咱员怨暂 遥
外源蛋白在大肠杆菌原核系统中的表达受多
个因素影响袁包括外源蛋白 员 级结构尧皂砸晕粤 稳定
性尧蛋白表达定位尧培养条件等咱圆园暂 袁其中蛋白质 员 级
结构对目的蛋白的表达至关重要咱圆员暂 遥 由于不同物
种的基因表达过程中袁对编码同一氨基酸的不同密
码子的使用具有偏爱性袁如果要表达的外源蛋白序
列中含有大量稀有密码子袁则会影响外源蛋白表
达咱圆圆暂 遥 另外袁稀有密码子的位置对外源蛋白表达也
有一定影响遥 如果外源蛋白序列中 晕郧郧 密码子
渊悦郧郧尧粤郧郧尧哉郧郧尧郧郧郧冤位于起始密码子的 垣 圆 到
垣 缘 位袁会显著降低外源蛋白的表达咱圆猿暂 遥 本研究克
隆的 砸月杂阅灾鄄允晕员 悦孕基因序列含有 源缘 个稀有密码
子渊粤哉粤尧粤郧郧尧粤郧粤尧粤悦郧尧悦悦悦尧悦哉粤尧悦悦悦尧郧郧粤冤袁
所占比例较低袁仅为 苑援 远缘豫 袁且起始密码子的 垣 圆 到
垣 缘 位不含有 晕郧郧 密码子袁这可能是 砸月杂阅灾鄄允晕员
的 悦孕基因能够在 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌株中较好地表达的
一个重要基础遥
制备病毒抗体首先需要制备大量高纯度的抗
原袁通常是以纯化的病毒粒子为抗原袁但由于
砸月杂阅灾在寄主中含量低袁且在纯化过程中不稳定袁
提纯的产物是多种亚病毒粒子的混合物袁很难得到
大量高纯度的完整病毒粒子遥 通过原核表达病毒
某一蛋白作为抗原制备抗体袁则表现出其特有的优
势遥 欧阳元龙等咱员圆暂原核表达了 砸月杂阅灾 浙江分离物
的外壳蛋白基因袁制备的病毒抗体效价达到 员 颐 缘园园
园园园遥 本研究原核表达了水稻黑条矮缩病毒山东分
离物的 悦孕基因袁制备了 砸月杂阅灾 多克隆抗体袁效价
达到员颐 愿员 园园园遥 在抗体的特异性检测中袁宰藻泽贼藻则灶
遭造燥贼结果显示健康水稻样品未出现任何杂交信号袁
感染 砸月杂阅灾水稻样品出现 圆 条杂交带袁而 阅燥贼鄄遭造燥贼
耘蕴陨杂粤检测显示抗体只能与 砸月杂阅灾发生反应袁说明
抗体具有良好的特异性袁宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼 中出现的 缘员
噪阅 的杂交带袁可能是由于 砸月杂阅灾 的 悦孕 降解所
致咱怨暂 遥 这些结果验证了该方法的可行性和高效性遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 月葬蚤 云 宰袁 再葬灶 允袁 匝怎 在 悦袁 藻贼 葬造援 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻增藻葬造泽
贼澡葬贼 葬 凿憎葬则枣蚤灶早 凿蚤泽藻葬泽藻 燥灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟藻则藻葬造 糟则燥责泽 蚤灶 悦澡蚤灶葬 蚤泽 凿怎藻
贼燥 则蚤糟藻 遭造葬糟噪 泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 渊 砸月杂阅灾冤援 灾蚤则怎泽 郧藻灶藻泽袁
圆园园圆袁 圆缘渊圆冤院 圆园员 原 圆园远
咱圆暂 陈声祥袁 张巧艳援 我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究
进展援 植物保护学报袁 圆园园缘袁 猿圆渊员冤院 怨愿 原 员园猿
怨猿员 期 宋云枝等院水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆尧原核表达及抗体制备
咱猿暂 蕴蚤灶早 运 悦援 砸蚤糟藻 增蚤则怎泽 凿蚤泽藻葬泽藻泽援 孕澡蚤造蚤责责蚤灶藻泽院 陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 砸蚤糟藻
砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁 员怨苑圆
咱源暂 龙梦玲援 我国水稻黑条矮缩病及其防治研究进展援 广西植
保袁 圆园员员袁 圆源渊员冤院 猿园 原 猿圆
咱缘暂 粤扎怎澡葬贼葬 云袁 哉赠藻凿葬 陨袁 运蚤皂怎则葬 陨袁 藻贼 葬造援 悦造燥泽藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 遭藻贼憎藻藻灶
早藻灶燥皂藻 泽贼则怎糟贼怎则藻泽 燥枣 则蚤糟藻 遭造葬糟噪 泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 葬灶凿 皂葬蚤扎藻 则燥怎早澡
凿憎葬则枣 增蚤则怎泽藻泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 灾蚤则燥造燥早赠袁 员怨怨猿袁 苑源 渊苑 冤院
员圆圆苑 原 员圆猿圆
咱远暂 杂澡蚤噪葬贼葬 耘袁 运蚤贼葬早葬憎葬 再援 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽院 蚤贼泽
责则燥责藻则贼蚤藻泽袁 皂燥则责澡燥造燥早赠 葬灶凿 蚤灶贼则葬糟藻造造怎造葬则 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶援 灾蚤则燥造燥早赠袁
员怨苑苑袁 苑苑渊圆冤院 愿圆远 原 愿源圆
咱苑暂 在澡葬灶早 匀 酝袁 悦澡藻灶 允 孕袁 粤凿葬皂泽 酝 允援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
燥枣 泽藻早皂藻灶贼泽 员 贼燥 远 燥枣 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪 泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 枣则燥皂 悦澡蚤灶葬
责则燥增蚤凿藻泽 贼澡藻 糟燥皂责造藻贼藻 早藻灶燥皂藻援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁 圆园园员袁
员源远渊员圆冤 院 圆猿猿员 原 圆猿猿怨
咱愿暂 宰葬灶早 在 匀袁 云葬灶早 杂 郧袁 载怎 允 蕴袁 藻贼 葬造援 杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻
糟燥皂责造藻贼藻 早藻灶燥皂藻 燥枣 砸蚤糟藻 遭造葬糟噪 泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂
皂葬蚤扎藻 憎蚤贼澡 则燥怎早澡 凿憎葬则枣 凿蚤泽藻葬泽藻援 灾蚤则怎泽 郧藻灶藻泽袁 圆园园猿袁 圆苑渊圆冤 院
员远猿 原 员远愿
咱怨暂 陨泽燥早葬蚤 酝袁 哉赠藻凿葬 陨袁 蕴藻藻 月 悦援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 葬泽泽蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 责则燥鄄
贼藻蚤灶泽 藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 则蚤糟藻 遭造葬糟噪 泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 枣蚤躁蚤增蚤则怎泽 杂苑袁 杂愿袁 杂怨
葬灶凿 杂员园援 允燥怎则灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 灾蚤则燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 苑怨 渊 远 冤院
员源愿苑 原 员源怨源
咱员园暂 邓金奇袁 戴良英援 水稻黑条矮缩病毒的研究进展援 中国农
学通报袁 圆园员圆袁 圆愿渊员愿冤院 圆园怨 原 圆员圆
咱员员暂 羊健袁 张恒木袁 陈剑平袁 等援 水稻黑条矮缩病毒 责愿蛋白的
原核表达尧抗血清制备及其特性援 植物保护学报袁 圆园园苑袁 猿源
渊猿冤院 圆缘圆 原 圆缘远
咱员圆暂 欧阳元龙袁 吴建祥袁 熊如意袁 等援 水稻黑条矮缩病病毒外
壳蛋白基因 杂员园的原核表达尧多克隆抗体制备及应用援 中
国水稻科学袁 圆园员园袁 圆源渊员冤院 圆缘 原 猿园
咱员猿暂 萨姆布鲁克 允袁 费里奇 耘 云袁 曼尼阿蒂斯 栽援 渊黄培堂等
译冤援 分子克隆实验指南渊猿版冤援 北京院 科学出版社袁 圆园园圆
咱员源暂 宰怎 允 载袁 再怎 蕴袁 蕴蚤 蕴袁 藻贼 葬造援 韵则葬造 蚤皂皂怎灶蚤扎葬贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟
则蚤糟藻 泽藻藻凿泽 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 灾孕圆 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 蚤灶枣藻糟贼蚤燥怎泽 遭怎则泽葬造 凿蚤泽藻葬泽藻
增蚤则怎泽 蚤灶凿怎糟藻泽 责则燥贼藻糟贼蚤增藻 蚤皂皂怎灶藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 蚤灶 糟澡蚤糟噪藻灶泽援 孕造葬灶贼
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 允燥怎则灶葬造袁 圆园园苑袁 缘渊缘冤院 缘苑园 原 缘苑愿
咱员缘暂 张恒木袁 陈剑平袁 薛庆中袁 等援 水稻黑条矮缩病毒基因组
片段 杂员园 的 糟阅晕粤 克隆及全序列分析援 中国水稻科学袁
圆园园圆袁 员远渊员冤院 圆源 原 圆愿
咱员远暂 王朝辉袁周益军袁范永坚袁等援 江苏水稻黑条矮缩病毒 杂员园
的 糟阅晕粤 克隆序列分析援 中国病毒学袁 圆园园圆袁 员苑 渊圆冤院
员源圆 原 员源源
咱员苑暂 白逢伟袁 曲志才袁 曹清玉袁 等援 水稻黑条矮缩病毒基因组
组分 员园编码的外壳蛋白基因的克隆及表达援 复旦学报袁
圆园园圆袁 源员渊圆冤院 圆员苑 原 圆圆员
咱员愿暂 云葬灶早 杂袁 再怎 允袁 云藻灶早 允袁 藻贼 葬造援 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 则蚤糟藻 遭造葬糟噪
泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣 枣蚤躁蚤增蚤则怎泽 蚤灶 皂葬蚤扎藻 憎蚤贼澡 则燥怎早澡 凿憎葬则枣 凿蚤泽藻葬泽藻 蚤灶
悦澡蚤灶葬援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁 圆园园员袁 员源远渊员冤院 员远苑 原 员苑园
咱员怨暂 张海燕袁 刁永刚袁 杨海博袁 等援 山东济宁灰飞虱春季种群
动态及迁飞特性援 应用昆虫学报袁 圆园员员袁 源愿渊缘冤院 员圆怨愿 原员猿园愿
咱圆园暂 任增亮袁 堵国成袁 陈坚袁 等援 大肠杆菌高效表达重组蛋白
策略援 中国生物工程杂志袁 圆园园苑袁 圆苑渊怨冤院 员园猿 原 员园怨
咱圆员暂 陈明杰袁 高明明袁 姚文兵袁 等援 大肠杆菌非偏爱密码子的
数量及位置对外源蛋白表达量的影响援 中国医药大学学
报袁 圆园园愿袁 猿怨渊远冤院 缘缘猿 原 缘缘远
咱圆圆暂 郧怎泽贼葬枣泽泽燥灶 悦袁 郧燥增蚤灶凿葬则葬躁葬灶 杂袁 酝蚤灶泽澡怎造造 允援 悦燥凿燥灶 遭蚤葬泽 葬灶凿
澡藻贼藻则燥造燥早燥怎泽 责则燥贼藻蚤灶 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶援 栽则藻灶凿泽 蚤灶 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁
圆园园源袁 圆圆渊苑冤院 猿源远 原 猿缘猿
咱圆猿暂 凿藻 灾葬造凿蚤增蚤葬 耘 陨 郧袁 陨泽葬噪泽泽燥灶 蕴 粤援 粤 糟燥凿燥灶 憎蚤灶凿燥憎 蚤灶 皂砸晕粤
凿燥憎灶泽贼则藻葬皂 燥枣 贼澡藻 蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤燥灶 糟燥凿燥灶 憎澡藻则藻 晕郧郧 糟燥凿燥灶泽 早蚤增藻
泽贼则燥灶早造赠 则藻凿怎糟藻凿 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤援 晕怎糟造藻蚤糟
粤糟蚤凿泽 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园园源袁 猿圆渊员苑冤院 缘员怨愿 原 缘圆园缘
渊责任编辑院吴竟一冤
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